WinCF 모델 - 폐렴의 미생물학을 연구하기 위해 점액으로 촘촘하게 밀집된 Bronchiole의 저렴하고 견고한 소우주

본 절차의 전반적인 목표는 폐 환경을 모사하여 병원균이 질병을 일으키는 방식과 더 유사한 형태로 배양하는 것입니다. 이 방법은 낭성 섬유증 폐에서 다양한 세균성 병원균이 어떻게 상호작용하는지와 같은 기도 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험 조건을 쉽게 조절할 수 있다는 점입니다.

실제 폐 기관지에서 발생하는 것과 유사한 미생물의 반응을 관찰하기 위해, 본 실험실의 Will Comstock이 해당 절차를 시연하겠습니다. 인공 객담 배지를 준비하려면, 미리 준비한 muceum 스톡 용액 16 mL, 염화칼륨 스톡 용액 2 mL, 염화나트륨 스톡 용액 2 mL, 난황 유제 200 µL, DNA 스톡 용액 5.6 mL, 페리틴 스톡 용액 120 µL, 필수 아미노산 용액 5.78 mL, 비필수 아미노산 용액 5.78 mL, 그리고 멸균수 2.44 mL를 혼합하십시오.

멸균된 인공 객담 배지를 세심하게 제조하는 것은 매우 중요합니다. 오염이 발생할 경우, 이후 단계에서 배양된 모세관 내 박테리아의 활성이 변할 수 있기 때문입니다. 가볍게 흔들어 혼합한 후, 배지 5 mL를 멸균된 15 mL 원심분리 튜브 8개에 각각 분주합니다.

이제 원하는 화학적 조건을 맞추기 위해 배지를 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 제시된 배지들은 각각의 산도를 나타내기 위해 pH를 조절하고 염료를 첨가한 것입니다. 다음으로, 멸균된 바이오후드 내에서 8개의 멸균된 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브 각각에 배지 900 microliters를 넣습니다.

3 mL 주사기를 사용하여 가래를 반복적으로 흡입하고 배출함으로써 가래가 부드러운 점도가 될 때까지 균질화합니다. 균질화된 가래 100 µL를 8개의 마이크로원심분리 튜브에 각각 넣습니다. 그 다음 튜브를 볼텍싱하여 충분히 혼합합니다.

이전에 준비한 미세원심분리관의 배지와 동일하게 8개의 멸균된 15 milliliter 원심분리관에 라벨을 붙입니다. 이 튜브들은 배양 튜브로 사용됩니다. 70% ethanol 용액으로 종이 타월을 소독하고 건조시킵니다.

수건을 가로세로 약 4인치 크기의 조각으로 찢습니다. 그다지 찢은 조각 하나를 각 배양 튜브 바닥에 구겨 넣습니다. 각 배양 튜브 바닥에 종이 뭉치가 하나씩 들어간 상태에서, 멸균수 1 milliliter를 사용하여 각 뭉치를 살짝 적셔 튜브 내부에 습한 환경을 조성합니다.

각 배지 튜브마다, 유리 모세관의 한쪽 끝을 배지에 넣고 수평으로 기울여 배지를 채웁니다. 이때 모세관 현상에 의해 배지가 관 내부로 유입되도록 합니다. 장갑을 낀 손가락으로 관의 열린 끝부분을 살짝 눌러 채우기를 중단한 다음, 관의 다른 쪽 끝을 모세관 퍼티 실란트 블록에 눌러 밀봉합니다.

세 개의 모세관 튜브 한 세트를 15 milliliter 배양 튜브에 퍼티로 밀봉된 면이 아래로 향하게 넣습니다. 그런 다음 튜브의 캡을 닫고 라벨이 부착되었는지 확인합니다. 이 세 개의 모세관 튜브는 각 대조군 조건의 반복 실험을 위한 것입니다.

모든 배양 튜브에 지정된 모세관을 넣었다면, 랙을 37 °C에 배치하십시오. 이때 생성된 가스가 열린 끝단으로 빠져나가지 않도록 튜브를 수평으로 배양해야 합니다. 튜브를 48시간 동안 배양하십시오.

튜브를 수평으로 유지하며 인큐베이터에서 꺼냅니다. 세 개씩 한 세트로 구분하여 인큐베이션 튜브에서 모세관을 조심스럽게 꺼냅니다. 모세관 내부의 내용물이 아래에서 조명되어 잘 보일 수 있도록, 라이트 박스 위에 모세관들을 나란히 정렬합니다.

서로 다른 화학적 조건을 구분하기 위해 튜브 세 개마다 간격을 둡니다. 다음으로, 모든 튜브가 시야에 들어오고 라이트 박스의 빛이 튜브 염료의 색상을 충분히 대조시키고 시각화할 수 있도록 카메라의 초점을 튜브 바로 위에 맞춥니다. 후속 분석을 위해 튜브의 내용물을 추출하려면, 한 번에 세 개로 구성된 모세관 한 세트씩 라이트 박스에서 꺼냅니다. 모세관 튜브의 밀봉된 끝부분에 25 gauge 0.5 inch 뭉툭한 바늘(blunt ended needle)을 삽입하여 밀봉을 제거합니다.

그 다음 모세관을 거꾸로 뒤집어 배지가 상단 부분에서 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 떨어지게 합니다. 배지가 흘러나오지 않을 경우, 200 µL 피펫을 모세관 끝에 삽입한 후 피펫 플런저를 눌러 배지를 밀어냅니다. 여기에서 보시는 것처럼, 배지에 객담 샘플을 추가하지 않았을 때 48시간 배양 후 pH 스펙트럼 전반에서 나타난 유일한 변화는 약간의 증발로 인한 배지 부피의 소폭 감소였습니다.

접종된 모세관 튜브에서는 부피의 변화, 기포의 발생, 색상 변화 및 불투명한 침전물의 형성이 관찰되었습니다. 이러한 결과는 첨가된 객담 내에 포함된 박테리아 및 기타 미생물이 인공 배지 내에서 성장하고 변화할 수 있음을 보여줍니다. 배양 후에는 모세관 튜브에서 성장한 미생물의 거동에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 대사체학 및 DNA 시퀀싱과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

winCF 시스템은 낭성 섬유증(CF), 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식 및 기타 여러 질환에서 중요한 폐 마이크로바이옴의 활성을 연구하기 위한 새로운 방법입니다.