포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

이 실험의 전반적인 목표는 외인성 스트레스에 대한 반응으로 스트레스 과립을 형성하는 숙주 세포의 능력에 대한 박테리아 감염의 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 주어진 병원체가 전체 응력 과립 경로를 변경하거나 전복시킬 수 있는지 여부를 평가하기 위한 세포 미생물학 분야에서 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 무료 이미지 분석 프로그램을 사용하여 엄격하고 자동화된 방식으로 응력 과립을 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 응력 과립 형성 및 조성의 역학과 이러한 매개변수가 특정 병원체에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 통찰력을 제공합니다. 감사합니다. 챌린지를 시작하기 전에 갓 자른 트립틱 소이 한천 1%콩고 레드 한천 플레이트에서 8ml의 트립틱 소이 육수가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 빨간색 S.flexneri M90T 박테리아 군집을 접종합니다.

뚜껑을 조인 후 222RPM과 섭씨 30도에서 흔들면서 밤새 군체를 배양합니다. 다음날, 섭씨 37도 및 222RPM에서 약 2시간 동안 8ml의 신선한 트립틱 콩 육수에 150마이크로리터의 박테리아를 계대배양하여 독성 유전자 발현의 후기 기하급수적 단계 유도를 시작하고 박테리아 감염성을 향상시킵니다. 하위 배양의 광학 밀도가 0.6에서 0.9 사이일 때 1ml의 박테리아를 1.5ml 튜브로 옮겨 원심분리로 수집합니다.

그리고 펠릿을 1의 광학 밀도로 감염 매체에 다시 현탁시킵니다. 다음으로, HeLa 세포 커버슬립 배양의 각 웰에서 상등액을 흡인합니다. 그리고 웰당 500마이크로리터의 신선한 실온 HeLa 세포 배지로 HeLa 세포를 조심스럽게 세척합니다.

세척액을 웰당 500마이크로리터의 감염 배지로 교체하고 24웰 플레이트를 원심분리하여 박테리아를 세포에 주입합니다. 침전된 박테리아 공동 배양을 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터로 30분 동안 옮겨 숙주 세포 감염을 촉진합니다. 배양이 끝나면 세척당 1ml의 신선한 섭씨 37도 HeLa 배양 배지에 3회 헹궈 세포에서 외인성 박테리아를 제거합니다.

그런 다음 겐타마이신이 함유된 1ml의 신선한 배양 배지로 감염된 세포를 덮고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 배양이 끝나면 배지를 관심 스트레스 요인이 보충된 500마이크로리터의 적절한 배양 배지로 교체하고 세포를 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 1 시간 후, 상등액을 완전히 흡인하고, PBS에서 0.5 밀리리터의 실온 4 % 파라 포름 알데히드에 샘플을 30 분 동안 고정시킨다.

다음으로, 정착제를 적절한 폐기물 용기에 버리고 트리스 완충 식염수 1ml로 커버슬립을 부드럽게 흔들어 2분 동안 세척합니다. 세척이 끝나면 TBS를 완전히 흡인하고 TBS에서 0.3%Triton X-100 500마이크로리터로 각 웰의 세포를 투과시킵니다. 10분 후 투과액을 1mL의 TBS로 교체하고 플레이트를 부드럽게 휘젓은 다음 TBS를 1mL의 블로킹 용액으로 교체하여 실온에서 1시간 동안 사용합니다.

관심 있는 1차 항체 칵테일로 세포를 라벨링하려면 커버슬립당 1차 항체 혼합물 50마이크로리터를 벤치 상단에 단단히 테이프로 붙인 플라스틱 파라필름 조각에 묻습니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 첫 번째 커버슬립을 집습니다. 그리고 커버슬립의 가장자리를 티슈 페이퍼에 두드려 여분의 액체를 제거합니다.

커버슬립을 드롭에 조심스럽게 놓고 적절한 라벨링 조건에서 커버슬립을 배양합니다. 1차 항체 라벨링 배양이 끝나면 각 커버슬립을 웰당 1ml의 TBS가 포함된 새로운 24웰 플레이트의 개별 웰로 옮기고 플레이트 셰이커에서 5분 동안 실온에서 세포를 3회 세척합니다. 마지막 세척 후, 방금 시연한 것처럼 각 커버슬립의 세포에 적절한 2차 항체 칵테일 혼합물을 표시합니다.

그리고 실온에서 1시간 동안 어두운 곳에서 커버슬립을 배양합니다. 2차 항체 라벨링 배양이 끝나면 방금 시연한 것처럼 부드러운 흔들림으로 새로운 24웰 플레이트에서 1ml의 PBS로 세포를 세 번 세척하지만 빛으로부터 보호합니다. 마지막 세척 후 각 커버슬립을 탈이온수에 잠시 담궈 염분을 제거하고 커버슬립 가장자리를 티슈에 두드린 다음 기포가 없는 유리 현미경 슬라이드당 5마이크로리터의 형광 장착 매체에 커버슬립을 조심스럽게 장착합니다.

그런 다음 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 그리고 이미징할 때까지 슬라이드를 적절하게 보관하십시오. 형광 컨포칼 현미경으로 세포를 이미지화하려면 먼저 이미지 획득을 위한 적절한 대물렌즈와 적절한 형광 채널을 선택합니다.

그런 다음 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 세포의 이미지 스택을 획득합니다. 모든 이미지가 캡처되면 적절한 이미징 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 축소하고 스택을 TIFF 파일로 저장합니다. 다음으로, 컨트롤 및 실험적 TIFF 이미지를 이미지 분석 플랫폼에 로드하고 룩업 테이블을 선택하여 시퀀스 창에서 채널 파라미터를 엽니다.

모든 채널 탭 확인란을 클릭하여 모든 채널을 비활성화합니다. 그런 다음 채널 0을 클릭하고 채널 0 색상 막대를 클릭하여 원하는 색상을 선택하고 모든 구조를 시각화하는 데 필요한 채널 강도를 높입니다. 실험 분석에 적합한 각 색상 채널을 선택하고 조정한 후 캔버스 탭을 선택하고 확대/축소 탭을 조정하여 보기 필드당 약 10개의 셀을 시각화합니다.

폴리곤 도구를 사용하여 관심 있는 셀을 클릭하고 셀 주위의 선을 확장하여 셀 경계를 표시합니다. 이 관심 영역의 이름을 지정하려면 관심 영역 창에서 관심 셀을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 관심 영역의 이름을 두 번 클릭하여 수정합니다. 동일한 방식으로 관심 있는 모든 셀을 선택하고 이름을 지정한 후 Detection and Tracking 탭에서 Spot Detector 애플리케이션을 엽니다.

Pre Processing 탭을 열고 분석할 채널을 선택합니다. Detector 탭에서 Detect bright spot over dark background(어두운 배경에서 밝은 점 감지)를 선택하고 적절한 스케일과 감도를 선택합니다. Region of Interest 탭의 시퀀스에서 제안된 관심 영역을 선택합니다.

필터링 탭에서 NoFiltering을 선택합니다. 출력 탭에서 적절한 출력을 선택합니다. 관심 영역으로 렌더링된 이전 스폿 제거를 선택하고 선택한 파일 없음을 클릭하여 파일을 저장할 폴더를 선택합니다.

그런 다음 Display(표시) 탭에서 관심 있는 적절한 옵션을 선택하고 Start Detection(감지 시작)을 클릭합니다. 이미징 분석 소프트웨어 내에서 스폿 검출기를 사용하여 지정된 각 관심 영역 내의 응력 과립을 식별할 수 있습니다. 그런 다음 이진 이미지를 생성하여 식별된 모든 응력 과립을 표시할 수 있습니다.

응력 과립 분석은 분석된 각 응력 과립 시장에 맞게 신중하게 조정되어야 합니다. 예를 들어, 감지된 관심 영역의 크기 요구 사항을 변경하거나 감지 매개변수의 민감도를 변경하면 결과가 달라질 수 있습니다. 더 높은 픽셀 크기 스케일에서는 더 작은 응력 과립이 계산되지 않고 응력 과립의 수가 감소합니다.

감도가 증가하면 응력 과립의 수가 증가합니다. 예를 들어, 이 실험에서 감도가 100인 척도 2는 응력 과립 마커 G3BP1에서 최상의 결과를 제공했습니다. 감도가 55인 2의 척도가 EIF3B 응력 과립 마커에 대해 최상의 결과를 제공했습니다.

그런 다음 응력 과립의 크기에서 표면적을 계산할 수 있습니다. 빈도 분포 플롯은 서로 다른 세포 집단 간의 응력 과립 크기 변화를 강조하는 데 유용합니다. 또한 형광의 강도는 분석된 응력 과립의 품질에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

일단 숙달되면 전체 세포 챌린지는 약 6-7시간 내에 완료할 수 있으며 분석은 2-3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 데이터 내의 변동성을 최소화하기 위해 항상 대조군과 실험 표본을 동시에 동일한 조건에서 처리해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분석을 3차원 볼륨으로 확장하여 응력 과립 위치 파악에 대한 추가 통찰력을 얻을 수도 있습니다.

이 반자동 절차를 통해 감염되지 않은 세포와 감염된 세포의 스트레스 과립을 엄격하고 편향 없이 분석할 수 있습니다. 그것은 이전에 알려지지 않은 응력 과립 경로의 전복을 드러낼 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 세포를 박테리아로 감염시키는 방법, 응력 과립 형성을 유도하는 방법, 스트레스 과립을 정성적 및 정량적 방식으로 분석하기 위해 반자동 접근 방식을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

그리고 Shigella flexneri 및 스트레스 과립을 사용하면 clotrimazole과 같은 유발제가 위험할 수 있으며 장갑을 착용하고 BL2 실험실에서 작업하고 모든 시약을 적절하게 폐기하는 것과 같은 예방 조치가 필요하다는 것을 잊지 마십시오.