공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

이 실험의 전반적인 목표는 포유류 세포에서 발현된 GPCR 융합 단백질의 세포 내 국소화 및 내재화를 검출하기 위한 효율적이고 쉽게 해석할 수 있는 방법을 제공하는 것입니다. 이 방법은 수용체 내재화 및 재활용과 같은 세포 내 단백질 국소화 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 쉽고 효율적으로 사용할 수 있다는 것입니다.

따라서 이 방법은 GPCR을 모니터링하고 찾는 데 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 세포질 및 핵 단백질과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 HEK293 세포를 회수하고 전달한 후 세포가 거의 합류점까지 성장하면 평형화된 성장 배지를 버리고 PBS 2ml를 첨가한 다음 접시를 휘저어 세포를 씻습니다.

PBS를 버리고 1ml의 트립신 EDTA를 첨가합니다. 세포를 완전히 소화하려면 접시를 조심스럽게 휘젓고 용액을 흡입하십시오. 그런 다음 접시를 섭씨 37도의 방수 재킷 C02 인큐베이터에 3분 동안 넣습니다.

세포가 배양하는 동안 각 웰에 2밀리리터의 평형 성장 배지를 추가하여 6웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 세포가 접시 바닥에서 들어 올려지면 접시에 1ml의 평형 성장 배지를 추가합니다. 피펫팅으로 혼합하고 0.1ml의 세포 현탁액을 준비된 6웰 플레이트의 각 웰로 즉시 옮깁니다.

웰의 현탁액을 부드럽게 피펫팅하고 섭씨 37도 및 5%CO2에서 세포를 배양합니다. 다음 날, 세포가 85-95% confluent인지 확인합니다. 그런 다음 두 개의 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 3마이크로그램의 플라스미드 DNA와 100마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 하나의 튜브에 추가합니다.

한편, 9마이크로리터의 시약 1과 100마이크로리터의 환원된 혈청 배지를 다른 튜브에 추가합니다. 튜브를 실온에서 5분 동안 배양합니다. 희석된 플라스미드 혼합물을 희석된 시약 혼합물과 결합합니다.

그런 다음 용액을 부드럽게 섞고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 세포의 배지를 흡인하고 FBS 없이 1.5ml의 새로운 DMEM을 추가합니다. 그런 다음 215마이크로리터의 DNA 트랜스펙션 시약 혼합물을 각 웰에 적가하고 플레이트를 휘젓면서 부드럽게 혼합합니다.

플레이트를 섭씨 37도, 5%CO2에서 4-8시간 동안 배양합니다. 그런 다음 배지를 10%FBS의 새로운 DMEM으로 교체합니다. 실험을 실행하기 전에 24-48시간 동안 세포를 더 배양합니다.

Transfection 효율은 세포주에 따라 크게 다를 수 있습니다. 그러므로, sit and stab in deposition의 최적화는 사용되는 특정 세포 유형에 따라 필요할 수 있습니다. 6 웰 배양 플레이트에서 성장 배지를 제거합니다.

그런 다음 PBS 1ml를 사용하여 세포 단층을 세척합니다. 0.5ml의 트립신 EDTA를 넣고 접시를 휘젓고 용액을 흡인합니다. 그런 다음 배양 플레이트를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다.

배양하는 동안 15mm 직경의 멸균 커버슬립을 12웰 플레이트의 각 웰에 삽입합니다. 소량의 새로운 완전 성장 배지에 세포를 재현탁시키고 필요한 수의 세포를 커버슬립을 사용하여 12웰 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 16-24시간 동안 세포를 배양합니다.

배양 16-24시간 후 세포가 합류 부근까지 성장하면 각 웰에 멤브레인 프로브 딜의 5마이크로몰을 추가하고 세포를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 평형을 이룬 성장 배지를 제거하고 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 4%PFA 1ml를 넣고 세포를 15분 동안 교반하여 세포를 고정합니다.

PBS를 사용하여 고정 세포를 두 번 세척한 다음 각 웰에 200-300마이크로리터의 DAPI를 추가하고 실온에서 10분 동안 플레이트를 배양합니다. PBS로 셀을 두 번 세척한 후 플레이트에서 커버슬립을 조심스럽게 제거하고 여분의 버퍼를 흡수합니다. 커버 슬립을 장착 매체 한 방울이 장착된 현미경 슬라이드에 뒤집습니다.

그런 다음 슬라이드에서 여분의 장착 매체를 제거합니다. 합류 지점에 가깝게 성장한 세포를 사용하여 평형화된 성장 배지를 제거하고 새로 가열된 DMEM을 추가합니다. 세포를 1시간 동안 배양합니다.

30분 동안 다양한 농도의 리간드로 세포를 치료합니다. 그리고 여기에 표시된 다른 시간 동안 10에서 음의 6 대구치 리간드로 세포를 치료합니다. 차가운 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척한 다음 15분 동안 세포를 부드럽게 교반하기 전에 PBS에 4%PFA 1ml를 각 웰에 추가합니다.

PBS에서 세포를 두 번 세척한 후 플레이트의 웰에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 이 비디오의 앞부분에서 설명한 것처럼 장착합니다. 컨포칼 현미경 검사를 수행하려면 수은 램프 전원, PC 현미경, 스캐너 및 레이저를 포함한 컨포칼 현미경의 하드웨어를 켜십시오. 소프트웨어를 실행한 다음 구성을 확인하고 레이저를 선택합니다.

지침에 따라 컨포칼 현미경 시스템의 다른 장치를 켭니다. 준비된 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 스테이지 컨트롤러를 사용하여 샘플을 대물 렌즈 위에 놓습니다. 오일 이멀젼 렌즈의 경우 커버슬립에 삼나무 오일 한 방울을 떨어뜨리고 커버슬립이 렌즈를 향하도록 슬라이드의 방향을 잡습니다.

형광(fluorescence)에서 관심 세포를 찾은 다음 스캔 모드로 전환하고 방출 형광단의 레이저 출력과 스펙트럼 범위를 선택합니다. 레이저 강도 및 기타 매개변수를 조정하여 고품질 이미지를 캡처합니다. 이 그림은 HEK293 세포에서 pEGFP-N1의 발현을 보여줍니다.

GFP 신호는 세포질과 핵에서 검출되었습니다. S-자포니카(S-Japonica) 또는 SjGnRHR의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체의 HEK293 세포의 세포 내 국소화가 여기에 나와 있습니다. EGFP 수용체는 녹색이고 세포막을 강조하는 Dil 염색은 빨간색입니다.

수용체는 원형질막(plasma membrane)에 국한되어 있는 것으로 보입니다. SjGnRHR의 내재화를 시각화하기 위해 세포를 다양한 농도의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬으로 처리했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 수용체의 내재화는 용량 의존적 방식으로 진행되었고, 수용체는 10에서 마이너스 6 몰 리간드로 세포 표면에서 완전히 내재화되었습니다.

서로 다른 기간 동안 10에서 마이너스 6 어금니 리간드로 처리했을 때, 작용제 시뮬레이션 후 10분 후에 내재화된 SjGnRHR을 검출할 수 있었고, 60분까지 극도의 내재화가 발생했습니다. HEK293 세포에서 입증된 바와 같이, 두 실험 모두에서 형광 SjGnRHR EGFP 융합 단백질은 주로 원형질막에 국한되어 있었고 극적이고 빠르게 세포에 내재화되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 박테리아, 곰팡이 및 마이코플라스마 오염이 없는 올바른 조건에서 세포를 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 세포 검사 및 고정화와 같은 방법을 수행하여 단백질 수용체의 V를 통과하는 두 번째 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 각 개발 이후, 이 기술은 세포 생물학 및 생화학 분야의 연구자들이 다양한 세포주에서 막관통 수용체의 국소화 및 내재화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.