Name: 체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 학습하세요 형광 표지된 GnRH 유사체를 이용한 인간 암세포 배양에서의 약물 흡수 정량화 방법입니다. 공초점 현미경과 유세포 분석을 병행하여 표적 항암 치료제의 효율성을 평가하는 기술을 익히세요.

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세포 배양 및 시약 1. 준비 <ol><li> 10 % (v / v)의 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지 불리는) 보충 제조자의 권장 배지에서 세포 배양을 유지한다. 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 세포 배양 플라스크 유지. 거꾸로 현미경으로 세포의 증식 및 포화 상태에 따라 (10X 위상 대비 목표를 사용). </li><li> 세포가 적절한 포화 상태에 도달하면, 배지를 제거하고 2-3 ㎖, 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 배양을 씻는다. PBS를 제거하고 세포 배양 물 0.5 ㎖, 멸균 0.25 % 트립신 EDTA 용액을 추가하고 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 트립신을 중지하고 멸균 원심 분리기 튜브로를 전송하는 데 3 ~ 4 mL의 멸균 완전 배지에서 세포를 일시 중단합니다. 실온에서 4 분 (RT) 150 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 뜨는을 무시하고 페이지를 일시 중단2 ~ 3 mL의 멸균 완전 배지에서 ellet. </li><li> 세포 현탁액 100 μL를 가지고 죽은 세포를 얼룩, 100 μL 0.4 % (m / V를) 트리 판 블루 용액을 혼합한다. 로드 혈구로이 혼합물을 10 μL와 도립 현미경으로 생존 세포의 수를 결정한다. </li><li> 4 × 104 세포 / ㎖를 함유하는 멸균 완전 배지 10 ㎖에 13 단계에서 제조 된 세포 현탁액의 요구량을 희석. </li><li> 첫 번째 유리 바닥 8 잘 현미경 슬라이드의 일곱 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 의 GnRH 흡수 방법이 슬라이드를 사용합니다. </li><li> 제 8 잘 현미경 슬라이드의 다섯 우물에 잘 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액 250 μL를 추가 (104 세포 / 웰). 이 슬라이드는의 GnRH-IR 발현 방법에 사용된다. </li><li> 추가 1도 당 (단계 1.5에서 준비) 세포 현탁액의 용액 (4 × 104 세포 / 웰) 일곱 아에12 웰 플레이트의 LS. 이 판은 GnRH의 정량 방법에 사용된다. </li><li> 세포는 두 현미경 슬라이드 플레이트에 부착하자. 48 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서이를 부화. </li><li> 배양 후 (10X 위상 대비 목표를 사용) 거꾸로 현미경으로 세포를 확인합니다. 세포가 건강하고 연결된 경우 다음 단계를 계속 진행합니다. </li><li> 세 접합체 (18)의 각각에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 밀리미터의 GnRH-FITC 스톡 용액을 제조 하였다. 의 GnRH-I, 16.97 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II 및 16.47 μg의 / μL [리스 8 (16.43 μg의 / μL [D-리스 6 (FITC)] : (이 희석 농도를 사용하여 FITC)] -의 GnRH-III)을 실온에서 어두운 장소에서 이러한 재고 솔루션을 유지하고 몇 주 이내에 그들을 사용합니다. </li><li> 1.7 μL 1.7 mL를 완전 배지에서 10 세의 GnRH-FITC mM의 스톡 용액을 각각 희석. 이러한 솔루션을 흔들어. (살전전자 미디어의 치료 10 μM의 GnRH-FITC 수 있습니다.) 1.35 mL를 완전 배지에 150 μL 세 10 μM의 GnRH-FITC 치료 매체의 각 희석. 뿐만 아니라 이러한 솔루션을 흔들어 (이것들은 1 μM의 GnRH-FITC 치료 중간). 주 : 치료 매체를 포함하는 모든의 GnRH-FITC가 빛으로부터 보호하고 몇 시간 내에 사용하여야한다. </li><li> 37 ° C까지 6의 GnRH-FITC 처리 매체 (단계 1.12에서 제조) 및 4 mL의 완전 배지를 예열. </li><li> 5 mM의 형광 프로브 솔루션의 3 μL 5 μm의 3 mL의 PBS에 (재료 목록에 언급 된 핵 Counterstain과)를 희석. 이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li></ol> 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM) <ol><li> GnRH에 흡수 방법 <ol><li> 단계 1.6에서 제조 된 최초의 현미경 슬라이드를 타고 잘 칠 각각에서 전체 매체를 피펫. 예열이 완료 메디칼의 250 μL를 추가제 1 웰에 음. 음성 대조군으로 사용합니다. (1 μM, 3과 10 μM로 3 우물) 향후 6 우물 각 (1.13부터) 미디어를 처리 예열의 GnRH-FITC의 250 μL를 추가합니다. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 고정 용액 (10 % 중성 완충 포르말린)의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫, 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 마지막으로, 각 웰에 장착 매체의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 이미징 때까지 실온에서 어둠 속에서 슬라이드를 유지합니다. </리&gt; </ol></li><li> 의 GnRH-IR 발현 방법 <ol><li> 단계 1.7에서 제조 된 제 8 잘 현미경 슬라이드를 타고 다섯 우물에서 각각 전체 매체를 피펫. </li><li> 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가이 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 너무 두 번째 우물에 예열이 완료 매체의 250 μL를 추가하고 GnRH에 처리하기 전에의 GnRH-IR 발현을 조사 할 때 사용합니다. </li><li> 향후 3 우물에 250 μL 세 예열 된 10 μM의 GnRH-FITC 치료 미디어의 각을 추가합니다. 의 GnRH-IR 발현을 조사하기 전에의 GnRH-FITC 접합체와 세포를 전처리하는이 우물을 사용합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> GnRH의 처리 후는 GnRH-IR의 발현을 조사하고 예열 된 완전 배지 250 μL 이러한 웰을 세척하는 데 사용되는 각각의 3 개 웰로부터 처리 매체를 피펫. 250 추가μL의 세 각 웰에 완전 배지를 예열. 1 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 슬라이드 부화. </li><li> 다섯 우물 각각의 매체를 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 10 분 동안, 각 웰에 솔루션을 고정의 250 μL를 추가하고 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 고정 솔루션을 피펫과 PBS 250 μL와 세포를 씻는다. 1 시간 동안, 각각의 웰에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA) 블록 함유 PBS 용액 250 μL를 첨가하고 RT에서 슬라이드를 배양한다. </li><li> (: 100 비율 1) 1 mL의 PBS에서의 GnRH-IR 차 항체의 10 μL를 희석. RT에 그것을 유지하고 몇 시간 내에 그것을 사용합니다. </li><li> 음성 대조군 (제 1도)를 제외한 각 웰에서 BSA 차단 솔루션을 피펫. (음성 대조군 잘 제외) 250 μL PBS로 세포를 씻으십시오. 250 μL PBS는 EAC로 단계 2.2.7에서 제조의 GnRH-IR 차 항체를 포함의 추가(음성 대조군 제외) 시간 잘. 어두운 곳에서, 1 시간 동안 RT에서 슬라이드를 부화. </li><li> (: 500 비율 1) 1.25 mL의 PBS에 알렉사 546 레이블 차 항체의 2.5 μL를 희석. 참고 :이 솔루션은 실온에서 보관하고 몇 시간 내에 그것을 사용, 빛으로부터 보호되어야한다. </li><li> 다섯 우물 각각의 솔루션을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 2.2.9에서 제조 된 AF 546 레이블 차 항체를 포함하는 PBS 250 μL를 추가합니다. 어둠 속에서 1 시간 동안 실온에서 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰의 용액을 피펫 250 μL PBS로 세포를 씻어. 각 웰에 단계 1.14에서 제조 된 5 μM 형광 프로브 솔루션을 포함하는 PBS의 250 μL를 추가하고 RT에서 10 분 동안 슬라이드를 품어. </li><li> 각 웰에서 형광 프로브 솔루션을 피펫 조심스럽게 250 μL PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 그 후, 각 웰에 장착 미디어의 3 ~ 4 방울을 추가합니다. 어둠 속에서 슬라이드를 유지RT의 미세한 이미지까지. </li></ol></li><li> 영상 <ol><li> 이미지 (63X 오일 침지 대물 사용) 반전 공 초점 레이저 주사 현미경으로 세포 <ol><li> 다음 여기 / 방출 파장을 사용합니다. GnRH에 콘쥬 게이트 : 514분의 488 nm의 알렉사 546 표지 된 항체 : 546분의 488 나노 미터 (만의 GnRH-IR 표현 방법 사용), DRAQ5 형광 프로브 : 680분의 633 nm의. </li><li> 음성 대조군 세포를 이용한 촬상 파라미터를 설정한다. 이미지 처리 된 세포에 이러한 매개 변수 (그림 3)를 사용합니다. 재조정 분석의 시작에서 각각의 미세한 슬라이드에 촬상 파라미터. 필요한 경우 제조업체가 제공하는 소프트웨어와 미세 조정과 수출 이미지. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) <ol><li> GnRH에 정량 방법 <ol><li> 단계 1.8에서 제조 된 판을 가지고 개에서 완전 배지를 피펫일곱 우물 채널. 첫 번째 우물에 예열이 완료 매체의 1 ML을 추가합니다. 음성 대조군으로 사용합니다. 추가 1 mL의 향후 6 우물에 미디어 (1 μM, 10 μM 3 우물 3 우물)을 치료 예열 여섯의 각. 5 시간 동안 37 ℃에서 가습 5 % CO 2 분위기 배양기에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 각 웰의 매체를 피펫. 조심스럽게 2 mL의 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 각 우물에 트립신 EDTA 용액 500 μL를 추가합니다. 세포 (약 10 분)를 분리 할 때까지 37 ℃에서 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 트립신을 중지 아니라 각에 완전 배지 1 ㎖를 추가합니다. 접시를 흔들어. 피펫으로 부드럽게 세포를 일시 중지하고, FACS 튜브에 각 우물에서 현탁액을 전송합니다. 4 ℃에서 4 분 동안 150 XG에 튜브를 원심 분리기. </li><li> 하나의 움직임으로 조심스럽게 상층 액을 붓는다. 세포를 일시 중지 다시 부드럽게 각 FACS 튜브에 얼음처럼 차가운 PBS 500 μL를 추가하고. 이 끝날 때까지 얼음에 튜브를 유지실험. </li></ol></li><li> 분석 및 계산 <ol><li> 유동 세포 계측법에 의해 세포를 분석 할 수 있습니다. 여기 들어, 488 nm의 아르곤 레이저 파장을 사용하여 검출을위한 530 nm 파장을 사용한다. 음성 대조군 세포를 실행하여 매개 변수 흐름 cytometer를 설정합니다. 처리 된 세포 (그림 4A)을 분석하려면이 매개 변수를 사용합니다. 제조업체의 소프트웨어와 데이터를 평가 중간 형광 세기 (MFI) 값을 결정하고, MFI 상대 값을 계산한다. </li></ol></li></ol>

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실험은 선별을 위해 선택적으로 부착 표지의 GnRH 유사체를 사용하여 본원에 기재된 시험 관내 세포 배양. 공 초점 현미경과 세포 계측법 방법은 추적에 적합하고, 시간과 농도 의존적으로 이들의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량화되어 흐른다. 이 실험은 다음과 같은 중요한 단계 : 1) 멸균 건강한 세포 배양 물을 유지하는 단계; 2)의 GnRH 펩타이드는 고품질이어야합니다; 3) 적당한 농도와 배양 시간 따라야합니다; 4) 치료 및 세척 단계; 5) 기기 설정을 잘 조절. 세포는 제조업체의 10 %로 보충 권장 배지 (V / V) 소 태아 혈청과 항생제 (완전 배지)에서 유지된다. 세포를 보관하고 (GnRH에-FITC 콘쥬 게이트로) 처리 단계까지 무균 환경에서 처리되어야합니다. 실험하기 전에, 거꾸로 현미경을 사용하여 세포를 확인합니다. 그들은 건강해야첨부하고 필요한 수량에 도달해야합니다. <p class="jove_co...

<html> 펩타이드 계 표적 약물 전달 시스템은 지난 몇 년 동안 1, 2를 통해 암 치료에 빠른 개발 및 유망 영역이되었다. 인간의 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 수용체 타입 I (는 GnRH-IR) 주로 뇌하수체에 위치뿐만 아니라 3자가 재생산을 담당 여러 다른 조직에 존재한다. 의 GnRH-IR은 생식계 -4,5- 관련된 또는 무관 한, 암 조직의 개수로 표현된다. 건강한 조직과 비교하여 여러 가지의 악성 종양 세포의 GnRH-IR의 높은 발현은 표적 치료 (5, 6)에 대한 기회를 제공한다. 많은 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에) 유사체 잔기를 표적으로 사용할 수 지난 수십 년에 개발되어왔다F &quot;&gt; 7, 8, 9. 이러한 펩티드는 악성 종양 세포에 높은 선택성을 가진 항암제를 제공 할 수있는 위에 표현의 GnRH-IR 6. 대응하는 접합보다 높은 선택성 및 더 나은 효율 몇몇 GnRH의 공액 항암 약물 무료 약물, 9 8 7보고되었다. 의 GnRH 펩타이드 및 그 수용체에 대한 이전 서적은의 GnRH-IR은 GnRH에 10 유사체에 대해 서로 다른 선택이 다양한 입체를 가정 할 수 있다고보고했다. 고도로 변수의 GnRH-IR은 복잡하고 다양한 신호 전달 경로는 자연과 인공 리간드 (11)에 대한 다른 활동이 부여되어있다. 이러한 사실은 GnRH에 기반 시스템의 조사가 도전합니다. 한편,<html> Y는 유망한 치료 가능성을 가지고있다. 방사성 표지의 GnRH 펩티드와 몇 가지 실험을 이전하는 형광 표지의 GnRH 유사체가 사용 된 12, 13, 14, 15,하지만 실험을보고되었다 여전히 제한되어 있습니다. 방사성 표지는 고감도를 제공하는 동안, 형광 표식은 여러 다른 장점, 예를 들면, 취급이 용이하고, 다른 형광체와 Counterstain과 능력을 갖는다. 성공적 약물 전달에 사용 된 일반적인 세의 GnRH 유사체는 -GnRH-I, [D-리스가 6] -GnRH-II와의 GnRH-III 있지만 타겟팅 잔기 이들 펩타이드의 효과 인 [6 D-리스]입니다 거의, 17 (16)을 비교합니다. 한편, 다른 암세포의 GnRH 유사체 사용 된 별도의 실험 결과는 다양하다. 이러한 고려 사항을 바탕으로 ntent는 &quot;&gt; 우리는 이들의 GnRH 펩티드의 대상으로 종양 및 약물 전달의 가능성에 집중하여 합성하고, [D-리스 6 (FITC)] 특징 -의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC를 )] -는 GnRH-II 및 [리스 8 (FITC)] -의 GnRH-III 펩티드 접합체 (18)이 유사 선택적 그들의리스 또는 D-리스 (펩티드 FITC 비 측쇄 1 FITC로 표지되어 각각에서 하나. 접합체). 아이디어는 선택적 형광 표식이 펩티드에 대한 새로운 정보를 제공하고, 그 양호한 추적 및 신뢰성 정량화를 허용 할 수 있다고 하였다. 이들 콘쥬 게이트는 쉽게 그들의 종양 타겟팅 효율을 비교할 수 있도록 안전한 취급 및 신뢰성 검출 능력을 가지며, 악성 종양 세포의 많은 종류의 선별. 우리는 최대 이러한 펩티드 접합체와 날짜 실험의 GnRH - 약물 접합체를 타겟팅하는 신규 한 암의 발전에 기여하고, 새로운 치료 타르를 식별하는 데 도움이 될 수있는 희망뿐만 아니라 가져옵니다. 본 원고의 GnRH-FITC 접합체 일부 잘 재현하고 빠른 실험을 보여줍니다. 는 GnRH-R의 세포 표면 발현은 거기서 동시에 시험 세포주에서의 GnRH-IR의 세포 표면 수준을 조사, GnRH에 대한 흡수 한정적 조건이다. 우리는 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)으로의 GnRH-IR과의 GnRH-FITC 접합체를 시각화 한 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수를 정량.

<table><tbody><tr><td>EBC-1</td><td>JCRB 세포 은행</td><td>JCRB0820</td><td>인간 폐 편평 세포 암종</td></tr><tr><td>BxPC-3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td>인간 췌장 선암</td></tr><tr><td>디트로이트-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-138</td><td>인간 인두 암종</td></tr><tr><td>RPMI-1640 L-글루타민이 있는 배지</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F</td><td>BxPC-3 세포용 배양 배지</td></tr><tr><td>Eagle's Minimum Essential EBC-1</td> 세포를 위한 Medium <td>Lonza</td><td>BE12-611F</td>, <td>그리고 Detroit-562 세포를 위한 0.1% 나트륨 피루베이트로 보충</td></tr>된 <tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Euro Clone</td><td>ECS0180L</td>은 <td></td></tr><tr><td>MycoZap Plus-CL&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>VZA-2012</td><td>는 배양 매체 (항생제)를 보완합니다.</td></tr> <tr><td>표준 라인 세포 배양 플라스크</td><td>VWR</td><td>10062-872</td>는 <td>세포에 일관된, 멸균 성장 환경을 제공합니다</td></tr>. <tr><td>트립신-EDTA 혼합물&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td>부착 된 세포 제거</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS)</td> <td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>용매</td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>용매</td></tr><tr><td>Trypan 블루 솔루션, 0.4 %</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>세포 계수에 사용</td></tr> <tr><td>[D-Lys6(FITC)] -GnRH-I</td><td>made by us</td><td>- </td><td>순도 &ge; 98 % (HPLC)</td></tr> <tr><td>[D-Lys6 (FITC)] -GnRH-II</td>는 <td>us-Purity</td> &ge<td>에 의해 만들어졌다</td><td>; 98 % (HPLC)</td></tr> <tr><td>[Lys 8 (FITC)] -GnRH-III</td><td>미국 제조</td> <td>-</td><td>Purity &ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>유리 바닥 8-well microscopic slide</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>CLSM 실험에 사용</td></tr><tr><td>Corning Costar 세포 배양 플레이트, 12 웰</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3513-50EA</td><td>FACS 실험에 사용</td></tr><tr><td>고정 용액(10% 중성 완충 포르말린)</td><td>Bio-Optica</td><td>01V60P</td><td>부착 세포 고정</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td>항체의 비특이적 결합 방지</td></tr><tr><td>GnRHR Antibody</td><td>Proteintech</td><td>19950-1-AP</td><td>면역세포화학 시약, human type-I GnRH 수용체에</td></tr><tr><td>결합 Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11035</td><td>Immunocytochemistry reagent, 1차 항체에 결합</td></tr><tr><td>Fluorescent probe solution (Draq5)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62254</td><td>카운터스테인 핵</td></tr><tr><td>플루오로마운트 수성 장착 매체</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4680-25ML</td><td>CLSM 실험에서 사용, 형광</td></tr><tr><td>보존 반전 현미경</td><td>Elektro-Optika Ltd.&nbsp;</td><td>Alpha XDS-2T</td><td>세포 배양의 표현형 및 밀도 확인</td></tr><tr><td>반전 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM-710</td><td>CLSM 실험에 사용</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td>FACS 실험에 사용</td></tr></tbody></table>

체외 이미징 및 형광 표지의 gnrh 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

의 GnRH 유사체 효과적인 표적 부분과 선택적으로 악성 종양 세포에있는 높은 표현의 GnRH 수용체에 항암제를 제공 할 수 있습니다. 그러나의 GnRH 유사체 &#39;세포 흡수의 정량 분석의 GnRH 계 약물 전달 시스템의 연구 세포 종류는 현재 제한된다. 이전에 도입, 선택적으로 표지 된 형광의 GnRH I, -II 및 -III 유도체 좋은 검출 감도를 제공하고, 그들은 재현하고 강력한 실험에 적합한 화학적 특성이 있습니다. 우리는 이러한 라벨의 GnRH 유사체에 해당하는 최신 방법은 GnRH에 기반 약물 전달 시스템에 대한 새로운 정보를 제공 할 수있는 것으로 나타났습니다. 의 GnRH-I, [D-리스 6 (FITC)] - -의 GnRH-II와 [리스 8 (FITC)] - GnRH에이 원고는 [D-리스 6 (FITC)]의 세포 흡수에 관한 몇 가지 간단하고 빠른 실험을 소개합니다 EBC-1 (폐)에 -III의 BxPC-3 (췌장)와 디트로이트-562- (인두)에 악성 tumor 세포. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병렬로는 GnRH-I 수용체의 세포 표면 수준은 이전과 공 초점 레이저 주사 현미경으로 GnRH의 처리 후에 이들 세포주를 조사 하였다. 의 GnRH-FITC 접합체의 세포 흡수는 형광 - 활성화 세포 선별에 의해 정량화 하였다. 이러한 실험에서의 GnRH 유사체 및 세포 유형 간의 주요 차이점 중 사소한 차이가 관찰되었다. 세포주 간의 유의 한 차이는 세포 표면의 GnRH-I 수용체의 자신의 고유 한 수준의 상관 관계가있다. 도입 된 실험은 시각화, 정량화 및 각종 접착 세포 배양에 시간과 농도 의존적으로의 GnRH-FITC 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실제적인 방법을 포함한다. 이러한 결과는 소정의 세포 배양에서의 GnRH 접합체 약물 타겟팅 효율을 예측하고, GnRH에 기반 약물 전달 시스템의 시험에서 추가 실험을위한 좋은 기초를 제공 할 수있다.

공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)에 의해 얻어진 영상은 시간 및 농도 의존적으로 주어진 세포 배양에서의 GnRH-FITC 접합체의 흡수에 대한 훌륭한 정보를 제공한다. 이들의 GnRH-FITC 접합체와 병행하여, 세포 표면에의 GnRH-IR의 존재는 CLSM 실험에 의해 검증 가능하다. 또, 원적외선 DNA 염색 형광 프로브를 이용하여, 그것과는 GnRH의 GnRH-IR 외에도 세포의 핵을 Counterstain과 수있다. 공 촛점 이미지 정량화 아니지만 그러나 간단한 &quot;GnRH의 섭취 방법은&quot;쉽게 테스트 셀의 GnRH-FITC 접합체의 더 높거나 낮은 양이 포함되는지 여부를 평가할 수있다. 필요에 따라인가의 GnRH-FITC 접합체 그들의 농도, 처리 시간은,이 방법에서 가변이다. 도 1에 도시 된 바와 같이 다양한 암세포는 농도 의존적으로는 GnRH-FITC 상이한 레벨을 포함한다. </p&gt; <p clas...

선택적으로 표지 된 형광의 GnRH-I는 -II 및 -III 파생 상품은 안정적인 추적을위한 도구와 자신의 세포 흡수를 정량화 있습니다. 이 원고는 시각화, 정량화 및 다양한 세포주에서 이들의 GnRH 접합체의 흡수 효율을 비교하는 실험을 소개합니다.

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

이 실험 절차의 전반적인 목적은 인간 암세포 배양에서 GnRH 기반 약물 전달 시스템의 효능을 조사하고 예측하는 것입니다. 이 방법은 다양한 인간 암 유형의 세포가 GnRH 표적 항암제를 얼마나 효율적으로 흡수하는지와 같이 표적 항암 치료 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 공초점 현미경 관찰과 유세포 분석을 동시에 수행할 수 있도록 하는 새로운 형광 표지 GnRH 유사체를 사용한다는 점입니다.GnRH 수용체는 여러 암세포 유형에서 높게 발현되므로, 본 기술의 영향은 암세포의 선택적 표적화를 가능하게 하여 항암 치료로 확장될 수 있습니다. 실험 과정은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 Bianka Gurbi가 시연하겠습니다. 먼저, 세포가 배양된 마이크로슬라이드의 7개 웰에서 배양액을 제거하십시오.그 다음, 음성 대조군 웰에 미리 가열한 완전 배지 250 µL를 추가하고, 나머지 6개 웰 각각에 미리 가열한 GnRH fit seed 처리 배지 250 µL를 추가합니다. 슬라이드를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 5시간 동안 배양합니다. 5시간의 배양 후, 각 웰에서 배지를 흡입하여 제거하고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다.그 후, 각 웰에 고정액 250 µL를 넣고 슬라이드를 상온에서 10분 동안 배양합니다. 세포가 고정되면 고정액을 제거하고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. PBS로 준비한 5 µM 형광 프로브 용액 250 µL를 각 웰에 넣고 슬라이드를 상온에서 10분 동안 배양합니다.형광 프로브 용액을 제거한 후, 250 µL의 PBS로 세포를 조심스럽게 두 번 세척하십시오. 마지막으로, 각 웰에 마운팅 용액을 3~4방울씩 넣습니다. 현미경으로 촬영할 때까지 슬라이드를 실온의 암소에 보관하십시오.세포가 분주된 마이크로슬라이드의 5개 웰에서 각각 배양액을 제거합니다. 다음으로, 음성 대조군 웰과 처리하지 않은 세포가 들어 있는 두 번째 웰에 미리 가열한 완전 배지 250 µL를 첨가합니다. 나머지 3개 웰의 세포는 10 µM GnRH FITC가 포함된 미리 가열한 처리 배지로 전처리합니다.슬라이드를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다. 그 후, 처리된 세포에서 배지만 제거하고 미리 데운 250 µL의 완전 배지로 세포를 세척합니다. 다음으로, 세척 배지를 제거합니다.그 다음, 미리 가열된 완전 배지 250 µL를 세 개의 웰에 각각 넣습니다. 슬라이드를 37 °C, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 5개 웰의 배지를 모두 제거하고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다.그 다음, PBS를 제거하고 실온에서 250 µL의 고정액으로 10분 동안 세포를 고정합니다. 이어서, 고정액을 버리고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. 각 웰에 250 µL의 블로킹 용액을 넣고 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션합니다.음성 대조군을 제외한 각 웰에서 블로킹 용액을 흡입하여 제거합니다. 250 µL의 PBS로 세포를 세척한 후, 각 웰에 250 µL의 1차 항체 용액을 첨가합니다. 슬라이드를 암소에서 실온으로 1시간 동안 배양합니다.다섯 개의 웰 각각에서 용액을 제거하고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. 그런 다음, PBS를 제거하고 250 µL의 2차 항체 용액을 첨가합니다. 슬라이드를 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다.각 웰에서 용액을 흡입하여 제거하고 250 µL의 PBS로 세포를 세척합니다. 세척에 사용한 PBS를 제거한 후, 5 µM 형광 프로브가 포함된 250 µL의 PBS를 각 웰에 첨가합니다. 슬라이드를 상온에서 10분 동안 배양합니다.각 웰에서 형광 프로브 용액을 제거하고 250 microliters의 PBS로 세포를 조심스럽게 두 번 세척합니다. 마지막으로, 각 웰에 마운팅 매질을 3~4방울 넣습니다. 현미경으로 이미징하기 전까지 슬라이드를 실온의 암소에 보관하십시오.도립 공초점 레이저 주사 현미경으로 세포를 이미징합니다. 488 nanometer 및 633 nanometer 레이저를 켭니다. 레이저 증폭도와 핀홀 크기를 확인합니다.음성 대조군 샘플을 촬영합니다. 핵에서 관찰되는 신호를 최적화하고, FITC 및 Alexa 546의 신호가 0에 가깝도록 조정합니다. 그 후 동일한 파라미터를 사용하여 처리된 샘플들을 촬영합니다.세포가 분주된 배양 플레이트의 7개 웰에서 모든 완전 배지를 제거합니다. 그런 다음, 음성 대조군 웰에 예열된 완전 배지 1 mL를 넣고, 나머지 6개 웰에 예열된 처리 배지 1 mL를 넣습니다. 플레이트를 37 °C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 5시간 동안 배양합니다.모든 웰에서 배지를 제거한 후, 2 mL의 PBS로 세포를 조심스럽게 두 번 세척합니다. PBS를 제거하고 각 웰에 500 µL의 Trypsin EDTA 용액을 첨가합니다. 세포가 떨어져 나올 때까지 37 °C에서 플레이트를 배양하며, 이는 약 10분 정도 소요됩니다.완전 배지 1 mL를 사용하여 각 웰의 Trypsin을 중화시킨 후 플레이트를 흔들어 줍니다. 그 다음, 부드럽게 피펫팅하여 세포를 부유시킵니다. 부유액을 각각의 FACS 튜브로 옮기고, 4 °C에서 150 ×g로 4분 동안 샘플을 원심 분리합니다.상층액을 조심스럽게 따라냅니다. 그런 다음, 각 FACS 튜브에 차가운 PBS 500 µL를 넣고 세포를 부드럽게 재현탁합니다. FACS 분석 전까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.인두암 세포에서의 GnRH 흡수 분석 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 1 µM의 형광 GnRH 복합체로 5시간 동안 처리했을 때, 인두암 세포 내에 국소화된 녹색 형광 신호로 나타나는 약간이지만 구별 가능한 흡수가 관찰되었습니다. 복합체 농도를 추가로 높였을 때 흡수가 증가했으며, 이는 인두암 세포에서 GnRH 흡수가 농도 의존적임을 입증합니다.형광 GnRH 복합체 처리와 1형 GnRH 수용체 및 핵의 염색을 동시에 진행하여, 폐암 세포에서 GnRH의 수용체 의존적 흡수와 수용체 내 리간드의 세포 내 분포를 분석하였습니다. 결과에 따르면 1형 GnRH 수용체는 세포막과 연관되어 있는 반면, GnRH 단백질은 세포 내로 유입되어 세포질에 남아 있는 것으로 나타났습니다. 또한 FACS 분석을 통해 인두암 세포에서의 GnRH 흡수를 연구하였습니다.결과는 세포에 1 µM의 GnRH 접합체를 처리했을 때 관찰된 GnRH 섭취가, 투여 용량을 10 µM로 증가시켰을 때 강력하게 증강됨을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 처리된 시료와 형광 염료를 직사광선으로부터 보호하는 것이 중요함을 기억하십시오.본 절차 이후, GnRH 표적 약물이 특정 암 세포의 성장을 얼마나 효율적으로 억제할 수 있는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 생존율 또는 세포 사멸 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 암 치료 분야의 연구자들이 암 세포에 부착되는 GnRH 기반 약물 전달 시스템의 효능을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 형광 표지된 GnRH 접합체를 사용하여 GnRH 표적 치료에 대한 암 세포의 감수성을 탐구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

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우리는 안티 - 암 치료에 영상 응답하는 방법을...

유방암의 마우스 모델에서 종양 Microenvironment에 약물 응답의 영상을 라​​이브

소설 고해상도<em&gt; 생체 내</em종양의 성장과 치료학에 두개 내 구조물의 동적 응답을 공부하기&gt; 이미징 기술

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

생체 전체 기관 이미징 내에서 조직 또는 치료 군간 형광 표지 된 화합물의 상대적 농도를 결정하기위한 빠른 방법이다. 더욱 노동 집약적 인 반면 반대로 정량적 형광 조직학, 표지 분자의 절대 조직 레벨의 정량을 허용한다.

사용 전의 VIVO 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법

여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.

공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매

이 프로토콜은 포유 동물 세포에서 G 단백질 연결 수용체 (GPCR)의 내재화 초점 현미경 검출을 설명한다. 이것은 기본적인 세포 배양, 형질 전환, 및 공 초점 현미경 절차를 포함하는 융합 발현 GPCR의 세포 내 위치 파악 및 내재화를 검출하는 효율적이고 쉽게 해석 방법을 제공한다.

공 초점 현미경으로 리간드 - 활성화 된 G 단백질 결합 수용체 내재화 검출

우리는 전 임상 생체 내에서 암 전이의 추적에 대 한 프로토콜을 설명합니다. 그것은 비 침략 적 [18F] tetrafluoroborate-애완 동물, 그리고 유선형 비보 전 확인에 대 한 형광 단백질에 의해 감지 나트륨 요오드 화물 symporter 결합 방사성 핵 종 형광 기자를 기반으로 합니다. 방법은 전 임상 vivo에서 세포 종양 생물학 넘어 추적에 적용 합니다.

방사성 핵 종 형광 취재 원 유전자 설치류 종양 모델에서 종양의 진행을 추적 하기 위해 이미징

종양 세포의 Orthotopic intracranial 주사 공부 뇌 종양 생물학, 진행, 진화, 그리고 치료 응답을 암 연구에 사용 되었습니다. 여기 선물이 형광 분자의 단층 촬영 종양 xenografts 실시간 intravital 이미징 및 종양의 정량화 임상 세포종 모델에서 대량 제공.

Vivo에서 이미징 세포종 Xenografts의 형광 분자 단층 촬영

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

GPCR-β-레페틴 상호작용은 GPCR 약물 발견에서 새로운 분야입니다. 정확하고 정확하며 설정하기 쉬운 방법은 살아있는 시스템에서 이러한 상호 작용을 모니터링하는 데 필요합니다. 우리는 GPCR-β-arrestin 상호작용을 실시간 살아있는 세포에서 모니터링하기 위한 구조적 보완 분석방법을 보여주고, 임의의 GPCR까지 확장될 수 있다.

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

당사는 예를 들어 심장 표적 펩타이드를 사용하여 파라핀 임베딩, 단면 및 공초점 형광 현미경 검사법을 선행한 전 생체 이미징 시스템을 활용한 세포 관통 펩티드에 의한 침투 정도를 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리의 프로토콜에서, 단 하나 동물은 동일 기관의 화상 진찰 평가의 두 모형을 취득하기 위하여 이용될 수 있고, 따라서 연구 결과에 필요한 동물의 수를 반으로 삭감합니다.

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

학습하세요 형광 표지된 GnRH 유사체를 이용한 인간 암세포 배양에서의 약물 흡수 정량화 방법입니다. 공초점 현미경과 유세포 분석을 병행하여 표적 항암 치료제의 효율성을 평가하는 기술을 익히세요.

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

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