코튼 면화씨 벌레의 Densovirus의 호스트 피트니스에 호스트 조직 배포, 전송 모드 및 효과 조사를위한 프로토콜

이 프로토콜의 전반적인 목표는 덴소바이러스(HaDV2)가 숙주인 코튼 볼웜(Cotton Bollworm)에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이 방법은 바이러스 숙주 상호 작용 필드의 주요 질문, 예를 들어 현재 경로에 서 있는 바이러스가 숙주에 미치는 영향과 같은 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유충이 바이러스 양성 및 음성 균주를 구성하는 데 사용하는 이 기술의 주요 장점은 동일한 par-ne-co-host에서 파생되어 동일한 유전적 배경을 보장합니다.

실험을 시작하기 위해, 통풍이 잘되고 난자 위치 기질 역할을하기 위해 면 거즈로 덮인 한 쌍 당 플라스틱 케이지를 사용하여 새로 둘러싸인 나방을 8 쌍으로 짝짓기합니다. 바이러스가 없는 군체를 얻을 가능성을 높이려면 최소 30쌍의 단일 쌍 짝짓기를 활용하십시오. 성충 나방에게 설탕 10%와 비타민 2%를 적신 면봉을 먹이고 매일 용액을 보충하십시오.

오늘날의 짝짓기 후, 암컷 성인이 면봉 거즈에 알을 낳으면 매일 거즈를 교체하기 시작합니다. 알이 부화할 때까지 성인 나방과 같은 성장실에서 거즈가 포함된 알을 수집하고 유지하십시오. 새로 부화한 유충을 우물당 한 마리씩 새로운 24웰 플레이트로 즉시 옮깁니다.

첫 번째 알을 낳은 날로부터 5일 후, 부모 나방을 모아 액체 질소에 보관합니다. 특정 프라이머와 함께 PCR을 사용하여 부모의 HaDV2를 확인하고, HaDV2가 없는 개체를 HaDV2가 없는 비감염 균주로 유지합니다. 성충 나방을 개별적으로 모아 즉시 액체 질소에 보관하십시오.

수집된 개별 나방을 멸균된 모르타르와 유봉을 사용하여 액체 질소로 완전히 분쇄합니다. 약 10마이크로그램의 파편을 깨끗한 1.5ml 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 남은 파편을 새 튜브로 옮긴 다음 즉시 섭씨 80도에서 보관하십시오.

제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 10마이크로그램의 파편에서 DNA를 추출합니다. 나방 DNA가 분리되면 프로토콜을 사용하여 HaDV2를 확인합니다. 결과에 따라 나머지 잔해를 HaDV2 양성과 HaDV2 음성의 두 그룹으로 나눕니다.

각 개인에게 1ml의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 남아 있는 유충 잔해를 완전히 용해시킵니다. 원심분리기를 섭씨 4도로 예냉각한 다음 균질산염을 회전시킵니다. 얼음 위에서 0.22 미크론 멤브레인 필터로 액체 상층액을 여과합니다.

여과된 액체의 튜브당 200마이크로리터를 모으고 즉시 섭씨 80도에서 보관하십시오. HaDV2가 포함된 액체를 희석하여 농도가 다른 다른 여과된 액체에 감염된 구강 감염 효율을 측정하기 위해. 흄 후드에 각 농도에 대해 여과된 액체가 포함된 200마이크로리터의 HaDV2를 고체 인공 사료 표면에 고르게 펴 바릅니다.

다음으로, 갓 부화한 유충 100마리를 페트리 접시에 인공 사료가 포함된 HaDV2로 옮기기 시작합니다. 갓 부화한 유충을 포함한 면 거즈를 부드럽게 두드려 거즈의 유충을 흰 종이로 옮깁니다. 유충이 실크를 회전시키고 종이에서 풍선을 일으키도록 종이를 부드럽게 두드립니다.

살균 된 집게를 사용하여 실크를 만지고 유충을 페트리 접시로 옮깁니다. 48시간 후, 인공 사료에 투여된 웰당 하나의 개별 유충을 24웰 플레이트로 옮깁니다. HaDV2를 접종한 유충을 성충기까지 동일한 농도를 사용하여 다시 접종합니다.

프로토콜을 사용하여 성인의 HaDV2 감염 상태를 확인합니다. HaDV2를 마이크로리터당 10에서 8번째 복제 횟수로 접종한 성인은 100% 감염을 보였으며 HaDV2 양성 균주로 유지됩니다. 오염을 방지하려면 집게와 가위를 75% 에탄올에 3회 소독한 다음 알코올 램프의 불꽃으로 가열합니다.

분석 저울을 사용하여 조직을 보관하는 데 사용할 빈 튜브의 무게를 측정합니다. 다음으로 감염된 균주의 유충과 성충 나방을 약 5분 동안 얼음 위에 놓습니다. 머리와 마지막 복부 분절 근처의 분절 간막에 삽입된 두 개의 곤충 핀을 사용하여 낭광종에 얼어붙은 유충을 고정합니다.

그런 다음 뒤쪽 복부에서 유충의 앞다리를 잘라 혈림프가 흘러 나오도록합니다. 피펫을 사용하여 약 10초 이내에 약 10마이크로리터의 유충 혈림프를 피펫으로 분사하여 혈림프의 갈변 및 응고를 방지합니다. 가위로 마지막 분절간막에서 머리에 이르는 큐티클을 절개합니다.

두 개의 집게를 사용하여 앞창자, 중창자, 뒷창자, 지방체 및 말피기안 세뇨관을 해부합니다. 박리 중 혈림프로 인한 잔여 조직의 오염을 방지하기 위해 절개된 조직을 PBS 완충액으로 세척합니다. 세 사람의 조직 샘플을 하나의 리플리컨트로 함께 혼합합니다.

즉시 각 조직을 액체 질소의 튜브로 옮깁니다. PBS 완충액이 들어 있는 깨끗한 페트리 접시에서 성인 여성과 남성의 조직을 해부하고 즉시 각 조직을 액체 질소의 튜브로 옮깁니다. 튜브와 위의 조직을 함께 따로 무게를 측정하고 조직의 질량을 계산합니다.

이러한 조직에서 DNA를 추출하고 kPCR을 수행하여 각 조직의 바이러스 역가를 정량화합니다. 최소 100마리의 번데기 또는 감염되지 않은 균주에서 파생된 새로 출현한 성체 나방을 면 거즈로 덮인 5리터 철망 케이지에 넣습니다. 이틀 후, 짝짓기 한 성인 암컷은 면봉에 알을 낳기 시작합니다.

계란이 들어있는 면 거즈를 모아 유지하십시오. 감염되지 않은 균주의 신생아 유충을 HaDV2가 함유된 인공사료로 옮겨 감염된 균주를 확립함으로써 신생아 유충 접종을 진행한다. 마찬가지로, 신생아 유충을 HaDV2가 없는 여과된 액체로 덮인 인공 사료로 옮겨 대조군, 즉 감염되지 않은 균주를 확립합니다.

각 처리에 최소 240마리의 유충을 포함합니다. 48시간 후 웰당 하나의 개별 유충을 24웰 플레이트로 옮깁니다. 각 우물에 있는 각 유충에 순차적으로 번호를 매기고 인스타 단계와 생존 상태를 매일 기록합니다.

약 5일 후, 인공 식단이 악화되면 동시에 이 개인을 신선한 인공 식단이 들어 있는 새로운 24웰 플레이트로 옮깁니다. 분석 저울을 사용하여 7일째부터 11일째까지 유충의 무게를 잰다. 무게를 잰 후 유충을 개별적으로 24웰 플레이트에 다시 넣습니다.

부화 후 약 10일 후에 다섯 번째 인스타로 털갈이를 하면 유충을 유리관으로 옮깁니다. 매일 같은 시간에 개인을 유리관으로 옮깁니다. 다섯 번째 instar 유충은 머리 캡슐의 너비로도 식별할 수 있습니다.

다음으로, 페인트나 마커를 사용하여 유리관에 원래 참조 번호로 각 유충을 코드화합니다. 유충 상태를 매일 기록하십시오. 유리관에 각 개체의 번데기와 번데기 날짜를 기록하고 3일 된 번데기의 질량을 기록합니다.

eclosion 후에, 10%sucrose 및 2%vitamin 해결책을 가진 단 하나 감금소로 1명의 여성 및 1명의 수컷을 두십시오. 매일 자당 용액을 보충하십시오. 각 나방의 사망 날짜를 기록하십시오.

달걀을 낳을 때는 매일 면봉을 갈아주세요. 즉시 달걀의 수를 세십시오. 마지막으로, 새로 부화한 자손이 부화하는 동안 세십시오.

실험에 사용된 표본의 품질을 보장하기 위해 Tri-als를 실행했습니다. HaDV2가 없는 수컷과 암컷 부모의 자손은 감염되지 않은 균주로 사육되었습니다. 동일한 DNA 주형을 사용하여 부모와 자손에서 액틴 유전자를 성공적으로 증폭시켰으며, 이는 DNA 주형의 품질이 양호하다는 것을 시사합니다.

무작위로 선택된 8개의 자손은 HaDV2, HaNPV 및 Wolbachia가 없었습니다. 시작 물질의 품질 로그와 획득한 CT 값 사이의 관계를 정의하는 표준 곡선은 CT 값과 HaDV2의 초기 유전자 복제 수 로그 사이에 강한 선형 상관관계를 보여줍니다. HaDV2 복제 수는 각 조직의 마이크로그램 단위로 계산되었으며, 특정 조직에 대한 전체 HaDV2 역가의 백분율은 HaDV2가 주로 지방체에 분포하는 것으로 나타났습니다.

이 절차를 시도하는 동안 연약한 유충이 부화한 후 처음 5일 동안 타이어 절차 중에 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.