Name: 공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 GPCR 융합 단백질의 내재화를 공 초점 현미경으로 검출하는 방법을. HEK293 세포를 이용하여 수용체 역학을 연구하고 세포 신호 전달 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 논문의 저자는 기술 지원 및 장비 사용에 대해 Jiayan Xie 교수에게 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 41406137)의 재정 지원을 받았다.

1. 셀 제조 <ol><li> 세포 복구 <ol><li> 37 ° C의 물을 욕조에 액체 질소 탱크로부터 동결 보존 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포를 옮기고 1 연속 진탕 - 2 분. </li><li> 10 cm 세포 배양 접시에 평형화 성장 배지 10 ㎖ (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 용액)을 추가한다. 부드럽게 평형 성장 매체에 해동 세포를 추가합니다. </li><li> 4 시간 - 2 95 %의 공기와 5 % CO2를 함유하는 가습 분위기 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 세포를 인큐베이션. </li><li> 후 2 - 4 시간 동안 세포가 부착 된 것을 확인한다. 48 시간 - 또 다른 24의 평형 성장 매체와 문화를 교체합니다. 참고 :이 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 제거하고 세포 손상을 방지하기 때문에 평형 성장 매체를 변경하면 유용합니다. </li></ol></li><li> &lt;강한&gt; 셀 통로 <ol><li> 24 일 후 - 세포가 합류에 가까운 성장을 48 시간, 평형화 성장 배지를 폐기하고 인산 완충 식염수 2 ㎖ (PBS)으로 세포를 세척 하였다. 부드럽게 접시를 소용돌이. </li><li> PBS를 폐기하고 트립신 EDTA 1 ㎖ (식염수, 0.25 % 트립신 및 0.02 % EDTA)를 추가한다. 완전히 세포를 소화하기 위해 접시를 조심스럽게 소용돌이와 트립신 - EDTA 솔루션을 대기음. 3 분 동안 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 접시를 넣어. 참고 :이 기간 동안, 세 개의 새로운 10 cm 세포 배양 접시를 준비하고 각 평형 성장 매체의 10 mL를 넣어. </li><li> 세포가 접시의 바닥에서 해제 한 경우 광학 현미경을 사용하여 결정합니다. 접시에 평형 성장 매체의 2 ML을 추가합니다. 피펫 팅하여 혼합하고 즉시 새로운 접시의 각 세포 현탁액을 0.6 ㎖의 피펫. 부드럽게 피펫 팅하여 혼합하고, 세포를 37 ℃, 5 % CO 2에서 배양 할 수있다. </li></ol></lI&gt; </ol> 2. 셀 시드 <ol><li> 24 일 후 - 계대 세포가 합류에 가까운 성장을 48 시간, 평형화 성장 배지를 버리고 PBS 2 ml로 세포를 세척한다. 부드럽게 접시를 소용돌이. </li><li> PBS를 폐기하고 트립신 EDTA 1 ㎖를 추가한다. 완전히 세포를 소화하기 위해 접시를 조심스럽게 소용돌이와 트립신 - EDTA를 대기음. 3 분 동안 37 ° C의 물 재킷 CO 2 인큐베이터에서 접시를 넣어. 주 :이 기간 동안, 각각의 웰에 평형화 성장 배지 2ml를 첨가하여 6 웰 플레이트를 준비한다. </li><li> 현미경 관찰 하에서 세포 접시 바닥으로부터 상승하는 한 경우 접시 평형화 성장 배지 1 ㎖를 추가한다. 피펫 팅하여 혼합하고 즉시 제조 6- 웰 플레이트 (평형화 성장 배지 2 mL를 셀리스 6 웰 플레이트)의 각 웰에 세포 현탁액 0.1 ㎖ (양의 세포 성장 밀도에 따라 조정)을 피펫. 부드럽게 세포를 피펫으로 혼합 허용37 ° C에서 배양하고, 5 % CO 2. </li></ol> 3. 세포 형질 <ol><li> 리포좀 제제로 형질 감염 방법 (1) 참고 : 형질 전환 시약 1 재료의 표를 참조하십시오. <ol><li> 95 % 합류 - 다음 날, 세포는 85해야합니다 있는지 확인하십시오. </li><li> 무균 마이크로 원심 튜브에 플라스미드 DNA (500 NG / μL) 및 감소 된 혈청 배지 100 μL 3㎍을 추가하고 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 시약 1 및 다른 마이크로 원심 튜브 환원 혈청 배지 100 μL 9 μL를 준비하고 부드럽게 혼합한다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 희석 시약 1 (전체 부피 = 215 μL)로 희석하고 혼합물을 플라스미드 수확기. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 대기음 세포 배양 접시 오프 매체, 및 FBS없이를 1.5 ml의 신선한 DMEM을 추가한다. </li><li> DNA-TRANSF의 215 μL를 추가ection 시약을 각 웰에 적하 혼합하고, 플레이트를 선회하여 부드럽게 혼합한다. </li><li> 8 시간 - 4 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고, 5 %. 10 % FBS와 신선한 DMEM로 교체하십시오. </li><li> 모든 실험을 실행하기 전에 48 시간 - 24 다른 CO 2, 37 ℃에서 세포를 인큐베이션하고, 5 %. </li></ol></li><li> 리포좀 제제로 형질 감염 방법 2 참고 : 형질 전환 시약 2 재료의 표를 참조하십시오. <ol><li> 무균 마이크로 원심 튜브에 플라스미드 DNA 2 μg의 (500 NG / μL), 시약 2 4 μL, 100 μL의 혈청 감소 배지를 추가한다. 부드럽게 혼합하고, 실온에서 15 분 동안 배양한다. </li><li> 적가 방식으로 세포에 형질 전환 혼합물을 추가한다. </li><li> 모든 실험을 실행하기 전에, 37 ℃에서 48 시간 및 5 % CO 2 - 형질 감염 후 24 세포를 배양한다. </li></ol></li></ol> 커버 전표 4. 세포 배양 <ol><li> 레배양 6 웰 플레이트에서 성장 배지를 이동. </li><li> 칼슘 및 마그네슘없이 PBS 1 ㎖로 세포 단층을 세척한다. </li><li> 0.5 mL의 트립신 EDTA를 추가한다. 신중하게 접시를 소용돌이 및 트립신 - EDTA를 대기음. 37 ℃에서 3 분, 5 % CO 2의 배양 플레이트를 인큐베이션. 실제의 배양 시간은 사용되는 세포주에 따라 달라진다. 주 :이 기간 동안 새로운 12 웰 플레이트를 준비하여 멸균 커버 슬립 각 웰에 직경 15mm의 추가. 리신, 라미닌, 콜라겐으로 코팅 된 커버 슬립은 쉽게 분리 HEK293 세포에 대한 세포 부착을 향상시킬 수있다. </li><li> 세포가 분리 될 때, 각 웰에 1 개 ㎖의 사전 - 가온 완전 성장 배지를 추가한다. 피펫 팅하여 혼합하고 바로 슬립 커버로 12- 웰 플레이트에 세포를 필요한 수를 옮긴다. 한 ML에 총 볼륨을 조정하기 위해 각 웰에 신선한 전체 성장 매체를 추가 </li><li> 37 ° C에서 24 시간 및 5 % CO 2 - 16 세포를 인큐베이션. 참고 : 30 후 -60 분은, 세포의 대부분은 멸균 커버 슬립에 부착 한 것이다. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 감지 <ol><li> 셀룰러 현지화 <ol><li> 16 일 후 - 세포를 12 웰 플레이트에서 멸균 커버 슬립에 가까운 합류로 성장 24 시간, 5 μM의 최종 농도를 제공하는, 각 웰에, 멤브레인 프로브 DII를 추가한다. 세포는 37 ° C에서 30 분, 5 % CO 2 동안 배양 할 수있다. </li><li> 30 분 후, 평형화 성장 배지를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻어 (2 - 11 °의 C). </li><li> 각 웰 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 조심스럽게 15 분 동안 교반한다. 주의 : 파라 포름 알데히드는 피부 접촉이나 흡입 중간 독성이며, 가능성이 발암 물질로 지정. 화학은 파라 포름 알데히드의 무게 및 취급 중에 표기 후드 배기 밸런스 격납 등의 보호 대책을 연기. &lt;/ 리&gt; <li> PBS 두 번 고정 된 세포를 씻으십시오. μL DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 -) 용액 (0.5 ㎍ / mL)을 각 웰 200-300 추가하고, 실온에서 10 분 동안 배양한다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 판에서 커버 전표를 제거하고 여분의 PBS를 심지. 장착 매체 (50 % V / V 글리세롤 / 물) 한 방울 로케이션 현미경 슬라이드 상 전환. 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거합니다. </li></ol></li><li> 휴대 내면화 <ol><li> 16 일 후 - 세포를 12 웰 플레이트에서 멸균 커버 슬립에 가까운 합류로 성장 24 시간, 평형화 성장 배지를 제거하고 신선한 추가 DMEM 배지 (37 ° C)를 가온. 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO 2 세포를 인큐베이션. </li><li> 30 분 동안 (0, 10-12, 10-9 및 10-6 M) 서로 다른 농도로 리간드를 세포를 처리하고, 다른 시간 10 -6 M의 리간드 (0 그들을 취급10, 30 및 60 분). </li><li> (- 8 °의 C 2) 차가운 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 웰 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 고정한다. 조심스럽게 15 분 동안 교반한다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 조심스럽게 판에서 커버 전표를 제거하고 여분의 PBS를 심지. 장착 매체 (50 % V / V 글리세롤 / 물) 한 방울 로케이션 현미경 슬라이드 상 전환. 슬라이드에서 초과 장착 매체를 제거합니다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경 <ol><li> 수은 램프 전력, PC 현미경, 스캐너, 레이저를 포함, 공 초점 현미경의 하드웨어를 켭니다. 소프트웨어를 실행, 운영 체제 계정에 로그인 구성을 확인하고 레이저를 선택합니다. 지침에 따라 순서대로 공 초점 현미경 시스템의 다른 단위를 켭니다. </li><li> 현미경 단계에 준비된 슬라이드를 놓습니다. 스테이지 제어기를 사용하여 대물 렌즈를 통해 샘플을 놓고. 삼나무 기름 한 방울에 추가오일 침지 렌즈가 선택 될 때 커버 슬립한다. 렌즈에 직면 슬라이드에 커버 전표를 놓습니다. </li><li> 형광 현미경 아래에서 관심의 세포를 찾아보십시오. </li><li> 스캔 모드로 전환합니다. 레이저 파워 및 형광 발광의 스펙트럼 범위를 선택. 튜닝 레이저 강도 및 기타 매개 변수에 의해 높은 품질 공 촛점 이미지를 캡처합니다. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+molecular+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and molecular sorting.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).</li>
<li>Hausott, B., Klimaschewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+turnover+and+receptor+trafficking+in+regenerating+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neuro%22%5BJournal%5D)">Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons.</a> Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).</li>
<li>Kallal, L., Benovic, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+green+fluorescent+proteins+to+study+G-protein-coupled+receptor+localization+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking.</a> Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).</li>
<li>Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+of+the+Aequorea+victoria+green-fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.</a> Gene. 111, 229-233 (1992).</li>
<li>Spector, D. L., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+and+Expressing+GFP+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins.</a> CSH protocols. 2006, (2006).</li>
<li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).</li>
<li>von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+vectors+for+the+expression+of+green+fluorescent+protein+fusion+proteins+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants.</a> Gene. 221, 35-43 (1998).</li>
<li>Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+green+fluorescent+protein+for+visualization+of+cell-specific+gene+expression+and+subcellular+protein+localization+during+sporulation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).</li>
<li>Kain, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+reporter+of+gene+expression+and+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization.</a> BioTechniques. 19, 650-655 (1995).</li>
<li>Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+ligand-mediated+internalization+of+G+protein-coupled+receptor+as+a+novel+pharmacological+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach.</a> Life Sci. 80, 17-23 (2006).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-Activated+Bombyx+Corazonin+Receptor+Is+Internalized+via+an+Arrestin-Dependent+and+Clathrin-Independent+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway.</a> Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).</li>
<li>Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+G+protein-coupled+receptor+kinases+and+arrestins+during+receptor+desensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization.</a> Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).</li>
<li>Ferguson, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+beta-arrestin+in+mediating+agonist-promoted+G+protein-coupled+receptor+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization.</a> Science. 271, 363-366 (1996).</li>
<li>Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+receptors%3A+structure+and+signal+transduction+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways.</a> Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).</li>
<li>Yan, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Expression+Profile+of+the+Gonadotropin-Releasing+Hormone+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 HEK293 세포에서 세포 내 발현 및 위치 파악 GPCR 융합 단백질의 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다. 이 기술은 쉽게 HEK293 세포 BMN 및 봄 빅스 모리 (16)로부터 corazonin 수용체의 세포 내재화 제이션을위한 많은 다른 유전자와 세포 유형에 대해 적응 될 수있다. 이 강력한 분석의 성공적인 응용 프로그램은 몇 가지 주요 요인에 의존한다. 제일 효율적인 형질 전환 및 데이터 품질에 필수적인 세포의 건강이다. 형질 전환 배양 시간, 배양 된 세포에 대한 손상이 가능한 모든 단계 형질 다른 실험과 촬상 전에 슬립 커버하는 형질 세포의 통로 사이의 간격이다. 따라서, 세포의 건강을 유지하는 것은이 실험의 모든 단계를위한 중요한 전제 조건입니다. 또한, 고밀도 문화에 단단하게 압축 된 세포를 피하는 것은 공 초점 현미경으로 높은 품질의 이미지를 획득하기 위...

세포를 수송하는화물 피킹 기계를 가지고 세포 외 물질 - 리간드 등, 미생물 영양분, 및 막 관통 단백질 -로 정보, 에너지 및 다른 목적 1,2 셀있다. 그것은 세포 항상성, 조직의 기능, 및 전체 세포 생존에 중요하다. 형광 융합 단백질의 세포 - 기반 표현은 신호 경로 (3)의 위치 파악 및 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 같은 막 횡단 수용체의 내재화를 연구 할 수있는 강력한 방법이다. 직접 형광 검출 기술과 결합 된 해파리 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터의 녹색 형광 단백질 (GFP)로 태그 된 융합 단백질의 발현은, 넓은 수용을 얻은 단백질 타겟팅 연구 4, 5, 6. GFP 기반 detecti에는 고정 아티팩트 (7)을 피하면서 살아있는 세포의 실시간 영상을 허용하는 장점이있다. 다목적 클로닝 벡터 일련 9는 다양한 세포 8에 GFP 단백질 융합체의 발현을 용이하도록 구성되어있다. 및 pEGFP-N1 벡터는 포유류 세포에서보다 밝은 형광 발현 야생형 GFP에서 최적화 된 개선 된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 코딩하는 널리 상용화 된 플라스미드 벡터이다. EGFP의 형광 신호가 포유 동물 세포에서 발현 관찰, 형광 현미경, 바람직하게는 공 촛점 현미경으로 488 nm에서 여기 및 507 nm에서의 방출과 함께 이루어져야한다. 세포 내 위치 파악 및 수용체의 리간드 - 매개 된 내재화를 모니터링 된 GPCR (10)의 신호 전달과 기능을 조사하기 위해 일반적인 기법 </s11&gt;까지. 대부분의 경우에는 내재화 된 GPCR의 탈감작 (작용제의 존재에도 불구하고, 자극 반응의 감쇠) (12, 13)로 이끈다. 내재화 수용체 리소좀에 통합 저하하거나 수용체는 상기 실험에서 사용 된 세포주의 특성에 따라 다시 세포 표면에 재활용 될 수 수있다. 고나 도트로 핀 방출 호르몬 수용체 (GnRHRs)는 GPCR 패밀리에 속하고, 세포 외 아미노 말단 세포 내 -COOH 단자 전형적인 GPCR 단백질 구조를 가지고 있고, 일곱 막 횡단 (TM)는 14 도메인들. (Sepiella 자포니카에서 GnRHR 유전자) 재조합 플라스미드 Sj에 GnRHR-EGFP의 형질 감염 및 (HEK293 세포에서 발현) EGFP 태깅 에스 GnRHR 공 초점 현미경의 검출은 기존에보고 된교활한 및 GFP 형광은 막 횡단 단백질 제이션 분석법 15 기자로 설치되었다. 이제, S. 자포니카 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에 Sj에)에 의해 활성화 Sj에 GnRHR의 내재화는 공 촛점 현미경으로 시간 및 용량 - 의존적 방식으로 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>HEK293 세포주&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High glucose</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td>High glucose 4.0 mM L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin & 0.02% EDTA</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>환원 혈청 배지</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection 시약</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td>시약 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA 형질 주입 시약</td><td>Roche</td><td>6366236001</td><td>시약 2</td></tr><tr><td>DAPI 염색 용액</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>안티페이드 마운팅 미디엄</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시노팜 화학 시약 Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 세포 배양</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 인큐베이터</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 g 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)은 고대비 이미징을 위한 광학 이미징 기술입니다. 이는 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 형광 융합 단백질을 시각화하여 발현, 국소화 및 기능을 결정하는 강력한 접근 방식입니다. 표적 단백질의 세포 내 국소화는 식별, 특성화 및 기능 분석에 중요합니다. 내재화(internalization)는 자극에 대한 적절한 세포 반응을 보장하기 위해 G 단백질 결합 수용체(GPCR) 신호 전달을 제어하는 주된 메커니즘 중 하나입니다. 여기에서는 컨포칼 현미경으로 HEK293 세포에서 GPCR의 세포 내 국소화 및 내재화를 감지하는 실험 방법을 설명합니다. 또한 이 실험은 세포 배양 및 transfection에 대한 몇 가지 세부 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 다양한 형광 마커와 호환되며 GPCR의 내재화뿐만 아니라 대다수 단백질의 세포 내 국소화 시각화에 적용할 수 있습니다. 이 기술을 통해 연구자들은 포유류 세포주에서 GPCR 유전자 발현을 효율적으로 조작할 수 있으며 GPCR 세포 내 국소화 및 내재화에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.

도 1은 공 초점 레이저 주사 현미경 시스템의 일례를 나타낸다. 그림 2는 HEK293 세포 및 pEGFP-N1의 발현을 제공한다. GFP 신호는 세포질 및 핵 검출되었다. 도 3은 우리의 이전에 발행 된 결과 (15)와 일치하는 HEK293 세포에서 S. 자포니카 GnRHR에서의 세포 내 위치 파악을 나타낸다. 때 CLSM에서 에스 GnRHR (에스 GnRHR-EGFP)의 C 말단에서 EGFP 태그 융합 단백질은이 실험에서 녹색 나타났다. DAPI로 염색 핵은 파란색으로 밝혀졌다. DII 염색 빨간색으로 세포막을 강조했다. 병합 된 이미지의 세포 표면에 황색 신호 에스 GnRHR의 세포막 제이션을 보여주는, 적색 및 녹색의 일치를 나타내었다. <p class="jo...

이 프로토콜은 포유 동물 세포에서 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 내재화 초점 현미경 검출을 설명한다. 이것은 기본적인 세포 배양, 형질 전환, 및 공 초점 현미경 절차를 포함하는 융합 발현 GPCR의 세포 내 위치 파악 및 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

이 실험의 전반적인 목적은 포유류 세포에서 발현된 GPCR 융합 단백질의 세포 내 국소화 및 내재화를 검출할 수 있는 효율적이고 해석하기 쉬운 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 수용체 내재화 및 재순환과 같이 세포 내 단백질 국소화 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽고 효율적으로 사용할 수 있다는 점입니다.따라서 이 방법은 GPCR의 모니터링 및 위치 파악에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 세포질 및 핵 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 HEK293 세포를 회복시키고 계대 배양한 후, 세포가 거의 confluence 상태로 성장하면 평형화된 성장 배지를 버리고 PBS 2mL를 첨가한 다음 디쉬를 흔들어 세포를 세척합니다.PBS를 제거하고 1 mL의 trypsin EDTA를 첨가합니다. 세포를 완전히 소화시키기 위해 디쉬를 조심스럽게 흔들어 섞은 후 용액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 디쉬를 37 °C 워터 재킷 CO2 인큐베이터에 3분 동안 넣습니다.세포를 배양하는 동안, 6-웰 플레이트의 각 웰에 평형화된 성장 배지 2 mL를 넣어 준비합니다. 그 후, 세포가 디쉬 바닥에서 떨어지면 디쉬에 평형화된 성장 배지 1 mL를 추가합니다. 파이펫팅으로 혼합한 후, 즉시 세포 현탁액 0.1 mL를 준비된 6-웰 플레이트의 각 웰에 분주합니다.현탁액을 웰에 조심스럽게 파이펫팅하고, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 배양합니다. 다음 날, 세포의 합류도가 85-95%인지 확인합니다. 그 후, 두 개의 멸균 마이크로 원심분리 튜브 중 하나의 튜브에 3 µg의 플라스미드 DNA와 100 µL의 저혈청 배지를 추가합니다.그동안, 다른 튜브에 시약 1 9 µL와 환원 혈청 배지 100 µL를 첨가합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 희석된 플라스미드 혼합물을 희석된 시약 1과 결합합니다.그 다음, 용액을 부드럽게 혼합하고 상온에서 20분 동안 배양합니다. 세포의 배지를 흡입하여 제거하고 FBS가 포함되지 않은 신선한 DMEM 1.5 milliliters를 추가합니다. 그런 다음, 각 웰에 DNA transfection reagent 혼합액 215 microliters를 한 방울씩 떨어뜨려 넣고, 플레이트를 흔들어 부드럽게 혼합합니다.플레이트를 37 °C 및 5% CO2 환경에서 4~8시간 동안 배양합니다. 그 후, 배지를 10% FBS가 포함된 신선한 DMEM으로 교체합니다. 모든 실험을 수행하기 전, 세포를 24~48시간 더 배양합니다.형질전환 효율은 세포주마다 크게 다를 수 있습니다. 따라서 사용하는 특정 세포 유형에 따라 sit and stab 증착 방식의 최적화가 필요할 수 있습니다. 6-웰 배양 플레이트에서 성장 배지를 제거하십시오.그다음, 1 mL의 PBS를 사용하여 세포 단층을 세척합니다. 0.5 mL의 trypsin EDTA를 첨가하고, 디쉬를 가볍게 흔든 후 용액을 흡입하여 제거합니다. 그런 다음, 배양 플레이트를 37 °C에서 3분 동안 배양합니다.배양 과정 중에 12-well 플레이트의 각 웰에 직경 15 millimeter의 멸균 커버슬립을 삽입합니다. 세포를 소량의 신선한 완전 성장 배지에 재현탁하고, 필요한 수의 세포를 커버슬립이 들어 있는 12-well 플레이트로 옮깁니다. 그 후, 세포를 16에서 24시간 동안 배양합니다.세포가 거의 완전히 밀집될 때까지 16~24시간 동안 배양한 후, 각 웰에 5 µM의 막 프로브 dill을 첨가하고 세포를 다시 인큐베이터에 넣어 30분 동안 둡니다. 평형 상태의 성장 배지를 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다. 그런 다음, 각 웰에 1 mL의 4% PFA를 첨가하고 15분 동안 세포를 교반하여 고정합니다.PBS로 고정된 세포를 두 번 세척한 다음, 각 웰에 DAPI 200~300 µL를 첨가하고 상온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 플레이트에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 과잉 버퍼를 닦아냅니다. 커버슬립을 마운팅 매질 한 방울이 도포된 현미경 슬라이드 위에 뒤집어 올립니다.그런 다음, 슬라이드에서 과도한 봉입제를 제거합니다. 거의 합류(confluence) 상태까지 성장한 세포를 사용하여, 평형화된 성장 배지를 제거하고 가온된 신선한 DMEM을 첨가합니다. 세포를 1시간 동안 배양합니다.세포를 서로 다른 농도의 리간드로 30분 동안 처리합니다. 그리고 여기에 표시된 서로 다른 시간 동안 10⁻⁶ M 리간드로 세포를 처리합니다. 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척한 다음, 각 웰에 PBS에 희석된 4% PFA 1 mL를 첨가하고 15분 동안 세포를 부드럽게 교반합니다.PBS로 세포를 두 번 세척한 후, 플레이트의 웰에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고, 앞서 이 영상에서 시연한 방식대로 마운팅합니다. 공초점 현미경 관찰을 위해 수은 램프 전원, PC 현미경, 스캐너 및 레이저를 포함한 공초점 현미경 하드웨어를 켭니다. 소프트웨어를 실행한 다음, 구성을 확인하고 레이저를 선택합니다.지침에 따라 공초점 현미경 시스템의 각 유닛을 켭니다. 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지 위에 놓고, 스테이지 컨트롤러를 사용하여 시료를 대물렌즈 위에 위치시킵니다. 오일 침수 렌즈를 사용하는 경우, 커버슬립 위에 시더 오일을 한 방울 떨어뜨리고 커버슬립이 렌즈를 향하도록 슬라이드를 조절합니다.형광 하에서 관심 세포를 찾은 다음, 스캔 모드로 전환하고 방출 형광체의 레이저 출력과 스펙트럼 범위를 선택하십시오. 레이저 강도 및 기타 파라미터를 조정하여 고화질 이미지를 캡처하십시오. 이 그림은 HEK293 세포에서 pEGFP-N1의 발현을 보여줍니다.GFP 신호가 세포질과 핵에서 검출되었습니다. 여기에서는 S-Japonica 유래 성선자극호르몬 방출호르몬 수용체(SjGnRHR)의 HEK293 세포 내 세포 내 국소화 양상을 보여줍니다. EGFP 수용체는 녹색으로 표시되며, 세포막을 강조하는 Dil 염색은 적색으로 표시됩니다.수용체가 세포막에 국소화되어 있는 것을 볼 수 있습니다. SjGnRHRs의 내입을 시각화하기 위해, 세포를 서로 다른 농도의 성선자극호르몬 방출 호르몬으로 처리하였습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 수용체의 내입은 농도 의존적인 방식으로 진행되었으며, 10⁻⁶ M 리간드 처리 시 수용체가 세포 표면에서 완전히 내입되었습니다.10⁻⁶ M 리간드로 다양한 시간 동안 처리했을 때, 내재화된 SjGnRHRs는 작용제 자극 10분 후에 검출되었으며, 60분까지 극심한 내재화가 일어났습니다. HEK293 세포에서 입증된 바와 같이, 두 실험 모두에서 형광 SjGnRHR EGFP 융합 단백질은 주로 세포막에 위치했으며, 세포 내로 급격하고 빠르게 내재화되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 박테리아, 곰팡이 및 마이코플라스마 오염 없이 세포를 적절한 조건으로 유지하는 것이 중요합니다.이 절차를 따른 후, 단백질 수용체의 다섯 번째 통과 구간(pass V)에 있는 두 번째 질문과 같은 추가적인 의문을 해결하기 위해 세포 확인 및 고정화와 같은 방법을 수행할 수 있습니다. 이러한 매 단계의 발전을 통해, 세포 생물학 및 생화학 분야의 연구자들은 다양한 세포주에서 막관통 수용체의 국소화 및 내재화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

detection-ligand-activated-g-protein-coupled-receptor-internalization

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

spectrally 해결 두 광자 현미경 이미징 시스템을 채용함으로써, 포스터 공명 에너지 전달 (무서워) 효율성의 픽셀 수준의지도 게이 oligomeric 단지를 형성하기 위해 가상 막 수용체를 표현하는 세포를 얻을 수있다. 효율성의지도 걱정부터, 우리는 연구에서 올리고머 복합에 대한 stoichiometric 정보를 추정 할 수 있습니다.

Spectrally 해결된 두 광자 현미경을 사용하여 G 단백질 결합 수용체 상호 작용의 생체내 부량에서

여기, 우리는 chemotaxis를 조사에 대한 자세한 라이브 셀 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 마이 그 레이션 세포에서 이벤트를 신호의 spatiotemporal 역학을 모니터 형광 현미경 방법을 제시한다. 신호 이벤트의 측정은 더욱 GPCR - 신호 네트워크 chemoattractants 및 제어 진핵 세포의 방향 이주 감지 기울기를 달성 방법을 이해하기 위해 우리를 허용합니다.

이미징 G - 단백질 결합 수용체 (GPCR) - 중재 신호 행사 그 제어 Chemotaxis Dictyostelium Discoideum</em

우리의 GPCR의 다양한 타겟 위치에 부 자연스러운 아미노산, P-아지도-L-페닐알라닌을 유전자 인코딩 및 다른 응용 프로그램에서 아지 그룹의 다양성을 보여줍니다. 이들은 GPCR의 리간드 결합 주머니에 잔류를 확인하는 대상으로 광 가교 기술 및 펩티드 에피토프 태그 또는 형광 프로브의 GPCR의 특정 사이트 bioorthogonal 수정이 (가) 있습니다.

유전자 인코딩 분자 프로브는 G 단백질 결합 수용체를 연구하는

우리는 특정 폴리 클로 날 항체를 세포 에피토프를 사용하여 신경을 생활의 표면에 단백질을 레이블하는 방법을 설명합니다. 세포 표면에 결합 된 항체에 의해 연속적 endocytosis를 통해 내부화 단백질은 단백질의 나머지와 구별 또는 배양 중에 표면에 매매 될 수있다.

라이브 배양 된 신경 세포의 항체 수유 후 세포 표면과 내면 단백질의 차등 라벨링

여기에 설명 된 형광 기반의 칼슘 동원 분석은 고아 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에)의 기능 활성화 리간드 (들)의 식별을위한 중간 처리 역 약리학 심사 시스템입니다.

형광 기반의 칼슘 동원 분석에 의해 G 단백질 결합 수용체의 특성

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.

TIRF 현미경을 통해 단일 ​​이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

손쉬운 형광 분석 결과 포유류 세포에 표현 된 단백질에 비정규-아미노산 (ncAAs)를 통합 하는 아미노-acyl-tRNA-합성/tRNA 쌍의 효율성을 평가 하 여. G-단백질 결합 수용 체 (GPCRs) 공부 ncAAs의 응용 프로그램, 바인딩 사이트 및 bioorthogonal GPCR 라이브 셀 라벨의 사진-가교 매핑을 포함 하 여 설명 합니다.

사진-가교 매핑 및 라이브 포유류 세포에서 Bioorthogonal 화학 GPCRs에 프로브 화학의 유전 결합을 최적화

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

배우세요 포유류 세포에서 GPCR 융합 단백질의 내재화를 공 초점 현미경으로 검출하는 방법을. HEK293 세포를 이용하여 수용체 역학을 연구하고 세포 신호 전달 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

더 많은 동영상 탐색