Name: 카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 배우세요 CAPRRESI 프로토콜을 이용한 키메라 유전자 조립 방법을. 제한효소 부위 삽입과 PCR 기반 플라스미드 회수 기술로 빠르고 경제적인 유전자 융합이 가능합니다.

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이 작품은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (보조금 번호 154833) 및 Universidad Nacional Autónoma de México에서 지원되었습니다. 저자는 Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos 및 Soledad Juárez에게 행정적이고 기술적 인 조언을 해주신 것에 감사드립니다.

1. CAPRRESI 프로토콜 참고 : 그림 1 은 전체 CAPRRESI 프로토콜을 나타냅니다. 이 기술은 in silico 디자인과 원하는 키메라의 후속 구성을 기반으로합니다. <ol><li> 클로닝 플라스미드, pUC18 또는 pUC19의 선택. <ol><li> 기술적 인 요구에 가장 적합한 pUC 벡터를 선택하십시오. 참고 : 두 벡터는 다중 복제 사이트의 방향을 제외하고는 동일한 순서를 갖습니다. 이것은 올리고 뉴클레오티드의 디자인과 PCR 플라스미드 파괴에 중요합니다. </li></ol></li><li> 야생형 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열에 대한 in silico 분석. <ol><li> 야생형 유전자의 DNA 서열을 얻어 FASTA 형식 파일 ( 예 : genes.fas)에 저장하십시오. 참고 : pUC18 / 19 벡터의 시퀀스는 pUC.fas 파일에 포함되어 있습니다 ( 그림 1 , 1 단계). </li><li> 어떤 제한 enz 결정ymes는 REsearch.pl 스크립트를 실행하여 wildtype 유전자와 pUC18 / 19 염기 서열을 절단하지 않습니다. 또는 온라인 도구로 제한 효소 사이트 검색을 수행하십시오 ( 그림 1 , 2 단계). <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl REsearch.pl 유전자. perl REsearch.pl pUC.fas 참고 :이 명령은 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas 및 pUC_re.fas. </li><li> genes_re.fas와 pUC.fas 파일을 비교하여 선택한 pUC18 / 19 벡터의 다중 복제 사이트로 wildtype 유전자를 복제하기위한 적절한 제한 효소를 선택하십시오. pUC18 / 19 벡터의 암피실린 내성 유전자 ( ampR )에 상대적인 인서트의 방향을 선택하십시오. </li></ol></li><li> 야생형 유전자 (외부 올리고 뉴클레오타이드)의 코딩 영역을 증폭시키기 위해 포워드 및 리버스 올리고 뉴클레오티드를 디자인하십시오. 각 5 &#39;말단에 적절한 제한 효소 부위를 포함시킨다.올리고 뉴클레오티드; 이것은 삽입 방향을 정의합니다. <ol><li> 포워드 올리고 뉴클레오타이드에 기능적 리보솜 결합 부위를 포함시킨다. </li><li> 벡터 내에서 동일한 방향으로 두 야생형 유전자를 삽입하십시오. </li></ol></li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택. <ol><li> translate.pl 스크립트 ( 그림 1 , 3 단계)를 실행하여 wildtype과 ampR 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl translate.pl 유전자. perl translate.pl ampR.fas 참고 :이 스크립트는 다음 출력 파일을 생성합니다 : genes_aa.fas 및 ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> 두 가지 야생형 아미노산 서열을 적절한 소프트웨어 ( 예 : 근육)로 전역 정렬하십시오. </li><li> 키메라 asse에 대한 원하는 휴식 영역 (3-6 아미노산)을 선택하십시오mbly. 파일을 FASTA 형식의 파일 ( 예 : regions.fas)에 저장하십시오. </li><li> 두 가지 야생형 유전자에서 선택된 아미노산 스트레치를 코딩하는 DNA 서열을 찾습니다. </li></ol></li><li> 제한 효소 사이트를 포함하는 동의어 DNA 시퀀스의 in silico 세대. <ol><li> 절단 영역으로 선택된 각 아미노산 서열 스트레치를 코드하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 4). 이러한 시퀀스는 regions.fas 파일에 저장됩니다. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오. perl synonym.pl regions.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn.fas 출력 파일을 만듭니다. </li></ol></li><li> 동의어 DNA 서열에서 발견되는 제한 효소 부위를 검색하십시오. <ol><li> 터미널에 다음을 입력하십시오 : perl REsynonym.pl regions_syn.fas 참고 :이 스크립트는 regions_syn-re.fas 출력 파일을 만듭니다.. </li></ol></li><li> 두 야생형 유전자의 동의어 시퀀스간에 공유되는 하나의 제한 효소를 선택하십시오. 이 사이트는 제한 효소 소화를 통해 키메라를 조립하는 데 사용됩니다. 선택된 제한 효소가 야생형 유전자 나 pUC18 / 19 벡터 서열을 절단하지 않는지 확인하십시오. <ol><li> genes_re.fas, pUC_re.fas 및 regions_syn-re.fas 파일에있는 제한 효소를 비교하십시오. </li></ol></li><li> 실 리코 (Silico) 에서는 원산지를 두 야생형 유전자의 상응하는 유전자좌에서 동의어 DNA 서열로 대체합니다. synonym DNA sequence를 wildtype sequence file (genes.fas)에 추가합니다. </li><li> gene.fas 파일 ( perl translate.pl genes.fas )에 포함 된 유전자의 아미노산 서열을 얻습니다. </li><li> 야생형과 동의어 DNA 서열에서 번역 된 아미노산 서열을 정렬합니다. 두 시퀀스가 ​​동일한지 확인하십시오. </li><li> pU에 존재하는 ampR 유전자를 가지고이 절의 모든 단계를 반복하십시오C18 / 19 벡터입니다. 참고 : 목표는 ampR 유전자 (ampR.fas 파일)를 두 개의 보완적인 부분으로 나누는 것입니다. ampR 유전자를 파괴하기 위해 선택되는 제한 효소는 키메라 조립에 사용 된 제한 효소와 달라야 한다. </li></ol></li><li> 두 개의 야생형 유전자를 선택된 pUC18 / 19 벡터에 독립적으로 클로닝 (그림 1, 단계 3). <ol><li> 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 선택한 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 정제하십시오. <ol><li> 예를 들어, pUC18 플라스미드로 E. coli DH5α를 형질 전환시키고, 형질 전환 체를 고체 LB-0.3 mg / mL 암피실린 (Amp)상에서 37 ℃에서 밤새 성장시킨다. 형질 전환 콜로니를 선택하고 새로운 LB-0.3 mg / mL Amp 플레이트를 접종하고 37 ° C에서 밤새 배양하십시오. </li><li> 이전의 배양 물을 섭취하고 37 ℃에서 6 ~ 8 시간 동안 액체 LB-0.3 mg / mL Amp에서 배양하십시오. 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li><li> PCR은 approp를 사용하여 총 게놈 DNA에서 야생형 유전자를 증폭외부 oligonucleotides를 riate. 가능한 경우 높은 충실도의 DNA 중합 효소를 사용하십시오. 수율을 최대화하는 DNA 중합 효소를 선택하십시오. 제조업체의 지침과 올리고 뉴클레오타이드의 용융 온도에 따라 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 사용 된 DNA 중합 효소, 앰플 리콘 크기, 주형 및 올리고 뉴클레오티드에 따라 PCR 사이클을 실행하십시오. 예를 들어, rpoD DNA를 증폭 하려면 50 μL 반응을 준비하십시오 : 10 μ 버퍼 5 μL, 50 mM MgSO 4 2 μL, 10 mM dNTP 믹스 1 μL, 각 10 μM 올리고 뉴클레오티드 2 μL (표 2), 2 템플릿 DNA ( 대장균 DH5α 총 DNA) μL, 초순수 35.8 μL, 고 충실도 DNA 중합 효소 0.2 μL를 넣었다. 다음 PCR주기를 실행하십시오 : 초기 변성을 위해 94 ℃에서 1 분, 30 사이클의 증폭 (94 ℃에서 30 초 변성, 60 ℃에서 30 초, 올리고 뉴클레오티드 어닐링, 68 ℃에서 2 분) 확장). </li><li> 1.2 g의아가로 오스에 두 배 증류수 100 mL에 넣고 전자 레인지로 가열한다. 젤 받침대를 조립하고 빗을 수평 젤 캐스터에 넣으십시오. 겔 트레이에 용융 된 아가로 오스 용액을 채우고 고형화하십시오. 빗을 제거하십시오. </li><li> 전기 영동 챔버에 젤을 넣으십시오. 1x Tris-acetate-EDTA 완충액으로 챔버를 채 웁니다. 겔 우물에 PCR 제품 50 μL를로드합니다. 시료를 전기 영동하십시오 ( 예 : 110V에서 1 시간). </li><li> 전기 영동 후 느린 흔들림으로 1 mg / mL ethidium bromide 용액 100 μL를 포함하는 2 회 증류수 100 mL에서 10 분간 겔을 염색한다. 느린 흔들림에서 두 번 증류수로 겔을 10 분 동안 씻으십시오. 수평 쉐이커를 사용하십시오. 주의 :에 티듐 브로마이드는 독성 화합물입니다. 보호용 장갑과 면화 실험용 코트를 착용하십시오. </li><li> 키트를 사용하여 젤의 해당 밴드에서 야생형 유전자 DNA를 정제하십시오. 얼룩이 진 젤을 UV 챔버에 넣음으로써 밴드를 시각화하십시오 (권장 파장 : 300 nm). 젤의 노출을 최소한으로 유지하십시오. DNA 정제 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 주의 : 자외선은 위험합니다. 보호용 방패, 안경 및 면화 실험 코트를 착용하십시오. </li></ol></li><li> 정제 된 야생형 유전자와 pUC18 / 19 플라스미드 DNA를 제조자의 지침에 따라 제한 효소로 분해하십시오. 가능한 경우 빠른 소화 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 10 μL의 초순수, 2 μL의 10X 버퍼, 1 μL의 Kpn I 제한 효소 및 1 μL의 Xba I 제한 효소에서 6 μL의 pUC18 DNA (300 ng / μL)를 소화 합니다. 반응을 37 ℃에서 30 분간 둔다. <ol><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, 이중 소화 반응 Kpn I- Xba I을 80 ℃에서 5 분 동안 비활성화시킨다. </li></ol></li><li> 믹스 인서트 : 체적 비율의 벡터 DNA3 : 1이다. 라이 게이션 반응에 대해서는 제조업체의 지침을 따르십시오. 가능한 경우 빠른 연결 효소를 사용하십시오 (25 분 동안 반응을 10 분 동안 그대로 두십시오). 참고 : 일반적으로 키트를 사용한 정제 후 DNA 농도는 소화 및 라이 게이션 반응에 충분합니다. 예를 들어, rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 6 μL, pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL) 3 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 1 μL 물, 및 T4 DNA 리가 아제 1 μL. 25 ° C에서 10 분 동안 연결 반응을 남겨주세요. </li><li> Supplementary Materials에 설명 된대로 2 ~ 4 μL의 라이 게이션 반응으로 대장균 DH5α를 형질 전환하십시오. 형질 전환 된 세포를 고체 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에 플레이트한다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 접시를 밤새 37 ° C에서 방치하십시오. &lt;/ li&gt; <li> 보충 교재에 설명 된대로 반응을 시퀀싱 할 후보를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 후보자로부터 플라스미드 DNA를 추출하십시오. 또는 인서트를 클로닝하기 위해 사용 된 것과 동일한 제한 효소로 후보 플라스미드 DNA를 분해하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 공급자가있는 시퀀스 후보 구성 10 . DNA 어셈블러 11 ( 그림 1 , 단계 5)을 사용하여 silico로 서열 을 조립하십시오. </li></ol></li><li> PCR에 의한 플라스미드 파쇄와 제한 효소 소화. <ol><li> 야생형 및 ampR 유전자의 경우 브레이크 영역에서 전방 및 후방 올리고 뉴클레오타이드를 각각 디자인하십시오. silico 에서 해당 동의어 DNA 서열 (1.4 단계에서 얻음)에 대해 야생형 단편을 대체하십시오. 참고 :이 동의어 DNA 서열은 제한 효소 부위를 포함합니다. 정방향 및 역방향 올리고 뉴클레오타이드는 t그는 효소 부위를 제한한다. 올리고 뉴클레오타이드는 21-27 개의 뉴클레오티드, 시토신 또는 구아닌으로 끝나야하며, 제한 효소 부위를 포함해야한다. 순방향 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 그 표적 부위와 동일한 서열을 갖는다. 역전 올리고 뉴클레오타이드는 주형 DNA상의 표적 부위의 역 상보 서열이다. </li><li> PCR 반응 ( 예 : pUC18 rpoD 및 pUC18 sigA )에 대한 DNA 템플릿으로 두 wildtype 유전자 구조를 사용하십시오. 각 구조물 (pUC18 rpoD σ1- σ2 , pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 및 pUC18 sigA σ3-σ4)의 두 가지 보완 부분을 얻습니다 ( 그림 1 , 단계 6). </li><li> DNA 샘플을 아가로 오스 겔 1-1.2 % [w / v]에 넣으십시오. 전기 영동 ( 예, 110V에서 1 시간)에 의해 DNA 주형으로부터 PCR 생성물을 분리한다. 또는 Dpn I로 PCR 반응을 분해하여 DNA 주형을 파괴 할 수 있습니다. 참고 : DpnI 효소는 메틸화 된 DNA 서열 (5&#39;-GATC-3 &#39;)만을 인식합니다. <ol><li> DNA 정제 키트를 사용하여 샘플을 정제하십시오. 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 모든 상보 적 DNA 단편을 적절한 제한 효소로 이중 절단하십시오. 가능한 경우 빠른 분해 효소를 사용하십시오. 예를 들어, 제조사의 프로토콜을 사용하여 Afl II 및 Spe I로 pUC18rpoDσ1-σ2 DNA 단편을 이중 절단하십시오. 37 ° C에서 15 분 동안 소화 반응을 남겨 둡니다. </li><li> 제조자의 지침에 따라 제한 효소를 비활성화하십시오. 예를 들어, Afl II Spe I을 80 ℃에서 20 분 동안 비활성화시킵니다. </li></ol></li><li> DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. <ol><li> 원하는 키메라 유전자를 조립하기 위해 용적 1 : 1 비율로 적절한 DNA 조각을 섞는다.1, 단계 7). 참고 : 이렇게하면 ampR 유전자의 무결성이 복원되어 기능성 단백질을 생성합니다. <ol><li> 예를 들어 pUC18 rpoD σ1- σ2 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL로 분해 됨) 4 μL, pUC18 sigA σ3-σ4 DNA ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 4 μL, 2 배 완충액 10 μL, 초순수 2 μL 및 T4 DNA 리가 제 1 μL; 키트 정제 후 DNA 농도는 소화 및 후속 연결에 충분합니다. 라이 게이션 반응을 25 ℃에서 10 분 동안 남겨 두십시오. </li></ol></li><li> 키메라 어셈블리 연결 반응 (보충 자료) 3 ~ 5 μL와 대장균 DH5α를 변환합니다. 37 ° C 밤새 LB / Amp / X-gal / IPTG 플레이트에서 변형 세포를 성장시킵니다. </li><li> 흰색의 형질 전환 대장균 콜로니를 선택하고 새 LB / Amp 플레이트에 줄무늬를 만듭니다. 37시에 하룻밤 사이에 둡니다.기음. </li><li> 보충 교재에 설명 된대로 시퀀싱 반응에 대한 후보자를 선택하기 위해 식민지 PCR을 수행합니다. 전기 영동 (단계 2.3.2.1에서 설명)을 수행하여 1-1.2 % (w / v) 아가로 오스 겔에서 밴드를 시각화하십시오. </li><li> 긍정적 인 후보자로부터 문화를 성장시킵니다. 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. </li></ol></li></ol> 2. 서열 후보 키메라 구조물 <ol><li> 플라스미드 DNA의 품질이 서열 분석 서비스 제공자의 지침에 따라 서열 분석 반응에 충분한 지 확인하십시오. 정화 키트를 사용하여 DNA를 추출합니다. 예를 들어, 시퀀스 서비스 제공 업체의 인터넷 페이지에서 샘플에 대해 권장되는 DNA 농도에 특히주의하십시오. DNA 정량 도구를 사용하여 시료의 농도를 구하십시오. </li><li> 시퀀싱 서비스 제공 업체와의 서열 후보 키메라 구조 10 . </li><li> se 조립<html> in silico DNA 어셈블러 11을 사용하여 읽기를 시작합니다. </li><li> 서열 정렬 도구 9 , 12를 사용하여 실 리코 설계 키메라 시퀀스 대 어셈블 된 어레이를 정렬합니다. 키메라 유전자가 성공적으로 융합되었는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 준비하기 참고 : 살아있는 세포와 관련된 모든 단계는 분젠 버너가 켜져있는 깨끗한 층류 후드에서 수행되어야합니다. <ol><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 생산. <ol><li> 대장균 - 경쟁 세포를 생산하기 위해서는 공개 된 프로토콜 13을 따르거나 보충 자료를 참조하십시오. 또는 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하십시오. </li></ol></li><li> 대장균 DH5α 유능한 세포를 형질 전환. <ol><li> 대장균 배양 물의 화학적 형질 전환을 위해, 공개 된 프로토콜을 따른다.class = &quot;xref&quot;&gt; 13 또는 보충 자료 참조. 또는 박테리아 형질 전환을 위해 일렉트로 포 레이션을 사용하십시오. 상업적으로 이용 가능한 적격 세포를 사용하는 경우에는 제조업체의 지침을 따르십시오. </li></ol></li><li> E. coli DH5α로부터 게놈 및 플라스미드 DNA 정제. <ol><li> 보충 교재에 명시된대로 핵산 추출을 시중에서 구할 수있는 키트를 사용하거나 출판 된 프로토콜을 사용하십시오 13 . </li></ol></li><li> 식민지 PCR을 수행하십시오. <ol><li> 이 기술을 사용하여 후속 시퀀싱 반응을위한 후보 형질 전환 콜로니를 확인하십시오. 참고 :이 방법은 서열의 무결성에 대한 최종 검증을 나타내지 않습니다. 이 기술에 대한 자세한 설명은 보충 자료 에서 제공됩니다. </li></ol></li><li> 솔루션 준비. <ol><li> 만나다 <strong&gt; 솔루션 준비에 대한 자세한 내용은 표 1을 참조하십시오. </li></ol></li><li> CAPRRESI 프로토콜에 필요한 스크립트 및 시퀀스 파일을 다운로드하십시오. <ol><li> 원하는 종의 완전한 게놈 서열을 포함하는 유전자 뱅크 파일을 다운로드하고, 게놈 브라우저를 사용하여 선택한 유전자의 DNA 서열을 추출하여 fasta 파일 형식으로 저장하십시오. CAPRRESI 프로토콜에 필요한 Perl 스크립트를 다운로드하십시오. 스크립트와 시퀀스 파일을 같은 디렉토리에 저장하십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

CAPRRESI는 PRM 2 의 대안으로 설계되었습니다. 원본 PRM은 강력한 기술입니다. 그것은 선택된 유전자의 어떤 부분을 따라 DNA 서열의 융합을 허용한다. PRM의 경우 야생형 유전자를 동일한 플라스미드에 클로닝해야합니다. 그 후, 올리고 뉴클레오타이드는 플라스미드에서 발견되는 야생형 및 항생제 내성 유전자 내에서 설계된다. 플라스미드 혼란은 둔기가 끝난 고 충실도의 DNA 중합 효소와 이전에 고안된 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 PCR로 얻을 수 있습니다. 상보 적 PCR 산물의 라이 게이션은 키메라 유전자를 조립하고 항생제 내성 카세트를 복원하여 기능적 플라스미드 회복을 가져온다. PRM은 동일한 플라스미드 백그라운드에서 키메라 유전자 라이브러리의 구축을 가능하게합니다. 불행히도, blunt-ended DNA 서열의 연결은 기술적으로 힘들 수 있습니다. 겹쳐지는 PCR 단편 1에 의한 키메라 조립은 또한 DNA 중합 효소가 무딘...

키메라 유전자 어셈블리는 단백질 기능을 밝히고 생물 공학적 목적으로 분자 생물학에서 널리 사용되어왔다. 중첩 PCR 산물 증폭 1 , 플라스미드 회수 2 , 상 동성 재조합 3 , CRISPR-Cas9 시스템 4 , 부위 유도 재조합 5 및 깁슨 어셈블리 6 과 같은 유전자 융합에 대한 다른 방법이있다. 이들 각각은 서로 다른 기술적 이점을 제공합니다. 예를 들어 중복 된 PCR 디자인의 융통성, 플라스미드 회복 동안 구조의 생체 내 선택, CRISPR-Cas9 및 Gibson 시스템의 고효율성 등이 있습니다. 반면에 이러한 방법 중 일부를 수행하는 동안 약간의 어려움이 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 처음 두 접근법은 둔기가 끝난 DNA 단편에 의존하며 이러한 유형의 산물의 결찰은 stic에 비해 기술적으로 어려울 수 있습니다연말 결찰. Site-directed 재조합은 Creoxox 시스템과 같이 원래 DNA 서열 (흉터)의 흔적을 남길 수 있습니다 5 . CRISPR-Cas9는 때로는 대상 사이트 4 이외에 다른 게놈 지역을 수정할 수 있습니다. 여기에서 플라즈미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 소개합니다.이 프로토콜은 플라즈미드 회수 방법 (PRM)과 동의어 DNA 서열상의 제한 효소 부위 삽입을 결합하여 결찰 효율을 향상시키는 단백질 코딩 유전자 융합 프로토콜입니다 . 아미노산 서열의 완전성을 보장하기 위해, 제한 효소 부위는 동의어 DNA 서열 연장 부에 삽입된다. CAPPRESI의 이점 중 하나는 일반 실험실 시약 / 도구 ( 예 : 효소, 능력있는 세포, 용액 및 열 순환기)를 사용하여 수행 할 수 있으며 신속한 결과를 줄 수 있다는 것입니다 (적절한 효소가 사용되는 경우). 제한에 의존동의어 DNA 서열로부터 나오는 효소 부위는 관심있는 단백질 내부의 정확한 융합 지점의 선택을 제한 할 수있다. 그러한 경우, 중복되는 올리고 뉴클레오타이드를 사용하여 표적 유전자를 융합시키고, 벡터의 내성 유전자에 제한 효소 부위를 삽입해야한다. CAPRRESI는 7 가지 간단한 단계로 구성됩니다 ( 그림 1 ) : 1) 클로닝 벡터 pUC18 또는 pUC19 6의 선택 ; 2) 융합 될 야생형 서열의 실 리코 (silico) 분석; 3) 키메라 조립 및 플라스미드 파괴에 대한 파괴 영역의 선택; 4) in silico 세대의 동의어 DNA 제한 효소 부위를 포함하는 염기 서열; 5) 선택된 플라스미드로의 야생형 유전자의 독립적 인 클로닝; 6) PCR에 의한 플라스미드 파괴,이어서 제한 효소 소화; 및 7) DNA 라이 게이션 및 세균 변형을 이용한 플라스미드 회수. 이 기술로 생산 된 키메라 유전자는 검증되어야한다.ith 시퀀싱. pUC18 / 19 벡터는 작은 크기 ( 즉, 2,686 염기쌍), 높은 카피 수, 유리한 서열화 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 클로닝 및 키메라 조립에 기술적 장점을 제공합니다. 여기에 박테리아 배양이 저렴하고 빨리 자라기 때문에 대장균 (Escherichia coli) 숙주를 사용하여 키메라를 조립하고 처리했습니다. 이를 고려하여, 최종 표적 플라스미드로의 융합 단편의 후속 클로닝 ( 예 : 박테리아의 pRK415 또는 포유류 세포의 pCMV와 같은 발현 벡터)이 필요할 것이다. CAPRRESI는 두 가지 주요 시그마 인자 유전자 인 E. colirpoD 와 Rhizobium etlisigA 를 융합시켜 시험 하였다 . 1 차 시그마 인자는 전사 개시에 관여하는 RNA 중합 효소 서브 유닛이며, 4 개의 도메인 ( 즉, σ1, σ2, σ3, σ4)으로 이루어져있다. 아미노산 서열은 길다.rpoD 및 sigA에 의해 인코딩 된 단백질은 각각 613 및 685이다. RpoD와 SigA는 48 %의 동일성 (98 % 적용 범위)을 공유합니다. 이러한 1 차 시그마 요인은 영역 σ2와 σ3 사이에서 두 개의 보완적인 조각으로 나뉘어졌습니다. 키메라 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4)과 키메라 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3- σ4)의 두 가지 키메라 유전자가이 디자인에 따라 조립되었다. DNA 융합 생성물은 시퀀싱에 의해 확인되었다.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>블런트/3'-A 오버행 엔드 PCR 산물의 혼합물을 생산</td></tr>합니다. 고<tr><td>순도 플라스미드 분리 키트</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>모든 플라스미드 정제 반응에 사용됩니다.</td></tr> 고<tr><td>순도 PCR 산물 정제 키트</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>아가로스 겔의 모든 PCR 정제 반응에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>AflII 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>은 서열 5'-CTTAAG-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C</td></tr><tr><td>KpnI-HF 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>서열 5'-GGTACC-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C</td></tr><tr><td>SpeI-HF 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>은 서열 5'-ACTAGT-3'을 인식하고 37°C에서 절단합니다. C</td></tr><tr><td>XbaI 제한 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>은 서열 5'-TCTAGA-3'을 인식하고 37°C에서 자릅니다. C</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마 알드리치</td><td>A0166-5G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>날리딕신 산</td><td>시그마 알드리치</td><td>N8878-5G</td><td>항생제</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>시그마 알드리치</td><td>Y1625-1KG</td><td>세균 세포 배양</td></tr><tr><td>카제인 펩톤</td><td>시그마 알드리치</td><td>70171-500G</td><td>세균 세포 배양</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마 알드리치</td><td>S9888-1KG</td><td>소금</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG</td><td>박테리아 세포 배양</td></tr><tr><td>XbaI 제한 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>빠른 소화 XbaI enzyme</td></tr><tr><td>KpnI 제한 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>빠른 소화 KpnI 효소</td></tr><tr><td>빠른 결찰 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Fast DNA ligation kit</td></tr><tr><td>AflII 제한 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>빠른 분해 AflII enzyme</td></tr><tr><td>SpeI 제한 효소</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>빠른 분해 SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

카스트레 : 플라스미드 회수 및 제한 효소 부위 삽입에 의한 키메라 조립

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

여기, 우리는 플라스미드 복구 및 제한 효소 사이트 삽입 (카프레 리)에 의한 키메라 조립을 제시한다. CAPRRESI는 원래의 플라스미드 회수 방법의 많은 장점을 활용하고 제한 효소 소화를 도입하여 DNA 라이 게이션 반응을 완화합니다 (키메라 조립에 필요함). 이 프로토콜의 경우 사용자는 야생형 유전자를 동일한 플라스미드 (pUC18 또는 pUC19)에 복제합니다. 키메라가 조립되어야하는 아미노산 서열 영역의 in silico 선택 후, 사용자는 그들을 암호화하는 모든 동의어 DNA 서열을 얻는다. Ad Hoc Perl 스크립트를 사용하면 사용자가 모든 동의어 DNA 시퀀스를 결정할 수 있습니다. 이 단계 후에 다른 Perl 스크립트는 모든 동의어 DNA 시퀀스에서 제한 효소 사이트를 검색합니다. 이 in silico 분석은 pUC18 / 19 플라스미드에서 발견되는 암피실린 내성 유전자 ( ampR )를 사용하여 수행됩니다. 사용자는 synonym region 내에서 올리고 뉴클레오타이드를 디자인하여 PCR로 wildtype과 ampR 유전자를 파괴합니다. obt 후상보적인 DNA 단편을 정제하고 정제하고, 제한 효소 소화를 수행한다. 키메라 조립은 적절한 상보적인 DNA 단편을 연결함으로써 달성된다. PUC18 / 19 벡터는 작은 크기 (2,686 염기 쌍), 높은 카피 수, 유리한 시퀀싱 반응 특징 및 상업적 유용성과 같은 기술적 이점을 제공하기 때문에 CAPRRESI를 위해 선택된다. 키메라 조립을위한 제한 효소의 사용은 무딘 - 종단 제품을 생산하는 DNA 중합 효소의 필요성을 제거합니다. CAPRRESI는 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

그림 1 은 CAPRRESI를 나타냅니다. 이 방법을 사용하여 2 개의 키메라 유전자를 2 개의 박테리아 1 차 시그마 인자 ( 즉, 대장균 RpoD 및 R. etli SigA)의 도메인을 교환함으로써 조립 하였다. rpoD 및 sigA 유전자의 DNA 서열은 각각 GenBank 게놈 파일 NC_000913 및 NC_007761에서 Artemis Genome Browser 14 를 사용하여 얻었다. pUC18 벡터의 DNA 서열은 NCBI 서버의 뉴클레오티드 데이타베이스로부터 얻어졌다. 제한 효소 사이트의 in silico 분석은 REsearch.pl Perl 스크립트 (단계 1.2.2 참조)를 실행하여 DNA 서열에 대해 수행되었습니다. 이러한 결과는 올리고 뉴클레오타이드 디자인에 사용되었습니다 (1.2.3 단계)....

여기, 제한 효소 사이트를 동의어 DNA 시퀀스에 삽입 및 기능 플라스미드 복구를 기반으로하는 프로토콜 인 플라스미드 회수 및 제한 효소 사이트 삽입 (CAPRRESI)에 의한 키메라 어셈블리를 제시합니다. 이 프로토콜은 단백질 코딩 유전자 융합을위한 빠르고 저렴한 방법입니다.

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

이 비디오는 플라스미드 회복 및 제한 효소 부위 삽입을 통한 키메라 조립(Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion, CAPRRESI)이라고 불리는 절차를 보여줍니다. 이 방법은 동의 DNA(synonym DNA)에 특정 제한 효소 부위를 도입한 후 DNA 서열을 절단하고 교환하여 두 개의 키메라 유전자를 생성하는 방식입니다. CAPRRESI에서는 먼저 관심 있는 야생형 유전자들을 동일한 벡터의 다중 클로닝 부위(multiple cloning sites)에 삽입합니다. 그다음, 각 유전자에서 아미노산 서열이 동일한 절단 부위(break regions)를 선정하고, Ampicillin 저항성 유전자의 절단 부위를 선정합니다.각 절단 부위에 제한효소 인식 부위를 포함하는 동의 서열을 결정하기 위해 Perl 스크립트를 사용합니다. 특수하게 설계된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 원하는 제한효소 부위를 가진 동의 DNA를 포함하는 4개의 상보적 파트를 생성하도록 PCR을 수행합니다. 생성된 PCR 산물을 정제하고 절단한 후, 이를 연결하여 키메라 서열을 생성합니다.이 기술의 주요 장점은 유전자 융합을 용이하게 한다는 것입니다. 이 방법은 단백질 효소의 기능은 무엇인가와 같은 분자 생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 관심 유전자가 벡터의 다중 클로닝 사이트에 이미 삽입된 상태에서 이 절차를 시작하십시오.여기에서는 RNA 합성을 개시하는 데 필요한 박테리아 신호 인자를 인코딩하는 rpoD 및 sigA 유전자를 동반 텍스트에 상세히 기술된 대로 각각 pUC18에 클로닝하였습니다. 키메라 단백질 생산을 위한 올리고뉴클레오타이드를 설계하려면, 먼저 translate. pl perl 스크립트를 실행하여 rpoD, sigA 및 ampR 유전자의 아미노산 서열을 얻으십시오.그다음, muscle 웹 서버를 사용하여 rpoD와 sigA의 아미노산 서열을 정렬합니다. 각 서열에서 동일한 3~6개의 아미노산 서열을 가진 절단 부위를 선택합니다. 해당 서열들을 regions.fas 파일에 저장합니다.다음으로, ampR 유전자 내부에서 3~6개의 아미노산 길이의 서열을 선택하여 이 서열을 regions.fas 파일에 저장합니다. 모든 동의 DNA 서열을 결정하려면 perl 스크립트인 synonym.pl을 실행합니다. 그런 다음, 동의 서열을 절단하는 제한 효소가 무엇인지 찾으려면 resynonym.pl 스크립트를 실행합니다.다음으로, 동의어 DNA 서열을 사용하여 rpoD 및 sigA의 절단 부위에 동일한 제한 효소 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. ampR 유전자를 파괴하기 위해 서로 다른 제한 효소 부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 설계합니다. 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오타이드는 제한 효소 부위에서 겹치게 됩니다.올리고뉴클레오타이드는 21에서 27 뉴클레오타이드 길이여야 하며, 사이토신 또는 구아닌을 포함하고 제한 효소 인식 부위를 가져야 합니다. 정방향 올리고뉴클레오타이드는 템플릿 DNA 상의 표적 영역과 동일한 서열을 가집니다. 역방향 올리고뉴클레오타이드는 템플릿 DNA 상의 표적 영역에 대한 역상보적 서열입니다.DNA 합성 업체에 올리고뉴클레오타이드를 주문하십시오. 올리고뉴클레오타이드가 도착하면, rpoD 및 sigA pUC18 컨스트럭트를 템플릿 DNA로 사용하여 PCR을 수행하십시오. 이를 통해 각 컨스트럭션을 위한 두 개의 상보적 파트를 생성하게 됩니다.PCR 이후, 아가로스 겔 전기영동을 수행하여 PCR 산물을 DNA 템플릿으로부터 분리합니다. 상보적인 플라스미드 부분의 정제는 모플라스미드 오염을 방지하는 데 매우 중요합니다. 모플라스미드는 본 과정에서 보여주는 겔 정제 방식이나, 모플라스미드를 절단하는 데 사용되는 dpn1 제한 효소 처리를 통해 제거할 수 있습니다.전기영동 후, 에티듐 브로마이드 용액으로 겔을 염색합니다. 염색된 겔을 300 nanometer UV 챔버에 넣어 밴드를 시각화합니다. 겔의 노출 시간은 최소한으로 유지하십시오.그런 다음 PCR 산물이 포함된 밴드를 절단하여 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 키트를 사용하여 DNA 샘플을 정제한 후, 적절한 fast digest 제한 효소를 사용하여 모든 상보적 DNA 단편에 대해 이중 절단을 수행합니다. 플라스미드 상보 부위를 융합하기 위해 AFL2와 SPE1을 사용합니다.소화 반응물을 37 °C에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 제조사의 지침에 따라 제한 효소를 불활성화하십시오. 예를 들어, AFL2 및 SPE1은 80 °C에서 20분 동안 불활성화합니다.다음으로, 적절한 DNA 단편들을 라이게이션 완충액, 물 및 T4 DNA ligase와 혼합합니다. 라이게이션 반응을 25 °C에서 10분 동안 유지합니다. 이러한 방식으로 ampR 유전자의 무결성이 회복되어 기능성 단백질이 생성됩니다.결찰(ligation) 후, 키메라 조립 결찰 반응액 3~5 µL를 E.Coli DH5 alpha에 형질전환합니다. 형질전환된 세포를 LB ampicillin x-gal IPTG 플레이트에 도말하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 흰색을 띠는 형질전환 E.Coli 콜로니를 선택하여 새로운 LB ampicillin 플레이트에 스트리킹합니다.플레이트를 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 시퀀싱 후보군을 선정하기 위해 colony PCR을 수행합니다. 이전과 동일하게 전기영동을 실시하여 1% 내지 2% agarose 겔에서 밴드를 시각화합니다.배양을 접종하기 위해 올바른 크기의 DNA 밴드를 나타내는 후보 콜로니를 선택합니다. 다음 날, 키트를 사용하여 해당 콜로니에서 플라스미드 DNA를 추출합니다. 플라스미드 정제 후, 시퀀싱을 위해 샘플을 보냅니다.본 비디오에서 상세히 설명한 바와 같이 rpoD sigA 키메라 구조체를 제작하였습니다. 시퀀싱 후, muscle 소프트웨어를 사용하여 야생형 및 키메라 유전자의 서열 정렬을 수행하였습니다. 이후 여기에 표시된 것처럼 mura 소프트웨어를 사용하여 키메라 유전자 서열을 조립하였습니다.동의 서열은 검은색으로 표시되며 AFL2 사이트는 밑줄로 표시됩니다. 이 시퀀싱 데이터는 키메라 구조물을 생성하기 위한 CAPRRESI 방법의 성공적인 활용을 입증합니다. 이 영상을 시청한 후, 귀하는 유전자 분절을 융합하는 효과적인 방법을 습득하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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