May 1st, 2017
세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.
이러한 기술의 전반적인 목표는 세포 노화의 유도, 모니터링 및 정량화를 가능하게 하는 도구 상자를 제공하는 것입니다. 이러한 방법은 세포 노화의 식별 및 정량화와 세포 및 유기체 노화를 조절하는 생물학적 요인에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 기술의 주요 장점은 다양한 모델, 조직 및 세포 유형에서 세포 노화를 모니터링하는 다양한 방법을 포함한다는 것입니다.
분석을 위한 적절한 접시에 희박한 밀도로 관심 있는 초기 계대 증식 세포를 도금하는 것으로 시작합니다. 그리고 조직 배양 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다. 세포가 50-60% 합류할 때 성장 배지를 흡인하고 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
두 번째 세척 후 PBS의 얇은 층으로 세포를 덮습니다. 그리고 세포를 10등급 감마선 조사에 1회 노출시킵니다. PBS를 성장 배지로 교체합니다.
그리고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 48-72시간마다 배지를 교체하고 광학 현미경으로 형태학적 변화를 매일 모니터링합니다. 방사선 조사 후 7-10일 후에 시판되는 노화 관련 베타-갈락토시다아제 분석 키트의 모든 시약을 섭씨 37도의 수조에서 해동합니다.
모든 시약이 실온에 도달하면 제조업체의 지침에 따라 정착 용액 및 염색 용액을 준비합니다. 그리고 실온의 PBS로 각 우물을 부드럽게 씻으십시오. 노화 세포는 잘 부착되지 않고 세척 중에 쉽게 제거될 수 있으므로 세포를 조심스럽게 헹굽니다.
각 웰의 세포를 실온에서 10-15분 동안 웰당 1ml의 고착 용액으로 고정합니다. 그 후 웰당 PBS로 2밀리리터 세척을 두 번 합니다. 다음으로, 각 웰에 1ml의 베타-갈락토시다아제 염색 용액을 추가하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 이산화탄소가 없는 섭씨 37도의 인큐베이터에서 24-48시간 동안 배양합니다.
24 시간에 세포를 확인하십시오. 세포가 충분히 염색되면 베타갈 용액을 새 PBS로 교체하고 10x 이상의 대물렌즈에서 카메라가 부착된 광학 현미경으로 배양물을 검사합니다. 노화와 관련된 베타-갈락토시다아제 세포는 파란색으로 나타납니다.
그런 다음 웰당 최소 5개의 겹치지 않는 이미지를 얻습니다. 그리고 노화 관련 베타-갈락토시다아제 양성 세포의 총 수와 이미지당 총 세포 수를 수동으로 계산하여 웰당 노화 관련 베타-갈락토시다아제 세포의 비율을 계산합니다. 감마선 조사 10일 후 PBS로 세포를 3회 세척합니다.
마지막 세척 후 PBS를 6cm 접시당 항생제를 보충한 2.5ml의 무혈청 배지로 교체하고 세포를 밤새 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 다음날 아침, 매체를 얼음 위의 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그리고 신선한 PBS로 세포를 두 번 씻으십시오.
그런 다음 세포를 트립시니제이션하고 계산합니다. 다음으로, 세포 배양 플레이트에서 수확한 상등액을 원심분리합니다. 그런 다음 0.45마이크로미터 주사기 스트레이너를 통해 여과하고 ELISA에 의한 분석이 완료될 때까지 섭씨 80도의 500마이크로리터 분취액에서 매체를 동결합니다.
노화 증가와 관련된 베타갈 염색은 복제 및 DNA 손상으로 인한 노화로 발생합니다. 증식하는 섬유아세포(fibroblasts)의 방추형(spindle)과 같은 모습과 비교하여 노화 세포(senescent cell)의 확대된 평평한 모양에 주목하십시오. 이 실험에서는 증식하는 젊거나 복제되는 노화 세포를 서면 프로토콜에 설명된 대로 고정했습니다.
그리고 DNA 이중 가닥 절단 및 DAPI에 대한 바이오 마커에 대한 항체로 염색되었습니다. 노화 세포에서 관찰된 DNA 이중 가닥 절단 fosi의 수가 명백히 증가했습니다. 노화 관련 분비 표현형 인자에 대한 RT-qPCR 분석은 mRNA 수준에서 저계대 인간 이배체 섬유아세포에서 감마선 조사가 노화를 유도한 후 적어도 일부 요인이 상향 조절되는 것을 보여줍니다.
이는 감마선에 조사된 세포 배양 상등액의 ELISA에 의해 추가로 확인됩니다. 일단 마스터하면 DNA 손상 유도 및 SA 베타갈 염색은 약 30분의 수작업 시간으로 완료할 수 있습니다. SASP 단백질 수준을 정량화하기 위한 상태 매체는 약 30분 내에 준비할 수 있습니다.
이 절차를 시도하는 동안 노화 마커 정량화를 진행하기 전에 세포 배양에서 형태학적 변화를 겪는 것을 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후 이러한 기술은 노화 및 암 분야의 연구자들이 다양한 조직, 세포 배양 및 모델 유기체의 노화를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포 노화를 유도, 모니터링 및 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 기사는 세포 노화를 유도하는 프로토콜과 노화 마커를 평가하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 세포 노화의 모니터링 및 정량화를 용이하게 하고, 노화에 영향을 미치는 생물학적 요인에 대한 통찰을 제공합니다.
Robust induction and quantification of cellular senescence is critical for de-risking early discovery programs targeting aging, tissue regeneration, and tumor suppression pathways. These techniques enable precise identification of senescent phenotypes, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. Standardized senescence assays facilitate cross-program comparability and portfolio triage in preclinical research.
Senescence induction and quantification methods integrate at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development.