Name: 포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 배우세요 포유류 세포에서 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성을 면역 형광 분석으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 세포 미생물학 연구에서 병원체가 세포 스트레스 반응을 조절하는지 평가하는 데 활용됩니다.

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PS는 Bill and Melinda Gates 그랜드 챌린지 그랜트 OPP1141322의 수령자입니다. PV는 스위스 국립 과학 재단 Early Postdoc Mobility 펠로우쉽과 Roux-Cantarini 박사후 연구원의 후원으로 지원되었습니다. PJS는 HHMI 보조금 및 ERC-2013-ADG 339579-Decrypt에서 지원됩니다.

<ol><li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li>
<li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+initiations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).</li>
<li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li>
<li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li>
<li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li>
<li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788(2013).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Re.+Micro%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
</ol>

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여기에 설명 된 프로토콜은 외인성 스트레스의 존재 또는 부재 하에서 cytosolic 병원체 S. flexneri 에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG의 유도, 국소화 및 분석을 설명합니다. 자유 이미징 소프트웨어를 사용하여 프로토콜은 주어진 phenotypes의 차이를 식별하고 통계적으로 처리하기 위해 SG 형성에 대한 정확한 질적 및 양적 분석을 허용합니다. 감염, SG 유도 및 영상 진단을위한 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 감염의 경우 여기에 설명 된 침습과 같은 숙주 세포와의 세균 상호 작용이 가능한 한 많이 동기화되는 것이 중요합니다. 이것은 감염 과정 초기에 세균 감염의 영향을 조사 할 때 특히 중요합니다. 우리는 이전에 S. flexneri 감염 후 eIF3b 국소화와 같은 일부 표현형이 야생 형의 초기에 교란되었음을 보여주었습니다S. flexneri 는 G3BP1을 포함하는 SG의 집합과...

세포 수준에서 숙주 - 병원체 상호 작용을 시각화하는 것은 병원성 전략에 대한 통찰력을 얻고 주요 세포 경로를 확인하는 강력한 방법입니다. 사실 병원균은 중요한 세포 표적이나 구조를 정확히 찾아내는 도구로 사용될 수 있습니다. 병원균은 생존이나 번식을위한 전략으로 중앙 세포 과정을 파괴하기 위해 진화했습니다. 형광 성분을 가진 숙주 단백질을 재조합 적으로 발현시킴으로써 세포 성분의 시각화를 달성 할 수 있습니다. 이것은 실시간 분석을 가능하게하지만, 특이 적으로 표지 된 숙주 단백질을 갖는 세포주의 생성은 매우 힘들고 바람직하지 않은 부작용을 초래할 수있다. 다중 항원 인자를 동시에 분석 할 수 있고 특정 세포 유형에만 국한되지 않기 때문에 특정 항체를 사용하여 세포 인자를 검출하는 것이 더 편리합니다. 단점은 immunofluorescence 분석은 숙주 세포 고정을 필요로하기 때문에 고정보기 만 캡처 할 수 있다는 것입니다이온. 그러나, immunofluorescence 이미징의 중요한 장점은 쉽게 질적 및 양적 분석 모두에 도움이된다는 것입니다. 이것은 차례로 호스트 - 병원체 상호 작용에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 통계적으로 중요한 차이를 얻는 데 사용될 수 있습니다. 형광 이미지 분석 프로그램은 3D 및 4D 분석을 수행하는 강력한 분석 도구입니다. 그러나 소프트웨어 및 유지 보수 비용이 높기 때문에 무료 오픈 소스 소프트웨어를 기반으로 한 방법이 더 널리 알려집니다. 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 신중한 이미지 분석은 시각적 분석을 실체화하고 통계적 유의성을 부여 할 때 주어진 표현형의 정확성에 대한 신뢰도를 높이기 때문에 가치가 있습니다. 이전에는 SG가 무료 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석되었으므로 개별 SG를 수동으로 식별해야했습니다 4 . 여기에 우리는 bac의 맥락에서 세포 SG 형성의 유도와 분석을위한 프로토콜을 제공한다.(http://icy.bioimageanalysis.org)를 사용하여 테리아 (terial) 감염을 예방할 수 있습니다. 바이오 이미지 분석 소프트웨어에는 SG 분석에 매우 적합한 스팟 디텍터 프로그램이 내장되어 있습니다. 지정된 관심 영역 (ROI)에서 자동화 된 탐지 프로세스를 미세 조정할 수 있습니다. 이는 개별 SG에 대한 수동 분석의 필요성을 극복하고 샘플링 편차를 제거합니다. 많은 환경 적 스트레스는 직경이 0.2 - 5 μm 인 상 고밀도 세포질, 비막 성 구조 인 SGs의 형성을 유도한다. 이 세포 반응은 효모, 식물 및 포유 동물에서 진화 적으로 보존되며 전 세계 단백질 번역이 금지 될 때 발생합니다. SG 로의 stalled translation initiation complex의 응집을 포함하며, SG는 translationally-inactive mRNA의 보유 장소로 간주되어 세포 mRNA의 일부를 선택적으로 번역 할 수있다.스트레스를 제거하면 SG가 분해되고 단백질 합성의 전체 속도가 재개됩니다. SG는 정확한 신랄한 구성이 적용되는 응력에 따라 달라질 수 있지만 번역 신생 개시 인자, RNA 대사에 관여하는 단백질, RNA 결합 단백질, 그리고 스 캐 폴딩 단백질 및 숙주 세포 신호 전달에 관련된 인자로 구성된다. SG 형성을 유도하는 환경 요인으로는 아미노산 결핍, 자외선 조사, 열 쇼크, 삼투압 쇼크, 소포체 세균 스트레스, 저산소증 및 바이러스 감염 2 , 7 , 8이있다 . 박테리아, 곰팡이 또는 원충 병원체와 같은 다른 병원체가이 세포 성 스트레스 반응에 어떻게 영향을 미치는지에 대해서는 아직 거의 알려지지 않았지만 바이러스가 유도하는 방법과 SG 형성을 파괴하는 방법에 대한 많은 진전이있었습니다. 시게lla flexneri는 사람의 그람 음성 음성 매개 성 세포질 병원체이며 심한 설사 또는 세균성 경화증의 원인균이다. 이질균증은 주요 공중 보건 부담이며 5 세, 9 세 이하의 어린이에서 매년 2 만 8 천명의 사망자를 발생시킵니다. S. flexneri 는 결장 상피를 감염시키고 숙주의 세포 골격 구성 요소 11 , 12 를 하이재킹하여 세포 대 세포를 퍼집니다. 상피의 감염은 세포질 내에서의 플레 서 네리 ( flexneri) 의 복제를지지하지만, 감염된 대식 세포는 열광 증 (pyroptosis)이라 불리는 염증 세포 사멸 과정을 통해 사망한다. 감염은 호중구와 열, 산화 스트레스 및 조직 파괴를 동반하는 심한 염증의 대규모 모집으로 이어집니다. 따라서, 감염된 세포는 골지사 파괴, 유전 독성 스트레스 및 세포 골격 재 배열과 같은 감염에 의해 유도 된 내부 스트레스를받는 반면감염된 세포는 또한 염증 과정으로 인해 환경 스트레스를받습니다. 다수의 SG 마커를 사용하여 환경 스트레스에 반응하는 세포의 능력에 대한 S. flexneri 감염의 특성화는 감염이 SG 조성 3의 질적 및 양적 차이를 유도한다는 것을 입증했다. 그러나 다른 박테리아 병원균에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 여기에서 우리는 cytosolic 병원체 S. flexneri , 다른 환경 스트레스와 세포의 스트레스, SG 구성 요소의 표시 및 감염의 맥락에서 SG 형성과 구성의 질적 및 정량 분석과 숙주 세포의 감염에 대한 방법론을 설명합니다 및 비 감염 세포. 이 방법은 다른 세균 병원균에 널리 적용 할 수 있습니다. 또한, SG 형성의 이미지 분석은 바이러스 또는 다른 병원균에 의한 감염에 사용될 수있다. SG를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.감염시의 형성 또는 외인성 응력에 대한 SG 형성에 대한 감염의 효과.

<table><tbody><tr><td>Primary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), 기원 염소&nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-16377</td><td>견고하고 널리 사용되는 SG 마커. 세포질 염색을 통해 세포 묘사를 할 수 있습니다. 희석 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), 원산지 염소&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-16378</td><td>eIF3b (N20)와 동일한 대상이며 우리 손에는 eIF3b (N20)와 동일했습니다. 희석 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), 기원 토끼 (MC: monoclonal)</td><td>세포 신호</td><td>3411</td><td>eIF3b와 다단백질 eIF3 복합체의 일부 . 희석 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, 원산지 염소&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-14211</td><td>추천 (참조 # 13). 희석 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, 원산지 토끼</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>우리 손에 좋은 응력 과립 마커. 희석 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, 기원 토끼</td><td>세포 신호</td><td>3592</td><td>Ref # 13에서 권장. 희석 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, 원산지 토끼</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-11373</td><td>널리 사용되는 SG 마커. (참조 # 13) : 마우스 세포주에서 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 희석 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, 기원 토끼 (MC: monoclonal)</td><td>BD Biosciences</td><td>611126</td><td>널리 사용되는 SG 마커. 희석 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, 원산지 염소&nbsp;</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-1751</td><td>널리 사용되는 SG 마커. SG가 존재할 때 P체에서도 발견될 수 있습니다(Ref # 13). 희석 1:300</td></tr><tr><td>Alexa-conjugated Secondary Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 anti-goat, origin</td><td>donkey Thermo Fisher</td><td>A-11055</td><td>Cross absorbed. 희석 1:500</td></tr><tr><td>A568 안티 염소, 원산지 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>십자가 흡수. 희석 1:500</td></tr><tr><td>A488 안티 마우스, 원산지 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21202</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>A568 안티 마우스, 원산지 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10037</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>A647 안티 마우스, 원산지 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A31571</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>A488 안티 토끼, 원산지 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21206</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>A568 안티 토끼, 기원 당나귀</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>희석 1 : 500</td></tr> <tr><td>< 강력 > 기타 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Shigella flexneri </td><td></td><td></td><td>요청에 따라 다양한 실험실에서 구할 수 있습니다</td></tr><tr><td>Tryptone Casein Soya (TCS) broth</td><td>BD Biosciences</td><td>211825</td><td>Shigella의 표준 성장 배지, 응용 프로그램 - 박테리아 성장</td></tr><tr><td>TCS 한천</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>Shigella에 대한 표준 성장 한천, 응용 프로그램 - 박테리아 성장</td></tr><tr><td>콩고 레드</td><td>SERVA 전기 영동 GmbH</td><td>27215.01</td><td>독성 플라스미드를 잃은 Shigell에 대한 분해 도구, 응용 프로그램 - 박테리아 성장</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>감염, 응용 프로그램 - 감염을 증가시키기 위해 박테리아를 코팅하는 데 유용합니다</td></tr>.<tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>세포외 박테리아의 선택적 사멸, 응용 프로그램 - 감염</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>세포가 RT에서 배양 할 때 유용한 PH 버퍼, 응용 프로그램 - 세포 배양</td></tr><tr><td>Dulbecco의 DMEM (Modified Eagle Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>31885</td><td>HeLa 세포용 표준 배양 배지, 응용 프로그램 - 세포 배양</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>HeLa 세포 배양 배지에 사용되는 5% 보충제, 응용 프로그램 - 세포 배양</td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>HeLa 세포 배양 배지에 사용되는 1:100 희석, 응용 - 세포 배양</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>시약 희석제, 응용 - 세포 배양</td></tr><tr><td>비소</td><td>나트륨Sigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>강력한 스트레스 과립 유도제(참고: 고독성, 특수 취급 및 폐기 필요), 응용 - 스트레스 유도제</td></tr><tr><td>Clotrimazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>강력한 스트레스 과립 유도제(참고: 건강 위험, 특별 취급 및 폐기 필요), 응용 - 스트레스 유도제</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA</td><td>전자 현미경 Scences</td><td>15714</td><td>4% PFA는 세포의 표준 고정에 사용되며, 응용 프로그램 - 고정</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>면역형광 염색 전 숙주 세포의 투과화에 0.03%로 사용, 적용 - 투과화</td></tr><tr><td>A647-phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>희석은 1:40이며, 2차 항체 염색 중에 가장 잘 추가됨, 응용 프로그램 - 염색</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>숙주 핵과 박테리아를 모두 시각화하는 데 사용되는 핵산 염색, 적용 -</td></tr><tr><td>커버 슬립의 면역 형광 염색에 유용한</td><td>파라 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td> 파라핀 필름 염색, 적용 - 염색</tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>대부분의 형광단에 잘 작동하는 견고한 장착 매체, 적용 -</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381 장착</td><td>대부분의 형광단에 잘 작동하는 저렴하고 견고한 마운팅 매체, 애플리케이션 -</td></tr><tr><td>마운팅 24-웰 세포 배양 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>표준 조직 배양 플레이트, 애플리케이션 - 세포 배양</td></tr><tr><td>12 mm&nbsp; 유리 커버슬립</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>세포 배양 지원, 애플리케이션 - 세포 지원</td></tr><tr><td>펜치</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>대부분의 형광단에 잘 작동하는 저렴하고 견고한 마운팅 매체, 애플리케이션 - 마운팅</td></tr><tr><td><강력>프로그램 및 장비</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td></td><td>데이터 분석 및 그래프 작성 프로그램(강력한 통계 테스트 옵션, 애플리케이션 - 데이터 분석)</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Confocal microsope, 애플리케이션 - 이미지 Imaris</td></tr><tr><td></td><td>Bitplane</td><td></td><td>Professional 이미지 분석 프로그램, 응용 프로그램 - 데이터 분석</td></tr><tr><td>Excel</td>, <td>Microsoft</td><td></td><td>데이터 분석 및 그래프 프로그램, 응용 프로그램 - 데이터 분석</td></tr></tbody></table>

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

세포 구성 요소의 형광 이미징은 숙주 - 병원체 상호 작용을 조사하는 효과적인 도구입니다. 병원균은 세포 소기관의 초 미세 구조, 세포 골격 네트워크 조직 및 스트레스 과립 (SG) 형성과 같은 세포 과정을 포함하여 감염된 세포의 다양한 특성에 영향을 줄 수 있습니다. 어떻게 병원균이 숙주 과정을 파괴하는지에 대한 특성 규명은 발병 기전의 중요하고 필수적인 부분이다. 다양한 표현형이 쉽게 볼 수 있지만, 병원균 공격에 의해 유발 된 세포 구조의 질적 및 양적 차이에 대한 정확한 분석은 실험 및 대조군 시료간에 통계적으로 중요한 차이를 정의하는 데 필수적입니다. SG 형성은 항 바이러스 반응을 유도하는 진화론 적으로 보전 된 스트레스 반응이며, 바이러스 감염을 이용하여 오랫동안 연구되어왔다. SG 형성은 또한 신호 계통에 영향을 미치고 다른 아직 알려지지 않은 conseq2 . 박테리아 병원균과 같은 바이러스 이외의 병원균에 대한 스트레스 반응의 특성화는 현재 연구의 새로운 영역 3 입니다. 현재 바이러스 성 시스템에서도 SG 형성에 대한 정량 분석과 정성 분석은 아직 일상적으로 사용되지 않고 있습니다. 여기서 우리는 다양한 외인성 응력에 대응하여 SGs의 형성에 영향을주는 세포 독성 세균 병원체에 감염된 세포 및 감염되지 않은 세포에서 SG 형성을 유도하고 특징 화하기위한 간단한 방법을 기술한다. SG 생성 및 구성 분석은 다양한 SG 마커와 오픈 소스 이미지 분석 도구 인 ICY의 스팟 디텍터 플러그인을 사용하여 이루어집니다.

이 원고에 설명 된 프로토콜을 설명하고 설명하기 위해 우리는 세포질 병원체 S. flexneri에 감염되었거나 감염되지 않은 HeLa 세포에서 clotrimazole 유도 된 SG의 이미지를 특징으로했습니다. 이 절차의 개요는 그림 1 에 나와 있으며 콩고 레드 플레이트에 박혀 있는 독성과 무해한 S. flexneri , 박테리아 준비, 감염, 환경 스트레스 추가, 샘플 고정 및 염색, 샘플 이미징 및 정량, 이미지 분석 . 다양한 스트레스가 SG 형성을 유도하는데 사용될 수 있으며, 다양한 SG 마커가 심문에 이용 가능하다. eIF3b는 세포의 세포질 구획을 분명히 얼룩지게하고 세포 가장자리를 확인하는 데 사용할 수있는 표준 SG 마커입니다. G3BP1은 배경 염색없이 SG로 응집되는 널리 사용되는 SG 마커입니다 ( 그림</st...

우리는 세포가 박테리아와 여러 가지 스트레스에 도전을받은 후 포유류 세포에서 스트레스 과립 형성의 정성 및 정량 분석 ​​방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 광범위한 호스트 - 박테리아 상호 작용에서 세포 스트레스 과립 반응을 조사하는 데 적용 할 수 있습니다.

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

본 실험의 전반적인 목표는 세균 감염이 외인성 스트레스에 반응하여 스트레스 과립을 형성하는 호스트 세포의 능력에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 특정 병원체가 스트레스 과립 경로 전체를 변경하거나 무력화할 수 있는지 평가하는 세포 미생물학 분야의 유용한 도구입니다. 이 기술의 주요 장점은 무료 이미지 분석 프로그램을 사용하여 스트레스 과립을 엄격하고 자동화된 방식으로 정성적 및 정량적으로 분석할 수 있다는 점입니다.본 방법은 스트레스 과립의 형성 및 구성의 역동성과 이러한 파라미터들이 특정 병원체에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 통찰을 제공합니다. 감사합니다. 챌린지를 시작하기 전, 갓 스트리킹한 tryptic soy agar 1% Congo red agar 플레이트에서 red S.flexneri M90T 세균 콜로니를 8 mL의 tryptic soy broth가 들어 있는 15 mL 원추형 튜브에 접종하십시오.뚜껑을 단단히 닫은 후, 222 RPM으로 흔들어주며 30 °C에서 콜로니를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 박테리아 150 µL를 8 mL의 신선한 tryptic soy broth에 접종하여 37 °C, 222 RPM에서 약 2시간 동안 계대 배양함으로써 독성 유전자 발현의 후기 대수 증식기 유도를 개시하고 박테리아의 감염력을 높입니다. 계대 배양액의 광학 밀도가 0.6에서 0.9 사이가 되면, 원심분리로 수집하기 위해 박테리아 1 mL를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다.그런 다음 펠릿을 광학 밀도 1의 감염 배지에 재부유합니다. 다음으로 HeLa 세포 커버슬립 배양액의 각 웰에서 상층액을 흡입하여 제거합니다. 그리고 웰당 500 µL의 신선한 실온 HeLa 세포 배지로 HeLa 세포를 조심스럽게 세척합니다.세척액을 웰당 500 µL의 감염 배지로 교체하고, 24웰 플레이트를 원심분리하여 박테리아를 세포 위로 가라앉힙니다. 호스트 세포의 감염을 촉진하기 위해 침강된 박테리아 공동 배양물을 37 °C 조직 배양 인큐베이터로 옮겨 30분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면, 회당 1 mL의 신선한 37 °C HeLa 배양 배지로 세 번 헹구어 세포에서 외인성 박테리아를 제거합니다.그 다음 gentamicin이 포함된 신선한 배양액 1 mL로 감염된 세포를 덮고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 배양이 끝나면 배지를 관심 스트레스 요인이 첨가된 적절한 배양액 500 µL로 교체하고 세

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Cayron, J., et al. 스트레스 치료 하에서 박테리아 성장에 대한 다중 규모 분석. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 스트레스 조건에서 박테리아 세포를 이미징하기 위해 미세유체 플레이트를 준비하고 사용하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 배양과 스트레스 유도 항생제 배지를 도입한 후 세포 로딩 및 현미경 설정을 도입하는 과정을 간략하게 설명합니다. 그런 다음 위상차 모드의 타임랩스 이미징을 사용하여 세포 분열 억제로 인해 DNA 함량이 증가한 길쭉한 사상형 세포의 발달을 관찰합니다.

미세유체 챔버를 사용한 스트레스 하에서 박테리아 성장의 현미경 분석

출처: Vonaesch, P. 외, 포유류 세포의 박테리아 도전 후 스트레스 과립 형성의 면역형광 분석. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 병원성 박테리아인 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri )에 의해 상피세포가 감염되고 그로 인한 숙주 세포 반응을 보여줍니다. 박테리아 효과 단백질은 숙주 번역을 방해하여 세포의 적응 반응인 스트레스 과립이라 불리는 막 없는 소기관 형성을 촉진합니다.

암성 상피세포의 시겔라 감염 중 스트레스 과립 형성

이 비디오는 mRNA, RNA 결합 단백질(RBP) 및 기타 다양한 단백질로 구성된 포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 분석을 보여줍니다.

포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

유동 세포 계측법 및 현미경에 따라 두 개의 보완적인 방법은 효모에서 MAPK 경로의 활성화에 의해 유도되는 유전자 발현의 역학의 단일 세포 수준에서 정량을, 가능하게하는 표시됩니다.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

스트레스 과립 (SGs)은 다양한 스트레스에 노출 된 세포에서 형성되는 비 세포 성 세포질 구조입니다. SG는 mRNA, RNA 결합 단백질, 작은 리보솜 서브 유닛, 번역 관련 인자 및 다양한 세포 신호 전달 단백질을 포함한다. 이 프로토콜은 선량있는 SG를 탐지, 특성화 및 정량화하기위한 몇 가지 실험적 방법을 사용하는 워크 플로를 설명합니다.

포유류 스트레스 과립으로 세포질 초점을 분류하는 방법

Coverslips B 세포 수용 체에 항 체, 초기 단계에 대 한 모델 코팅에 확산 하는 B 세포에서 동시에 이미지 걸 구조, microtubules, 및 microtubule 플러스-엔드 바인딩 단백질에 호텔 위치 현미경 검사 법을 사용 하기 위한 프로토콜 소개 면역 시 냅 스 형성.

말라와 자극된 방출 소모 (호텔 위치) 현미경을 사용 하 여 B 세포 면역 냅에 Microtubule Cytoskeletons 시각화

우리는 다 잘 형식 polyacrylamide 기반 분석 결과 부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향 조사에 대 한 개발 했습니다. 이 분석 결과 cytometry, immunostaining, 그리고 견인 힘 현미경 검사 법, 양적 측정 셀, 그들의 기질, 및 병원 성 박테리아 사이 biomechanical 상호 작용의 수와 호환 됩니다.

부착 세포의 세균성 감염에 기질 경직성의 영향을 공부 다 잘 형식 Polyacrylamide 기반 분석

우리는 형광 현미경 이미지의 특정 세포 구획에서 세포 체의 신속한 탐사와 정확한 분석을 위해 구축 된 자유롭게 사용할 수있는 워크플로우를 제시합니다. 이 사용자 친화적인 워크플로우는 오픈 소스 소프트웨어 Icy에서 설계되었으며 ImageJ 기능을 사용합니다. 파이프라인은 이미지 분석에 대한 지식없이 저렴합니다.

하위 구조 분석기: 형광 현미경 이미지에서 세포 체의 신속한 탐색 및 정확한 분석을 위한 사용자 친화적인 워크플로우

배우세요 포유류 세포에서 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성을 면역 형광 분석으로 정량화하는 방법을. 이 기법은 세포 미생물학 연구에서 병원체가 세포 스트레스 반응을 조절하는지 평가하는 데 활용됩니다.

포유류 세포의 박테리아 감염 후 스트레스 과립 형성의 면역 형광 분석

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