높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법
May 12th, 2017
여기, 우리는 순진 primed pluripotent 전환의 키나제 조절기에 대한 목표로 작은 분자 화면을 수행하는 양적 및 확장 프로토콜을 제시한다.
이 스크리닝의 전반적인 목표는 배아 줄기세포 다능성을 조절하는 소분자 단백질 키나아제 억제제를 식별하는 것입니다. 이 방법은 배아 줄기세포 다능성을 조절하는 새로운 단백질 키나아제 신호 경로를 식별함으로써 배아 줄기세포 신호 전달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 이 기술의 주요 장점은 표준 실험실 장비와 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하여 스크리닝을 비교적 쉽게 수행할 수 있다는 것입니다.
우리는 다능성 신호 경로에 대한 대부분의 연구가 키놈의 광대한 파동을 완전히 무시했다는 것을 깨달았을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 떠올렸습니다. 10cm 접시에 0.1% 젤라틴 5ml를 넣어 젤라틴으로 코팅된 10cm 접시를 준비합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 후 젤라틴을 흡인하고 플레이트를 2분 동안 건조시킵니다.
그런 다음 GST 태그가 부착된 LIF 100나노그램, 10%의 태아 송아지 혈청 및 5%의 녹아웃 혈청 치환체를 포함하는 표준 마우스 ES 세포 배지의 코팅된 접시에 표준 마우스 ES 세포주를 플레이트링합니다. 섭씨 37도, 5%CO2에서 세포를 배양하고 매일 배지를 교체하십시오. 배지를 흡인하고 플레이트당 5ml의 인산염 완충 식염수로 세척하여 이틀에 한 번씩 약 80%의 포화도에서 마우스 ES 세포를 통과시킵니다.
그런 다음 마우스 ES 세포 플레이트당 1ml의 트립신 EDTA를 추가하고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 배양 후 트립신화된 세포를 4mL의 배지에 다시 현탁시키고 5분 동안 1200RPM에서 세포를 원심분리합니다. 생성된 세포 펠릿을 5ml의 배지에 완전히 재현탁하고 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.
10마이크로리터 세포 현탁액과 10마이크로리터의 트리판 블루를 결합하여 세포를 계산합니다. 혼합물을 세포 계수 챔버에 넣거나 혈구계 및 광학 현미경을 사용합니다. 다음으로, 멀티채널 피펫을 사용하여 3000개의 마우스 ES 세포를 100마이크로리터의 배지의 최종 부피에 있는 0.1%젤라틴으로 코팅된 96웰 플레이트에 시딩합니다.
그런 다음 멀티채널 피펫을 사용하여 1에서 100 희석으로 kinase 억제제를 적용합니다. 배지를 부드럽게 피펫팅하여 억제제와 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 세포가 조직 배양 후드에 1시간 동안 정착하여 도금 표면 전체에 균등하게 분포되도록 합니다.
배지를 변경하지 않고 48시간 동안 세포를 배양합니다. 스크리닝 분석을 시작하려면 다중 채널 흡인기와 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 PBS에서 96웰 마우스 ES 세포판을 세척합니다. 세척 후 세포 추출물을 150마이크로리터의 용해 완충액에 혼합합니다.
V-바닥 96 웰 플레이트에서 30분 동안 1500회 G로 원심분리하여 추출물을 투명하게 합니다. 그런 다음 100 마이크로리터의 상등액을 96웰 진공 도트 플롯 매니폴드를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 고정시킵니다. 멤브레인을 건조시키고 Ponceau S 40ml로 염색하여 일관된 전사를 보장합니다.
TBST로 멤브레인을 세척한 후 TBST와 우유 3%로 차단합니다. 그런 다음 Nanog 및 Dnmt3b 항체의 멤브레인을 차단 버퍼에서 1에서 1000까지 희석하여 밤새 배양합니다. 다음날, TBST에서 10분 동안 멤브레인을 세 번 세척합니다.
그런 다음, 30 밀리리터의 2 차 항체에서 차단 완충액에서 1-10, 000의 희석으로 배양합니다. 디지털 면역블로팅 이미징 시스템을 사용하여 멤브레인을 개발합니다. 진행하기 전에 기존의 면역 블로팅을 사용하여 스크리닝에서 확인된 키나아제 억제제를 검증하는 것이 중요합니다.
이는 추가 다운스트림 분석 전에 거짓 긍정을 제거하는 데 도움이 됩니다. 스크리닝 데이터를 분석하고 억제제를 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 진정한 다능성 조절자로 검증합니다. 여기에 표시된 것은 수행된 화면의 대표적인 Nanog dot plot입니다.
프라임 또는 순진한 만능을 유발하는 양성 대조군 억제제가 강조됩니다. 또한 수행된 화면의 대표적인 Dnmt3b 점도표가 표시됩니다. 프라임 또는 나이브 만능성을 유발하는 양성 대조군 억제제가 다시 강조됩니다.
이 플롯에서 억제제는 Nanog 대 Dnmt3b 비율에 대해 순위가 매겨졌습니다. 2배 Nanog 대 Dnmt3b 비율 역치를 설정하여 나이브 또는 프라임 다능성을 안정화하는 억제제를 식별합니다. 합산된 Nanog 및 Dnmt3b 신호도 제공됩니다.
또한, 추가 검증을 위해 선택된 키나아제 억제제가 주목됩니다. 여기에 표시된 것은 선택된 키나아제 억제제, Nanog 및 Dnmt3b 면역블롯에 대한 기존 면역블롯 검증과 Nanog 대 Dnmt3b 비율 및 총 신호가 제공됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 배아 줄기 세포 다능성을 조절하는 소분자 키나아제 억제제를 식별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 72시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 방법은 다능성을 제어하는 키나아제 신호 경로에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 배아 줄기 세포 분화 및 후성유전학적 변형자와 같은 기타 조절 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차에 따라, 후성유전학적 변형자를 표적으로 하는 것과 같은 소분자 억제제의 다른 라이브러리를 사용하여 다능성 조절에서 새로운 플레이어를 식별할 수 있습니다.
개발 후 이 기술은 우리 연구 그룹이 새로운 다능성 신호 경로를 규명할 수 있는 길을 열었습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다능성을 조절하는 데 있어 증폭된 경로에 대한 새로운 역할을 식별합니다.
개요
이 기사는 초기-프라이밍된 전능 전이의 키나제 조절자를 식별하는 것을 목적으로 하는 표적 소분자 스크리닝을 위한 정량적이고 확장 가능한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 배아 줄기 세포 신호 전달 경로에 대한 이해를 향상시키기 위해 설계되었습니다.
주요 연구 요소
과학 분야
- 세포 생물학
- 줄기 세포 연구
- 신호 전달
배경
- 배아 줄기 세포 전능성은 다양한 신호 전달 경로에 의해 조절됩니다.
- 이전 연구에서는 키노믹스의 많은 구성 요소를 간과했습니다.
- 새로운 키나제 억제제를 식별하면 전능성 조절에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
- 이 연구는 줄기 세포의 키나제 신호 전달에 대한 현재 지식의 공백을 메우는 것을 목표로 합니다.
연구 목적
- 배아 줄기 세포 전능성을 조절하는 소분자 단백질 키나제 억제제를 식별합니다.
- 전능성에 관련된 새로운 단백질 키나제 신호 전달 경로를 규명합니다.
- 표준 실험실 장비를 사용한 간단한 스크리닝 방법을 개발합니다.
사용된 방법
- 세포 배양을 위한 젤라틴 코팅 접시 준비.
- 마우스 배아 줄기 세포 접종 및 키나제 억제제 적용.
- 면역 블로팅 기술을 통한 스크리닝 분석.
- 기존 방법을 사용한 식별된 키나제 억제제 검증.
주요 결과
- 초기 또는 프라이밍된 전능성을 안정화시키는 키나제 억제제의 성공적인 식별.
- 데이터 분석은 억제제 선택을 위한 2배의 Nanog 대 Dnmt3b 비율 임계값을 보여줍니다.
- 선택된 억제제의 검증은 전능성 조절에서의 역할을 확인합니다.
- 얻은 통찰은 다른 조절 시스템 및 분화 과정에 적용할 수 있습니다.
결론
- 개발된 프로토콜을 통해 키나제 억제제를 효율적으로 스크리닝할 수 있습니다.
- 이 방법은 배아 줄기 세포 분화 연구에 적용할 수 있습니다.
- 향후 응용 분야에는 전능성 조절에서 후성 유전적 변이자를 탐구하는 것이 포함될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to systematically interrogate kinase signaling networks that govern pluripotency transitions, a critical inflection point in stem cell-based therapeutic development. By providing a scalable, reagent-efficient platform for target de-risking, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic insight into cell fate regulation. The approach enhances predictive confidence in target selection by linking kinase modulation to defined pluripotency biomarkers, informing portfolio prioritization in regenerative medicine and disease modeling pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of kinase-dependent mechanisms underlying naïve-primed pluripotency transitions.
- Operational Value: Uses standard cell culture and immunoblotting infrastructure, minimizing specialized equipment needs.
- Predictive Value: Identifies kinase inhibitors that modulate pluripotency biomarkers (Nanog/Dnmt3b) to support target hypothesis validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot readouts (Nanog, Dnmt3b, ratio) for hit identification in kinase-focused screens.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats and multichannel pipetting for medium-throughput compound evaluation.
- Assay Readiness: Produces normalized, reproducible signals enabling cross-plate comparison and threshold-based hit selection (e.g., two-fold Nanog/Dnmt3b ratio).
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links kinase activity to pluripotency states relevant for disease modeling and regenerative applications.
- Mechanistic De-risking: Clarifies signaling pathways upstream of core pluripotency factors, reducing ambiguity in target mechanism.
- Preclinical Relevance: Supports validation of kinase targets in stem cell-derived models prior to differentiation or tissue-specific assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, connecting target hypothesis testing to assay development and preclinical validation through measurable biomarker outputs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of kinase libraries to clarify signaling nodes in pluripotency regulation.
- Screening: Enables standardized, reproducible compound screening in ESC models using accessible reagents and detection methods.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized immunoblot data (signal intensity, ratios) to prioritize hits based on pluripotency effects.
- Translational Research: Connects kinase modulation to stem cell state transitions, informing downstream differentiation and disease model relevance.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted for other small molecule libraries (e.g., epigenetic modifiers) and stem cell contexts beyond pluripotency screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in kinase-target pluripotency relationships through biomarker-linked phenotypic readouts.
- Operational Value: Leverages standard lab equipment (incubator, centrifuge, immunoblot system) for broad accessibility across discovery teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional validation of kinase targets in a physiologically relevant system.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted target prioritization by identifying kinases that modulate defined pluripotency states.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic stem cell culture and maintenance under defined conditions.
- Dependent on access to immunoblotting infrastructure and validated antibodies (e.g., Nanog, Dnmt3b).
- Necessitates standardization of cell seeding density, inhibitor dosing, and incubation times for assay reproducibility.
- Adaptation to other model systems may require optimization of coating, media, and passaging protocols.
- False positive rates require orthogonal validation (e.g., conventional immunoblot) to confirm target engagement and specificity.
