Name: 기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T11:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 배우세요 세포 노화를 유도하고 정량화하는 방법을 다양한 세포 모델에서 적용할 수 있는 프로토콜을 통해. 이 기술은 노화 연구와 관련 질환 이해에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램, 노화에 국립 연구소에 의해 지원되었다. 저자는 또한 비판적 원고를 읽기위한 노화 및 Kotb Abdelmohsen에 대해 많은 도움이 토론 미리암 고로스페 및 Kotb Abdelmohsen을 감사드립니다. 우리는 또한 비판적 원고를 읽기 위해, 특히 더글러스 Dluzen 우리의 실험실 구성원 감사합니다.

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<li>Dimri, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).</li>
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<li>Tominaga-Yamanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF90+coordinately+represses+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype.</a> Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).</li>
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<li>Hoare, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOTCH1+mediates+a+switch+between+two+distinct+secretomes+during+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence.</a> Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).</li>
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<li>Abdelmohsen, K., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+control+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA control of cellular senescence.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).</li>
<li>Bhaumik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-146a%2Fb+negatively+modulate+the+senescence-associated+inflammatory+mediators+IL-6+and+IL-8%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8.</a> Aging. 1 (4), 402-411 (2009).</li>
<li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-SCARS%3A+distinct+nuclear+structures+that+sustain+damage-induced+senescence+growth+arrest+and+inflammatory+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion.</a> J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).</li>
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<li>Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+the+Senescent+Phenotype+from+Telomere+Shortening+in+Hydrogen+Peroxide-Treated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts.</a> Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
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<li>Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+p16%28ink4a%29+expression+in+tumors%3A+functional+significance%2C+clinical+associations+and+future+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments.</a> Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
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<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Essential+Role+for+Senescent+Cells+in+Optimal+Wound+Healing+through+Secretion+of+PDGF-AA%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA.</a> Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).</li>
<li>Noren Hooten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin-mediated+increase+in+DICER1+regulates+microRNA+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence.</a> Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).</li>
<li>Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+as+a+Tool+to+Target+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin as a Tool to Target Aging.</a> Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).</li>
<li>Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin%3A+from+mechanisms+of+action+to+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Metformin: from mechanisms of action to therapies.</a> Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).</li>
<li>Cahu, J., Sola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+to+quantify+senescent+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A sensitive method to quantify senescent cancer cells.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).</li>
<li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li>
<li>Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+detection+of+senescence-associated+beta+galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase.</a> Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).</li>
<li>Redon, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-H2AX+detection+in+peripheral+blood+lymphocytes%2C+splenocytes%2C+bone+marrow%2C+xenografts%2C+and+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin.</a> Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Kennedy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+mouse+cells+fail+to+overtly+regulate+the+HIRA+histone+chaperone+and+do+not+form+robust+Senescence+Associated+Heterochromatin+Foci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci.</a> Cell Div. 5, 16(2010).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기에서는 인간의 배수체 섬유 아세포를 이용하여 복제 성 및 DNA 손상 - ​​유도 노화에 대한 방법을 설명 하였다. 또한, 다양한 단백질 및 노화 관련 단백질의 mRNA 수준을 정량화하기위한 기술이 포함될뿐만 아니라, 염색 SA-β-gal을위한 상기 DNA 손상 - ​​마커 γ-H2AX위한 것이다. 많은주의가 생체 (20)에 노화의 특성이 존재하지만,이 프로토콜은 널리 생체 외 및 생체 내에서 모두 노화 표현형을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 다른 세포들이 노화 된 세포없는 경우에도, 노화 마커를 표현할 수 있습니다. 예를 들면, 파골 세포 및 대 식세포와 같은 세포는 β-gal을 활성 (32, 33)보다 높은 수준을 갖는다. 또한, 많은 암 세포는 P16의 INK4A (34)을 상향 조절했다. 세포는 DN...

반 세기 이상 전 헤이 플릭와 동료들은 문화 확산 방법 변형되지 않은 세포를 설명하지만, 시간이 1 만 한정된 기간 동안. 인간의 섬유 아 세포의 장기 배양이 확산 막을 수있는 세포를 발생; 그러나, 그들은 대사 활동했고, 이것은 세포 노화라고했다. 노화 종양 억제에 도움이 될 수 있지만,이 에이징 (2, 3)에 발생하는 회생 용량의 감소에 기여하는 것으로 생각된다으로도 불리 할 수있다. 노화 세포는 4 세를 인간과 배아 발달, 상처 치료, 조직 복구 및 나이와 관련된 염증이 포함 생물학적 과정의 숫자에 연루되어있다으로 조직에 축적하는 것으로 나타났다. 문화에 세포의 지속적인 계대이 연결되었습니다 복제 성 노화를 유도마찰과 게놈의 불안정성을 텔로미어합니다. DNA 손상과 암 유전자를 포함한 다양한 세포 스트레스는 또한 노화 3가 발생할 수 있습니다. 텔로미어 (telomere)의 감소가 아닌 다른 요인에 의한 노화는 종종 스트레스 유발 또는 조기 노화라고 일반적으로 P16의 INK4A / Rb는 경로 (5)에 따라 결정된다. 증식 있지만, 형질 전환되지 않은 세포는 일반적으로 형상 스핀들 표시, 노화 세포는 특정 특성을 갖는 평평하고 넓은 형태 증가 노화 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을) (도 1 및 2)를 포함하는 것으로 식별 될 수있다. 노화 세포는 γ-H2AX (도 3) (6), 및 잠재적으로 노화 관련 이질 병소 (SAHF) (도 4) (7)을 포함하여, DNA 손상 마커 축적된다. 노화 세포는 P를 포함하는 세포주기 규제의 높은 수준을 가지고<html> 16 (P16의 INK4A) 및 / 또는 (P21) 및 p53의 (도 5) (8, 9). 또한, 최근의 데이터는 노화 세포는 염증성 사이토 카인 및 케모카인 중 다수를 분비하여 비 - 자율적 인 영향을 미칠 수있는 노화 - 관련 분비 표현형 (SASP) 10이라고 나타났다. 이 SASP 현상이 셀 타입에 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로는 인터류킨 -6 (IL-6), IL-8, 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 성장 -의 증가에 의해 증명된다 종양 유전자의 조절 α (GRO-α), 및 β-GRO, 그 중에서도 (도 6). 노화를 유도 특정 응력이나 손상도 분비 표현형 11, 12, 13에 영향을 미칠 수있다. SASP는 ELISA를 카인 / 단백질 어레이를 사용하는 분비 단백질의 수준을 측정함으로써 검출 될 수있다S = &quot;외부 참조&quot;&gt; 10, 14. 전사 후 메커니즘 SASP 단백질 농도 11 조절할 수 있지만, 15, 16, 17 mRNA 수준의 변화 또한 많은 경우에 검출 될 수있다. 이러한 변화는 일반적으로 더 민감하고 단백질 수준 측정보다 정량화하기 쉽다. 기타 노화 마커는 영속 DNA 손상 병소 핵 노화 (DNA-SCARS) (18)을 보강 염색질 변형 불려 DNA 세그먼트, 및 다양한 다른 마커 3, 19, 20을 포함하여 평가할 수있다. 여기서는 SA-β-갈, γ-H2AX, SAHF 포함한 노화 여러 마커를 측정하는 또 배양 세포에서 노화를 유도하고 공통 기술을 설명하고 senesce의 단백질 및 mRNA를NCE 분자가 회합.

<table><tbody><tr><td>16% 트리스-글리신 겔</td><td>Invitrogen</td><td>XP00160BOX</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol ChCl3</td><td>Ambion</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 568 염소 안티 마우스 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11031</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>세포 리프터</td><td>Corning Inc.</td><td>3008</td><td>셀 스크레이퍼</td></tr><tr><td>ECL 안티 마우스 HRP 연결 항체</td><td>Amersham</td><td>NA931V</td><td></td></tr><tr><td>ECL Plus Western Blotting Substrate</td><td>Pierce</td><td>32132</td><td>ECL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>MP01306</td><td>재고 5 mg/mL in dH2O</td></tr><tr><td>GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32233</td><td>1:1,000 - 5,000 희석</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>히스톤 H3 디메틸 K9 단클론 항체</td><td>Abcam</td><td>1220</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>인간 IL-6 Quantikine ELISA 분석</td><td>R & D 시스템</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>인간 IL-8 퀀티킨 ELISA 분석</td><td>R& D 체계</td><td>D8000C</td><td></td></tr><tr><td>인간적인 GROa Quantikine ELISA 분석실험</td><td>R& D 시스템</td><td>DRG00</td><td></td></tr><tr><td>N-N-디메틸포름아미드&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td>DMF</td></tr><tr><td>p16 단클론 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>51-1325gr</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>p21 단클론 항체</td><td>Millipore</td><td>05-345</td><td>1:750 희석</td></tr><tr><td>p53 단클론 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td>1:500 희석 클론 DO-1</td></tr><tr><td>phospho-H2AX (Ser139) FITC 접합 항체</td><td>세포 신호</td><td>9719</td><td>1:2,000 희석</td></tr><tr><td>POWER SYBR-green PCR 마스터 믹스&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>사전 염색된 분자량 마커</td><td>Biorad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>노화 &베타;-갈락토시다아제 염색 키트</td><td>세포 신호 전달</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Ambion/Life Tech</td><td>10296028</td><td></td></tr></tbody></table>

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

세포 스트레스 또는 손상에 대한 응답으로 증식하는 세포는 세포 노화이라고 장기 세포주기 정지의 상태를 개시하는 특정 프로그램을 유도 할 수 있습니다. 노화 세포의 축적은 생명체의 노화와 체외에서 계속 배양을 통해 발생합니다. 노화 세포는 배아 발달, 조직 복구 및 재생, 종양 억제, 노화 등 많은 생물학적 과정을, 영향을 미친다. 노화 세포의 특징을 포함하지만, 증가 된 노화 - 관련 β 갈 락토시다 제 활성 (SA-β-gal을)에 한정되지 않는다; P16의 INK4A, p53의, 그리고 P21 수준; γ-H2AX을 포함하여 DNA 손상의 높은 수준; 노화 관련 이질 병소 (SAHF)의 형성; 및 노화 관련 분비 표현형 (SASP), 염증성 사이토 카인 시그널링 분자의 수 분비를 특징으로하는 현상 획득. 여기, 우리가 모두 복제 성을위한 프로토콜을 설명하고DNA의 배양 세포에 노화를 유발 손상. 또, SA-β-gal을, γ-H2AX 및 SAHF 얼룩 등 여러 노화 - 관련 마커를 이용한 노화의 표현형을 모니터링하고, 세포주기 조절제 및 SASP 인자 단백질의 mRNA 수준을 정량화하는 방법을 강조. 이 방법은 다양한 모델과 조직에서 노화의 평가에 적용 할 수 있습니다.

6 SA-β-gal을 염색에서 대표적인 결과를 보여준다 - 2도 γ-H2AX 및 SAHF위한 염색; P16의 INK4A, P21 및 p53의 단백질 수준의 평가; 및 mRNA의 노화와 관련된 분자의 단백질 수준. 증가 된 SA-β-gal을 염색 및 복제 성 DNA 손상 - ​​유도 노화 발생. 또한, 노화와 함께 일어나는 형태 학적 변화를 관찰한다. 세포는 섬유 아세포 증식 스핀들 외관에 비해 확대 된 평면이된다. 본 실험 패러다임, 세포를 염색하고, RNA / 단백질 IR 노광 후 7 (D)를 분리 하였다. 더 강력한 결과는 IR 노출 (예 : 10 D) 후 이상 대기에 의해 발생할 수 있습니다. 조건은 각 조건 및 실험 장치에 대해 결정해야합니다. 이들 결과는 대표적인 노화 및 다른 방법을 사용하여 유도 될 때 이러한 마커는 검출 할 수있다. <p class="j...

세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

이러한 기술의 전반적인 목표는 세포 노화의 유도, 모니터링 및 정량화를 가능하게 하는 도구 상자를 제공하는 것입니다. 이러한 방법은 세포 노화의 식별 및 정량화와 세포 및 유기체 노화를 조절하는 생물학적 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 다양한 모델, 조직 및 세포 유형에서 세포 노화를 모니터링하는 다양한 방법을 포함한다는 것입니다.분석을 위한 적절한 접시에 희박한 밀도로 관심 있는 초기 계대 증식 세포를 도금하는 것으로 시작합니다. 그리고 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 세포가 50-60% 합류할 때 성장 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.두 번째 세척 후 PBS의 얇은 층으로 세포를 덮습니다. 그리고 세포를 10등급 감마선 조사에 1회 노출시킵니다. PBS를 성장 배지로 교체합니다.그리고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 48-72시간마다 배지를 교체하고 광학 현미경으로 형태학적 변화를 매일 모니터링합니다. 방사선 조사 후 7-10일 후에 시판되는 노화 관련 베타-갈락토시다아제 분석 키트의 모든 시약을 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다.모든 시약이 실온에 도달하면 제조업체의 지침에 따라 정착 용액 및 염색 용액을 준비합니다. 그리고 실온의 PBS로 각 우물을 부드럽게 씻으십시오. 노화 세포는 잘 부착되지 않고 세척 중에 쉽게 제거될 수 있으므로 세포를 조심스럽게 헹굽니다.각 웰의 세포를 실온에서 10-15분 동안 웰당 1ml의 고착 용액으로 고정합니다. 그 후 웰당 PBS로 2밀리리터 세척을 두 번 합니다. 다음으로, 각 웰에 1ml의 베타-갈락토시다아제 염색 용액을 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양합니다.24 시간에 세포를 확인하십시오. 세포가 충분히 염색되면 베타갈 용액을 새 PBS로 교체하고 10x 이상의 대물렌즈에서 카메라가 부착된 광학 현미경으로 배양물을 검사합니다. 노화와 관련된 베타-갈락토시다아제 세포는 파란색으로 나타납니다.그런 다음 웰당 최소 5개의 겹치지 않는 이미지를 얻습니다. 그리고 노화 관련 베타-갈락토시다아제 양성 세포의 총 수와 이미지당 총 세포 수를 수동으로 계산하여 웰당 노화 관련 베타-갈락토시다아제 세포의 비율을 계산합니다. 감마선 조사 10일 후 PBS로 세포를 3회 세척합니다.마지막 세척 후 PBS를 6cm 접시당 항생제를 보충한 2.5ml의 무혈청 배지로 교체하고 세포를 밤새 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음날 아침, 매체를 얼음 위의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그리고 신선한 PBS로 세포를 두 번 씻으십시오.그런 다음 세포를 트립시니제이션하고 계산합니다. 다음으로, 세포 배양 플레이트에서 수확한 상등액을 원심분리합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 스트레이너를 통해 여과하고 ELISA에 의한 분석이 완료될 때까지 섭씨 80도의 500마이크로리터 분취액에서 매체를 동결합니다.노화 증가와 관련된 베타갈 염색은 복제 및 DNA 손상으로 인한 노화로 발생합니다. 증식하는 섬유아세포(fibroblasts)의 방추형(spindle)과 같은 모습과 비교하여 노화 세포(senescent cell)의 확대된 평평한 모양에 주목하십시오. 이 실험에서는 증식하는 젊거나 복제되는 노화 세포를 서면 프로토콜에 설명된 대로 고정했습니다.그리고 DNA 이중 가닥 절단 및 DAPI에 대한 바이오 마커에 대한 항체로 염색되었습니다. 노화 세포에서 관찰된 DNA 이중 가닥 절단 fosi의 수가 명백히 증가했습니다. 노화 관련 분비 표현형 인자에 대한 RT-qPCR 분석은 mRNA 수준에서 저계대 인간 이배체 섬유아세포에서 감마선 조사가 노화를 유도한 후 적어도 일부 요인이 상향 조절되는 것을 보여줍니다.이는 감마선에 조사된 세포 배양 상등액의 ELISA에 의해 추가로 확인됩니다. 일단 마스터하면 DNA 손상 유도 및 SA 베타갈 염색은 약 30분의 수작업 시간으로 완료할 수 있습니다. SASP 단백질 수준을 정량화하기 위한 상태 매체는 약 30분 내에 준비할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 노화 마커 정량화를 진행하기 전에 세포 배양에서 형태학적 변화를 겪는 것을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이러한 기술은 노화 및 암 분야의 연구자들이 다양한 조직, 세포 배양 및 모델 유기체의 노화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 노화를 유도, 모니터링 및 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

여기 선물이 모두 노화를 감지 하는 상세한 프로토콜 및 만능 줄기 세포 유도 vivo에서 프로그래밍 하는 동안 부상에 골격 근육. 이 메서드는 조직 재생성 하는 동안 세포 노화의 역할을 평가 하 고 vivo에서프로그래밍에 적합 합니다.

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

여기, 우리 유도 대 한 프로토콜의 시리즈 및 경작된 한 세포에 세포 노화의 유효성 검사를 설명합니다. 우리는 다른 노화 유도 자극에 집중 하 고 일반적인 노화 관련 마커의 정량화를 설명. 우리 모델, 섬유 아 세포를 사용 하 여 기술 정보를 제공 하지만 프로토콜은 다양 한 휴대 전화 모델에 적용할 수 있습니다.

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

세포내 선생님 세포 노화의 유도에 중요 한 역할을 보여줘 왔다. 여기, 우리는 세포 노화 중 선생님 수준 측정을 위한 중요 한 분석 결과 설명 합니다. 우리는 또한 노화 관련 분 비 표현 형, 다양 한 연령과 관련 된 장애에 기여 하는 보도 평가 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다.

Oncogene 유도 노화 중 반응성 산소 종 및 정상적인 인간 섬유 아 세포에서 분 비 형 노화 관련의 정량적 측정

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

이 논문은 IMR-90 인간 섬유아세포에서 노화 과정에서 리소좀 재형성을 측정하기 위한 생세포 LysoTracker 프로토콜을 제시합니다.

인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

이 방법은 노화된 피부 섬유아세포가 건강한 피부에 미치는 영향을 연구합니다. 노화는 UVB 노출로 유도되며, 조절된 배지를 정상적인 섬유아세포에 적용합니다. 피부 노화 과정에서 세포 간 소통 변화를 표적으로 하는 생리활성 화합물을 평가하는 데 도움을 줍니다.

노화 세포에서 조건화된 배지를 이용한 시험 관 내 모델 내 건강한 세포 간 소통 복원을 위한 항산화제의 새로운 조합

배우세요 세포 노화를 유도하고 정량화하는 방법을 다양한 세포 모델에서 적용할 수 있는 프로토콜을 통해. 이 기술은 노화 연구와 관련 질환 이해에 필수적인 도구를 제공합니다.

기술은 유도 및 정량화 세포 노화하기

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