포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

본 실험의 전반적인 목표는 세균 감염이 외인성 스트레스에 반응하여 스트레스 과립을 형성하는 호스트 세포의 능력에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 병원체가 스트레스 과립 경로 전체를 변경하거나 무력화할 수 있는지 평가하는 세포 미생물학 분야의 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 무료 이미지 분석 프로그램을 사용하여 스트레스 과립을 엄격하고 자동화된 방식으로 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있다는 점입니다.

본 방법은 스트레스 과립의 형성 및 구성의 역동성과 이러한 파라미터들이 특정 병원체에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 통찰을 제공합니다. 감사합니다. 챌린지를 시작하기 전, 갓 스트리킹한 tryptic soy agar 1% Congo red agar 플레이트에서 red S.flexneri M90T 세균 콜로니를 8 mL의 tryptic soy broth가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 접종하십시오.

뚜껑을 단단히 닫은 후, 222 RPM으로 흔들어주며 30 °C에서 콜로니를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 박테리아 150 µL를 8 mL의 신선한 tryptic soy broth에 접종하여 37 °C, 222 RPM에서 약 2시간 동안 계대 배양함으로써 독성 유전자 발현의 후기 대수 증식기 유도를 개시하고 박테리아의 감염력을 높입니다. 계대 배양액의 광학 밀도가 0.6에서 0.9 사이가 되면, 원심분리로 수집하기 위해 박테리아 1 mL를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 펠릿을 광학 밀도 1의 감염 배지에 재부유합니다. 다음으로 HeLa 세포 커버슬립 배양액의 각 웰에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 웰당 500 µL의 신선한 실온 HeLa 세포 배지로 HeLa 세포를 조심스럽게 세척합니다.

세척액을 웰당 500 µL의 감염 배지로 교체하고, 24웰 플레이트를 원심분리하여 박테리아를 세포 위로 가라앉힙니다. 호스트 세포의 감염을 촉진하기 위해 침강된 박테리아 공동 배양물을 37 °C 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 회당 1 mL의 신선한 37 °C HeLa 배양 배지로 세 번 헹구어 세포에서 외인성 박테리아를 제거합니다.

그 다음 gentamicin이 포함된 신선한 배양액 1 mL로 감염된 세포를 덮고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 배양이 끝나면 배지를 관심 스트레스 요인이 첨가된 적절한 배양액 500 µL로 교체하고 세포를 조직 배양 인큐베이터로 다시 옮깁니다. 1시간 후, 상층액을 완전히 흡입하여 제거하고, 실온의 PBS 내 4% paraformaldehyde 0.5 mL에서 30분 동안 샘플을 고정합니다.

다음으로, 고정액을 적절한 폐기물 용기에 버리고, 커버슬립을 1 mL의 tris-buffered saline으로 2분 동안 부드럽게 흔들어 세척합니다. 세척이 끝나면 TBS를 완전히 흡입 제거하고, 각 웰의 세포를 TBS에 희석된 0.3% Triton X-100 500 µL로 투과화합니다. 10분 후, 투과화 용액을 1 mL의 TBS로 교체하고 플레이트를 부드럽게 흔든 다음, 다시 TBS를 1 mL의 블로킹 용액으로 교체하여 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다.

관심 있는 1차 항체 칵테일로 세포를 염색하려면, 벤치 상단에 단단히 고정된 플라스틱 Parafilm 위에 커버슬립당 50 µL의 1차 항체 혼합물을 점적합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 첫 번째 커버슬립을 들어 올립니다. 그리고 커버슬립의 가장자리를 티슈 페이퍼에 가볍게 찍어 과잉 액체를 제거합니다.

커버슬립을 액적 위에 조심스럽게 덮고 적절한 라벨링 조건에서 배양합니다. 1차 항체 라벨링 배양이 끝나면, 각 커버슬립을 웰당 1 mL의 TBS가 들어 있는 새로운 24-웰 플레이트의 개별 웰로 옮기고, 플레이트 쉐이커를 사용하여 실온에서 5분 동안 3회 세포를 세척합니다. 마지막 세척 후, 앞서 시연한 것과 같이 각 커버슬립의 세포를 적절한 2차 항체 칵테일 혼합물로 라벨링합니다.

그리고 커버스립을 실온의 암소에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체 표지 배양 단계가 끝나면, 앞서 시연한 것과 같이 부드럽게 흔들어주며 새 24-웰 플레이트에서 1 mL의 PBS로 세포를 3회 세척하되, 빛이 차단되도록 합니다. 마지막 세척 후, 각 커버스립을 탈이온수에 짧게 담가 염분을 제거하고, 커버스립 가장자리를 티슈로 가볍게 닦아낸 뒤, 유리 현미경 슬라이드당 5 µL의 형광 마운팅 매질을 사용하여 기포가 생기지 않도록 커버스립을 조심스럽게 마운팅합니다.

그 다음 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다. 그리고 이미징 전까지 슬라이드를 적절하게 보관하십시오. 형광 공초점 현미경으로 세포를 이미징하려면, 먼저 이미지 획득에 적합한 대물렌즈와 적절한 형광 채널을 선택하여 시작하십시오.

그런 다음 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 세포의 이미지 스택을 획득합니다. 모든 이미지 캡처가 완료되면, 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 스택을 병합하고 TIFF 파일로 저장합니다. 다음으로, 이미지 분석 플랫폼에 대조군과 실험군 TIFF 이미지를 로드하고, Lookup Table을 선택하여 Sequence 창에서 채널 매개변수를 엽니다.

모든 채널 탭 체크박스를 클릭하여 모든 채널을 비활성화합니다. 그다음 0번 채널을 클릭하고, 0번 채널 색상 표시줄을 클릭하여 원하는 색상을 선택하며, 모든 구조를 시각화할 수 있도록 필요에 따라 채널의 강도를 높입니다. 실험 분석에 적합한 각 색상 채널을 선택하고 조정한 후, 캔버스 탭을 선택하고 확대/축소 탭을 조절하여 시야당 약 10개의 세포가 보이도록 설정합니다.

폴리곤 도구를 사용하여 관심 세포를 클릭하고, 세포 주변으로 선을 확장하여 세포 경계를 지정합니다. 이 관심 영역의 이름을 지정하려면 관심 영역 창에서 해당 세포를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음, 관심 영역의 이름을 더블 클릭하여 수정합니다. 동일한 방식으로 모든 관심 세포를 선택하고 이름을 지정한 후, 검출 및 추적 탭 내에서 Spot Detector 애플리케이션을 엽니다.

Pre Processing 탭을 열고 분석할 채널을 선택합니다. Detector 탭에서 Detect bright spots over dark background를 선택하고 적절한 scale과 sensitivity를 선택합니다. Region of Interest 탭에서 시퀀스 내 제안된 관심 영역을 선택합니다.

Filtering 탭에서 NoFiltering을 선택하십시오. Output 탭에서 적절한 출력을 선택하십시오. Remove previous spots rendered as regions of interest를 선택하고, no file selected를 클릭하여 파일을 저장할 폴더를 선택하십시오.

그런 다음 Display 탭에서 관심 있는 적절한 옵션을 선택하고 Start Detection을 클릭합니다. 이미지 분석 소프트웨어 내에서 스폿 검출기(spot detector)를 사용하여 지정된 각 관심 영역(region of interest) 내의 스트레스 과립(stress granules)을 식별할 수 있습니다. 이후 식별된 모든 스트레스 과립을 표시하는 이진 이미지(binary image)를 생성할 수 있습니다.

스트레스 과립 분석은 분석하려는 각 스트레스 과립 표본에 맞춰 세밀하게 조정해야 합니다. 예를 들어, 검출되는 관심 영역의 크기 요건을 변경하거나 검출 파라미터의 민감도를 변경하면 결과가 달라질 수 있습니다. 픽셀 크기 척도가 높을수록 작은 스트레스 과립은 집계되지 않으며, 스트레스 과립의 수는 감소하게 됩니다.

민감도를 높이면 스트레스 과립의 수가 증가합니다. 예를 들어, 본 실험에서는 민감도 100과 scale 2를 적용했을 때 스트레스 과립 마커인 G3BP1에서 가장 좋은 결과가 나타났습니다. 반면, EIF3B 스트레스 과립 마커의 경우에는 민감도 55와 scale 2를 적용했을 때 가장 좋은 결과가 나타났습니다.

그 다음, 스트레스 과립의 크기를 통해 표면적을 계산할 수 있습니다. 빈도 분포도는 서로 다른 세포 집단 간의 스트레스 과립 크기 변화를 강조하는 데 유용합니다. 또한, 형광 강도는 분석된 스트레스 과립의 품질에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.

숙련되면 전세포 챌린지는 약 6~7시간 정도에 수행할 수 있으며, 분석은 추가로 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 데이터 내 변동성을 최소화하기 위해 항상 대조군과 실험군 샘플을 동일한 조건에서 동시에 처리해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 분석을 3차원 볼륨으로 확장하면 스트레스 과립 국소화에 대한 추가적인 통찰을 얻을 수 있습니다.

이 반자동 절차를 통해 감염되지 않은 세포와 감염된 세포 내 스트레스 과립(stress granules)에 대한 엄격하고 편향 없는 분석이 가능합니다. 이를 통해 이전에는 알려지지 않았던 스트레스 과립 경로의 변형을 밝혀낼 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 박테리아로 세포를 감염시키는 방법, 스트레스 과립 형성을 유도하는 방법, 그리고 질적 및 양적 방식으로 스트레스 과립을 분석하기 위한 반자동 접근법 사용법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

또한 Shigella flexneri 및 clotrimazole과 같은 스트레스 과립 유도제는 위험할 수 있으므로, 장갑 착용, BL2 실험실 내 작업, 모든 시약의 적절한 폐기와 같은 예방 조치가 필요하다는 점을 잊지 마십시오.