Name: 레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: 학습하세요 레이저로 국소화된 DNA 가닥간 교차결합의 단일 분자 분석 방법을 통해 세포의 DNA 손상 반응을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 유전체 DNA에서 레이저 활성화 화합물에 의해 유도된 손상을 직접 영상화하여 DNA 복구 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

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이 연구는 (Z01 AG000746-08)와 판 코니 빈혈 연구 기금을 노화에 국립 보건원, 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.

파기 TMP-1의 제조 <ol><li> 50 mg의 (0.18 밀리몰) 8- trimethylpsoralen 4&#39;- 클로로 -4,5- &#39;및 건식 25 ㎖ 둥근 590 mg의 (2.7 밀리몰) 4,7,10- 트리 옥사 1,13-tridecanedi 아민의 믹스 질소하에 플라스크 -bottom. 12 시간 동안 톨루엔 10ml를 첨가하고 환류를 추가한다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. <ol><li> 실리카겔상에서 플래시 칼럼 크로마토 그래피시킴으로써 잔류 물을 정제 하였다. (1 : 0.5 ~ 9), 클로로포름, 메탄올, 28 % 암모니아 용액으로 컬럼을 용출시켰다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 증발시키고, 회복 순수 -4 &#39;- [N- (13- 아미노 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 메틸 4,5&#39;, 8- trimethylpsoralen 점성의 담황색 액체. </li><li> 4 5.5 밀리그램 (0.012 밀리몰)을 혼합 &#39;- [N-를 (13- 아미노 - 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 -4,5-&#39;디곡 NHS 에스테르 5 ㎎ (0.008 밀리몰)의 8-trimethylpsoralen 질소하에 무수 환저 플라스크. 0.5 mL의 무수 디메틸 포름 아미드를 추가 (DMF)를디 트리메틸 3.4 μL와 18 시간 동안 50 ℃에서 교반 하였다. </li><li> 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. </li><li> 디클로로 메탄 최소량 잔사를 용해. 가로 정지상으로서 실리카겔 분취 박층 판의 하단에 2 μL 스폿의 용액을 적용한다. 메탄올 : 클로로포름에 취용 TLC를 실행하여, 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1). </li><li> 수직 에지를 제외한 판 마스크 단파장 UV 254 nm의 램프 제품의 대역을 식별한다. 주걱 플레이트로부터 생성물을 긁어 클로로포름하여 순수한 생성물을 분리 : 메탄올 : 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1) 혼합물. </li><li> 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. 50 % EtOH로 1 mL의 잔류 펠렛을 녹이고 : H 2 O, 모든 용매 (~ 3 시간), 증발 될 때까지 원심 증발기에 1.5 ㎖의 튜브 (~ 20 개 씩) 건조 50 μL 분취 액으로 분배. </li><li>원심 증발기에서 다시 H 2 O 건조 : 50 %의 EtOH 200 μL의 각 분취 액을 재용. 50 %의 EtOH에 200 μL 분취를 각각 다시 녹이고 : H 2 O, 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 원심 증발기 저장 펠렛 건조. </li></ol></li><li> H 2 O가 1 준비 : H 2 O에 녹인 파기 TMP-100 희석하고 250 nm에서 OD를 측정하는 용도의 경우, 50 %의 EtOH 50 μL의 펠릿을 용해. 파기-TMP의 흡광 계수는 25000이다. -20 ° C에 저장하는 경우이 솔루션은 약 한 달 동안 안정하다. 각각의 사용 이전에 250 nm에서의 OD를 측정하여 농도를 확인한다. <ol><li> 스톡 농도를 계산 : ABS × 100 X10 (μM)에서 6 / 25,000 = 농도. 일반적으로 원액은 약 3 mm이다. 이 배지에 첨가의 EtOH 부피를 최소화하기 위해이 범위 인 것이 중요하다. </li></ol></li></ol> 2. 레이저 지역화 파고-TMP ICLS <ol><li> 체육SRS 질소 레이저 (337 ㎚)와 공 초점 현미경 rform 레이저 제이션 365 nm의 라인 발광 0.7 NW의 파워로, 10 Hz에서 3 개 ns의 펄스를 발사 염료 셀을 통해 펌핑. </li><li> 35 밀리미터 유리의면에 수직 마크를 확인은 마킹 펜으로 세포 배양 접시를 바닥. 다이아몬드 펜 배양 표면에 유리의 중앙에서 교차 스크래치 등 접시 측의 블랙 스트라이프를 크로스 한 팔의 상단에있다. 이것은 상기 셀들이 동일한 초점 평면에있을 수 있도록 교차는 유리의 성장 표면 상에 표시된다. </li><li> 70 %의 EtOH 린스와 함께 마킹 후에 멸균 접시. 세포를 도금하기 전에 건조. </li><li> 십자가에서 플레이트 세포 (예 : 헬라 또는 U2OS 표준 실험실 균주)은 하나 또는 두 개의 일전 문화 요리를 표시했다. 셀 적극적으로 나누어 실험 당일 50-70% 합류한다. 균일 라벨 DNA 1 μM 5- 클로로 -2- 데 옥시 우리 딘 (CldU)로 24 시간 동안 인큐베이션. </li><li> 더하다50 % EtOH를 발굴-TMP : 20 μM의 최종 농도까지 세포 배양 배지에 H 2 O. 37 ℃로 매체를 준비한다. 배양기에서 세포 도처 변경 매체 (37 ° C를 5 % CO 2) 30 분 발굴-TMP가 평형을 허용 할. </li><li> 세포가 배양하는 동안, 레이저 활성 인 시야의 X / Y 좌표를 확립한다. 레이저는 수평 및 대각선을 따라 미러 슬라이드 유리를 에칭하기 위해 소프트웨어에 의해 지시 된 제조자의 보정 절차를 수행. 두 라인은 레이저가 표적을 공격 할 수있는 필드의 경계를 정의합니다. </li><li> 현미경 스테이지 제어 CO 2 및 습도와 37 ℃의 환경 챔버 내의 플레이트를 놓고, 십자가의 교차점에 오일 60X 대물 포커스. </li><li> 소프트웨어의 형상 도구 연구자에 의해 설립 된 ROI에 365 nm의 레이저 빔을 지향, 3의 스트라이프를 형성# 181 0.6 μm의 MX. 투자 수익 (ROI)의 개요는 십자가의 교차로 바로 근처에있는 세포의 핵에 커서가 배치됩니다. 핵을 통해 레이저 중도를 타겟팅 Z 초점 평면을 조정한다. 350-370 nm 범위의 레이저를 사용합니다. 405 nm의 레이저는 크로스 링크 (19)를 유도 할 수 없다. 참고 : 우리는 미분 간섭 대비 (DIC) 이미징 핵질 구별 할 수있는 핵소체, 외부 nucleoplasmic 분야에서 투자 수익 (ROI)을 찾습니다. </li><li> 셀 (셀 어둡게 한 후 사라진다) 말살 충분한 레벨로 전력 설정을 증가시켜 레이저의 초점과 활동을 확인한다. 이 현미경을 통해 다음 coverslip을 통해 세포에 레이저에 대한 방해받지 않고 빛의 경로에 대한 중요한 진단이다. <ol><li> 소 랄렌과 ICL 유도 DDR (이 각 레이저 / 마이크에 대한 경험적으로 결정되어야합니다 활성화에가 충분한 전원 설정을 낮 춥니 다roscope 조합). (γ-H2AX의 형성에 의해 모니터링) 소 랄렌의 부재에 DDR을 활성화하지 않는 레이저 강도 설정 (현재 1.7 %)를 사용합니다. 주 :이 중요한 결정하고 레이저 광원 또는 광 경로의 구성 요소가 변경되는 경우의 설정 조정이 필요할 수있다. GFP 축적이 레이저 랄렌 줄무늬 그러한 빠르게 (초) 모집 둘 또는 XPC FAN1 같은 복구 단백질 태그 따르되 형 레이저에 노출 ROI하지. 몇 분은 다른 사람을 위해 필요할 수 있습니다 동안 DDR의 일부 단백질, 초 이내에 나타납니다. 관심 각각의 단백질을 시간 코스 결정을 수행하는 것이 필요하다. 우리는 또한 레이저에 노출되지 않은 세포에서 응답 단백질의 더 줄무늬가 없음을 확인합니다. </li></ol></li><li> 필드에있는 모든 세포는 십자가의 교차로에 가까운 체류, 이동에 새로운 필드 플레이트를 대상으로 한 후. </li><li> 실험에서 determ하도록 설계병변 간 거리의 분포가 교차 20-25 필드 (4-5 세포 / 필드)에 레이저에 세포를 노출 Ine입니다. 지역화 ICLS 근방에 복제 패턴을 분석하기 위해 레이저 발사 후 10 μM 5- 요오도 -2- 데 옥시 우리 딘 (IDU)와 함께 세포를 배양한다. 참고 : IDU와 배양 시간은 다소 임의적이다. 우리는 20 분으로 짧고 긴 60 분 (아래 참조)로 사용 하였다. 긴 펄스 (몇 시간)는 종종 이렇게 이미지에 단일 포크의 진행을 수있는 기회를 잃고, 유착 여러 복제 책자 초래한다. 일부 실험에서, CES는 복제 소책자 펄스 라벨링 하였다 파기-TMP에 노출하기 전에 라벨 DNA로 균일를 24 시간 동안 CldU으로 표시된다. </li></ol> 3. 세포 수확 및 DNA 섬유의 연신 <ol><li> 스테이지에서 플레이트를 제거하고 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. PBS를 솔루션을 제거합니다. 상업 트립신의 10 μL 드롭 배치/ 유리 표면의 중앙에서의 교차의 교차점에 EDTA 용액. </li><li> 실온 (RT)에서 3-4 분 동안 인큐베이션 한 후 피펫 팁으로 분리 된 세포를 트립신 용액을 그린다. 트립신을 중화 할 필요가 없습니다. </li><li> 실란 처리 유리 현미경 슬라이드의 일단의 세포를 트립신 / EDTA의 드롭을 배치. 를 Lyse 균체 및 건조 할 수있는 풀의 주변부를 허용 0.5 % SDS 용액 10 μL를 첨가하여 DNA를 분리하고, 피펫 끝으로 부드럽게 혼합을 실온에서 3-4 분 동안 배양한다. </li><li> 슬라이드를 기울 20º 액체가 아래로 끝까지 실행할 수 있습니다. DNA는 섬유를 흐르는 액체의 유체 역학적 힘에 의해 연신 / 확장된다. 프레젠테이션 건조 공기 (~ 10 분)하자 3 FIX : 10 분 동안 1 메탄올 / 아세트산. 다시 수정 솔루션 및 건조 공기에서 슬라이드를 제거합니다. 이때 이들은 -20 ° C에서 70 %의 EtOH에 무기한 저장 될 수있다. 70 %의 EtOH로에서 제거에 NE 전에 공기 건조하도록 허용XT 단계. </li><li> PBS에서 슬라이드를 세척 한 후 실온에서 1 시간 동안 2.5 M 염산으로 변성. 이 치료는 DNA 항체에 통합 된 할로겐화 핵산 염기 액세스 할 수 있도록 depurinates. </li><li> 0.4 M 트리스 -HCl, pH 7.4의 슬라이드 중화. PBS로 두 번 씻어 / 0.5 % 트윈 20 (PBST)을 5 분마다. </li><li> 블록 PBS에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 10 %의 염소 혈청 슬라이드. 슬라이드 고르게 블로킹 용액을 확산하고 RT에서 1 시간 동안 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버. </li><li> 1 μL 피펫 100 : 마우스 항 - 브로 모데 옥시 우리 딘의 차단 용액 200 희석 각 슬라이드에 1 차 항체 (특히 CldU를 검출한다). RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에 슬라이드 위에 고르게 희석 확산 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버. 파라 필름을 제거하고 5 분마다 슬라이드를 PBST에 세 번 씻는다. </li><li> 각 슬라이드 차단 용액에 (100 1) 염소 항 - 쥐 알렉사 형석 647 희석의 100 μL 피펫. 커버파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 및 RT에서 45 분 동안 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 200 : 희석 (1시 40분) 마우스 항 브로 모데 옥시 우리 딘의 피펫 100 μL 일차 항체 및 토끼 항 DIG 항체 (1 (. LDU 및 CldU이 이중 특이성 래트 종래 배양에서 항 BrdU에 의해 CldU의 차단을 필요로 검출) ) 각 슬라이드 용액을 차단한다. 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버와 RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 각 슬라이드 차단 용액에 염소 항 - 토끼 프로브 (예 Qdot 655) (: 100 1) 염소 항 - 마우스 알렉사 488 andc 형석 (5000 1) 희석의 100 μL 피펫. 부드럽게 파라 필름과 슬라이드를 덮고 실온에서 45 분 동안 품어. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오. </li><li> 종이 타월로 여분의 PBST를 배출합니다. 각 슬라이드에 장착 antifade 매체의 50 μL를 추가하고, 커버 슬립으로 덮고. 이미지 또는 저장소-20 ° C에서 더 이상 48 이상의 시간. </li></ol> 형광 현미경 4. 섬유 이미징 <ol><li> FITC, Cy5에 도트와 Q (655)와 연결된 감지 완전히 동력 필터 휠 거꾸로 현미경에 63X 대물 렌즈를 통해 이미지 획득을 수행한다. 상기 여기 필터는 425 ㎚이며, 배출 필터는 발광 피크 (20)를 중심으로 20 개 내지 655 ㎚이다. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
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레이저 현지화 기술은 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다 핵에 부착 세포의 사용을 필요로한다. 우리는 리신 또는 콜라겐, 또는 더 복잡한 혼합물로서 세포 접착 제제로 유리 표면에, 예컨대 차 림프구 또는 AD293 느슨하게 접착 배양 된 세포와 같은 비 접착 성 세포를 부착하는 것을 시도했다. 이러한 치료는 표면에 세포를 결합 할 수 있지만, 우리는 그들이 일반적으로 매우 어려운 핵에 집중하고 둥근 머물 것을 찾을 수 있습니다. 또한, 세포들은 성장 배지를 제거한 후, 세척, 초기 생존하지 못한다. 그러나, 접착 세포에 대한 요구 사항 내에서, 우리는 성공적으로이 연구에 대한 표준 셀 라인의 다양한뿐만 아니라 일차 전지를 사용하고 있습니다. 마이코 플라스마 오염에 대한 세포를 테스트하는 데 유용합니다. 우리는 세포 반응은 이러한 감염에 의해 변경되는 것을 찾을 수 있습니다. 레이저의 초점면은 중요하다. 목표는이다핵 내에서 ICLS를 놓습니다. 너무 높은 및 photoacti...

DNA는 또한,도 산화 적 대사에 의해 생성 된 내인성 라디칼 종에 의해 공격 등의 방사선, 자외선, 환경 독소, 연소 생성물과 같은 외래 에이전트로부터 일정한 공격을 받고있다. 이 모든 화학적 또는 물리적으로 DNA 1의 무결성을 방해 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 게놈의 교란은 병변 수리에 관여하는 단백질과 마이크로 RNA하지 않을 경우 수천, 수백와 DNA 손상 응답 (DDR), 모집 및 사후 번역 수정 캐스케이드를 활성화 할 수 있습니다, 세포주기, 세포 사멸, 노화 및 염증 경로의 조절 2. 동독에 대한 우리의 정보의 대부분은 DSBs와 연구에서 비롯됩니다. 이는 3 살아있는 세포 게놈 DNA에서 서열 특이 나누기 포함 나누기를 도입하기위한 기술의 유용성에 큰 부분이다. 또한, propensit중단의 예는 면역에 의해 표시 될 수 DDR 단백질의 초점을 유도하는 단계, 및 반응 속도론 단백질의 요구를 식별하는 매우 유용하고있다. 동독 연구를위한 핵심 기술 중 하나는 살아있는 세포 4의 핵에 &#39;관심 지역&#39;에 DSBs의 스트라이프를 직접 (ROI)을 레이저 빔을 사용 보너와 동료에 의해 소개되었다. 실제로, 그들은 DDR의 단백질이 면역 식별 할 수있는 긴 초점을 만들었습니다. 이것은 레이저 노출 된 세포에서 인산화 된 히스톤 H2AX의 강한 스트라이프 (γ-H2AX) 그들의 증명에 의해 설명되었다. 이후 레이저 DSBs 접근법에 의해 유도되는 DDR의 다양한 연구에 이용되어왔다. 강력하고 인기 극적인 면역 형광 이미지의 소스 있지만,이 병변의 정체성에 대한 걱정없이, 관찰 결과를하기 위해 대부분의 실험에서 레이저 강도를 조절 주목해야한다밀도, 또는 간격. 사실, 이러한 추정을하기 어려울 수 있습니다. 따라서 그들은 주로 레이저 (5)에 의해 DNA에 도입 병변의 다양성에도 불구하고, 무시됩니다. 이 문헌 6에있는 많은 모순에 기여한다. DSBs는 대조적으로, 대부분의 DNA의 화학적 변형은 DDR 단백질 이산 초점의 형성을 자극하지 않는다. 이 병변 주파수의 우리의 현재 이해의 관점에서 중요하다. 인간 배양 세포는 S 단계 7, 8, 9 중 주로 형성된 세포주기 당 50 개 DSBs을 초래한다는 것이 추정된다. 적은 비 증식 세포에서 형성된다. 이것은 세포 / 1 일, 10 당 수만에있는 핵산 염기 손실 또는 수정 이벤트의 수와 대조를 이룬다. 따라서, 우리는 가장에 대해 알고비교적 드문 및 집계에서 훨씬 더 일반적이다 나선 왜곡 병변에 의해 유도 된 사람들에 대해 많은 작은 사건에 의해 유도 된 DDR. 게놈 DNA의 수정을 공유 결합하는 세포 반응에 대한 질문을 해결하기 위해, 우리는 고유의 DDR 유도 활동을했다 나선 왜곡 DNA 부가 물로 작업하고 싶었다. 또한, 실험 설계를 용이하게하고 해석 우리는 누구의 소개 시간에 대한 제어 및 시각화 의무가 있었다 될 수있는 구조에 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 소 랄렌에 기초한 전략을 개발했다. 현장에서 : Psoralens 잘 5 &#39;TA를 선호 광활성 DNA에 인터 칼을 특징으로한다. 질소 머스타드 및 마이 토마 이신 C (MMC)들은 장파장 UV (UVA) 광에 노출하지 않는 DNA 반응성 아닌 다른 가교제 달리. 인터 분자 나선 왜곡 interstrand 가교 결합을 생성하기 위해 반대 가닥의 티민 염기 (ICLS 반응) 11. 실험에 사용 된 트리메틸 랄렌 대부분의 제품은 형성되어 있지 않은 비교적 적은 monoadducts가 (10 % 미만) 생성 ICLS, 12, 한 가닥에 인접 염기 간의 intrastrand 가교이다. 그들은 시스 백금과 MMC 등의 복제와 전사, 소 랄렌 등의 가교제, 강력한 블록이기 때문에, 일반적으로 화학 요법에 사용됩니다. 따라서 랄렌 나선 구조의 왜곡으로 DDR의 활성화에 따라, 또한 임상 적 중요성이있는 화합물에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공 연구 할 수 있었다. 우리는 트리메틸 랄렌 (파기)를 디곡시 제닌에 링크시킨 시약을 합성 식물성 스테롤은 포유 동물 세포에서 발견 자주 immunotag으로 사용되지. photoactivation 대한 요구는 살아있는 세포의 핵에서 정의 된 ROI에 랄렌 ICLS의 레이저 광 (365 ㎚)으로 현지화를 허용한다. 이들은 IMM를 표시 할 수 있습니다발굴 태그에 대한 unofluorescence. DNA 수리 및 DDR 단백질 ICLS 13, 14 국소 레이저 스트라이프 나타났다. DSBs을 생산하는 데 사용 높은 레이저 강도에 의해 활성화 된 DDR 절연 또는 클러스터 손상 15, 16 때문일 수 있습니다. 따라서,이 실험 결과의 관련성 자연스럽게 병변 본 훨씬 낮은 농도로 발생하는 불확실하다. DNA의 소 랄렌 부가 주파수 및 간격에 대해 비슷한 질문을 해결하기 위해, 우리는 DNA 섬유 기술 17 immunoquantum 점을 이용했다. 양자점은 형광 염료보다 훨씬 더 밝은 빛에 노출 표백되지 않는다. 따라서 이들은 종종 단일 분자 이미징 (18)에 사용되는, 애플리케이션되는 형광 염료는 충분히 밝다. 개별 DNA 섬유 g에서 신장 될 수있다아가씨 슬라이드는 수확 셀에 앞서 배양 중에 혼입 클레오 사이드 유사체에 대해 면역 형광에 의해 표시 될 수있다. 우리는 땅을 파고 - 소 랄렌과 세포 치료 및 레이저 마이크로 조사에 대한 투자 수익 (ROI)을 노출. 섬유는 immunoquantum 점으로 가시화 될 수있는 셀의 개별 파기 랄렌 - 부가 물로부터 제조되었다. 상대적으로 짧은 시간 (20~60 분)에 대한 뉴 클레오 시드 유사체를 위해 세포를 노출시키는 레이저 국소 ICLS 근방 복제 책자의 표시를 허용한다.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenin NHS 에스테르</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>Chloro-psoralen</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>디아미노글리콜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>TLC 플레이트</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Flass 유리 기둥 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 회전 디스크 컨포칼 현미경, 자동 스테이지 및 환경 제어 챔버 및 플레이트 홀더 장착</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Volocity Software</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>질소 펄스 레이저를 사용한</td> <td>Andor Technologies</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>염료 셀</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365 365</td><td></td></tr><tr><td>염료</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 유리 botomm 플레이트 1.5 커버슬립, 10 mm 유리 직경, 코팅되지 않은</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>새로운 Comer 공급</td><td>부품 # 5070</td><td>새로운 실란 슬라이드</td></tr><tr><td>마우스 anti BrdU 항체 (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 in 40</td></tr><tr><td>Rat anti BrdU 항체 (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 in 200& 주의;</td></tr><tr><td>토끼 안티 Dig 항체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 in 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 염소 안티 토끼 IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 in 5,000</td></tr><tr><td>AF647- 염소 안티 쥐 IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>AF488-염소 안티 마우스 IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 in 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent 현미경 A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; Axiovision 소프트웨어</td></tr><tr><td>Q-dot 655 필터</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr> 포함</tbody></table>

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

한 DNA 손상 반응 (DDR)는 광범위 생균 마이크로 레이저 빔 조사에 의해 유도 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)의 연구에있어서되었다. 동독은 interstrand DNA에 크로스 링크 (ICLS)를 포함하여 DNA의 공유 개조를 왜곡하는 나선뿐만 아니라, 정의되지 않는다. 우리는 살아있는 세포의 핵에, immunotagged psoralens의 레이저 photoactivation 현지화 ICLS에 의해 자극 DDR을 공부했다. 부가 배포 및 복제 포크의 만남에 대한 근본적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 두 개의 다른 기술과 레이저 현지화를 결합했다. DNA 섬유는 종종 짧은 펄스 중에 혼입 클레오 사이드 유사체의 면역에 의한 복제 포크의 진행을 표시하기 위해 사용된다. Immunoquantum 점은 널리 단일 분자 이미징을 위해 사용되어왔다. 새로운 방식으로, 레이저 국소 ICLS 운반 세포로부터 DNA 섬유 현미경 슬라이드 상에 확산된다. 태그가 달린 ICLS는 immunoquantum 점 및 일 함께 표시됩니다E 간 거리 병변 결정. ICLS와 복제 포크의 충돌이 가시화 될 수 있으며, 다른 만남 패턴 확인 및 정량.

레이저 지역화 파고-TMP (그림 1A) ICLS는 소 랄렌에 연결 발굴 태그에 대한 면역 형광 표시 할 수 있습니다. 레이저 임의 형상의 영역에서 공격 지시 할 수 있지만, 줄무늬 세포 &quot;자연&quot;형상없고, 정당한 신호 용이 의한 일차 또는 이차 항체에 의한 비특이적 결합 아티팩트 구별 될 수있다. 완벽한 특이 이하의 항체를 사용하는 경우이 기능을 사용하면 도움이된다. 파기-TMP ICLS의 스트라이프의 DDR, γ-H2AX의 공지 된 마커의 예는도 1b에 도시된다. 발굴의 면역 형광은 부가의 빈도와 간격과 같은 결론을 허용하지 않습니다 레이저 스트라이프 병변 태그. 확인하기 위해이 판정 세포 전에 ICLS 도입로 24 시간 동안 배양 하였다 CldU. 제 대하여 염색E CldU는 파...

레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

본 절차의 전반적인 목표는 게놈 DNA 내 레이저 국소화 가닥 간 교차결합의 분포를 단일 분자 분석하여 DNA 가닥 간 교차결합에 대한 세포 반응을 연구하는 것입니다. 이 방법은 널리 사용되는 실험 도구인 레이저 기술에 의해 도입된 DNA 손상의 분포와 관련하여 DNA 복구 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 레이저 활성 화합물에 의해 게놈 DNA에 도입된 DNA 손상을 직접 이미징할 수 있다는 점입니다.이전에는 이것이 불가능했습니다. 실험 절차의 시연은 저희 연구실의 Julia Gichimu와 Hima Gali가 맡겠습니다. 타겟팅 레이저를 사용할 때마다 미러 슬라이드 캘리브레이션을 수행하여 레이저가 적절한 XYZ 좌표에 조사되고 있는지 확인하고, 레이저가 조사될 수 있도록 설정 가능한 카메라 캡처 영역을 설정하는 것이 중요합니다.이전에 식각된 슬라이드의 영역을 찾습니다. 노출 시간과 레이저 출력을 설정하십시오. 그런 다음 초점을 조정하여 미러 슬라이드 상의 인접한 비표적 영역으로 이동합니다.교정 절차를 시작하십시오. 소프트웨어가 레이저를 발사하여 미러 슬라이드에 수평 및 대각선 방향으로 식각을 수행합니다. 이 선들은 레이저가 표적 세포를 타격할 수 있는 영역의 경계를 정의합니다.시야 내에 여러 개의 관심 영역(region of interest, ROI)을 설정하고 레이저를 조사하여, 선택한 영역을 정확히 조준하고 있는지, 즉 적절한 XYZ 좌표를 타격하고 있는지 확인하십시오. 현미경 타겟팅 레이저 시스템을 설정할 때 생물학적 보정 또한 수행해야 합니다. 첫 번째 단계는 트리메틸소랄렌(trimethylpsoralen, TMP)을 광활성화하고, 가닥 간 교차 결합을 유도하며, 이전에 그 역학이 규명된 GFP 태그 수리 인자의 모집을 유도하는 데 필요한 최소 레이저 출력을 정의하는 것입니다.본 실험에서는 GFP-FAN1을 발현하는 플라스미드가 안정적으로 형질전환된 U2OS 세포주를 사용합니다. 여기에서 보여주는 바와 같이, 세포를 6 µM TMP와 1.2% 레이저 이미지에 10분 동안 노출시킨 후 이미지 시퀀스를 비디오로 확인하면, 표적 ROI로 GFP-FAN1이 모집되는 것을 확인할 수 있습니다. 다음 단계는 해당 출력 설정이 화합물이 없는 상태에서는 모집을 유발하지 않는지 검증하는 것입니다.여기서 보는 바와 같이, 세포를 1.2% 레이저에만 10분 동안 노출시키고 그 이미지를 비디오로 관찰했을 때, 표적 ROI로의 GFP fan one 모집은 일어나지 않습니다. 셋째로, 세포를 파괴할 수 있는 최소 출력 설정을 정의하는 것이 중요합니다. 이 출력 설정에서 세포를 파괴할 수 있는 능력은 타겟팅 레이저를 사용하는 매일의 일상적인 생물학적 교정 단계에서 테스트되어야 합니다.인핵 내에 ROI를 설정하되 인은 제외하십시오. 초점을 조절합니다. 레이저 출력을 12%로 설정하고 조사하십시오.마지막으로, 정확한 타겟팅을 달성하기 위해서는 초점 평면을 세포의 중앙에 설정하는 것이 필수적입니다. 이를 입증하기 위해 세 개의 세포를 세 가지 초점 평면에서 타겟팅합니다. 세포 중앙.너무 높거나 너무 낮은 경우입니다. 촬영된 초점 평면 전체에서 GFP fan one stripe의 분포를 확인하기 위해 3µm 범위의 이미지 스택을 타겟팅한 후 3분 뒤에 생성합니다.중앙 세포를 대상으로 한 세포에서만 모든 Z 평면에서 GFP 팬 원 스트라이프(fan one stripe)가 나타납니다. 레이저 국소화(laser localization)를 수행하기 전, 세포 배양을 위해 35 millimeter 유리 바닥 세포 배양 접시를 준비하십시오. 마킹 펜을 사용하여 각 접시의 측면에 수직 표시를 하십시오.다이아몬드 펜을 사용하여 배양 표면의 유리 중앙에 십자 표시를 긋고, 이때 디시 측면의 검은색 띠가 십자 표시의 한쪽 팔 상단에 위치하도록 합니다. 십자 표시를 유리의 성장 표면에 표시하여 표시 부분과 세포가 동일한 초점 평면에 있도록 합니다. 세포를 십자 표시가 된 멸균 배양 디시에 분주하고, DNA를 균일하게 표지하기 위해 1 µM 5-chloro-2'-deoxyuridine이 포함된 배지에서 24시간 동안 배양합니다.실험 당일에 50% 에탄올에 녹인 digoxigenin 결합 TMP 또는 dig TMP를 세포 배양 배지에 최종 농도가 20 micromolar가 되도록 첨가합니다. 배지를 37 degrees Celsius로 맞춥니다. 배양 접시의 배지를 dig TMP가 포함된 배지로 교체하고 37 degrees Celsius 및 5%CO2 조건에서 30분 동안 배양하여 dig TMP가 평형을 이루도록 합니다.세포를 배양하는 동안, 앞서 시연한 바와 같이 미러 슬라이드 보정과 세포의 12% 블로우 아웃(blow out)을 수행하십시오. 플레이트를 CO2와 습도가 조절되는 37 °C의 환경 챔버 내 현미경 스테이지 위에 놓으십시오. 60X 오일 대물렌즈를 사용하여 십자선의 교차점에 초점을 맞추십시오.타겟팅할 첫 번째 영역을 선택하고, 도형 도구를 사용하여 십자 교차점 바로 인근에 위치한 개별 세포 내의 ROI를 설정하십시오. 인(nucleoli) 외부의 핵질 영역을 선택하십시오. Z 초점 평면을 조정하여 레이저가 핵의 중간 지점을 타겟팅하도록 설정하십시오.다음으로, 가닥 간 교차결합으로 유도된 DNA 손상 반응에서 소랄렌(psoralen)을 활성화하는 데 필요한 최소 전력 설정으로 맞춥니다. 여기서는 1.2%가 사용됩니다. 레이저를 조사합니다.한 시야 내의 모든 세포를 타겟팅한 후, 십자선 교차점 부근을 유지하며 플레이트를 새로운 시야로 이동시킵니다. 총 80~100개의 세포를 타겟팅하기 위해 방금 시연한 절차를 12~18개의 시야에서 반복합니다. 세포를 수확하려면 배양 접시를 스테이지에서 제거하십시오.배지를 제거하고 PBS 용액으로 세포를 세척합니다. PBS를 제거하고 유리 표면 중앙에 있는 십자 표시의 교차점에 상용 trypsin EDTA 용액 10 µL 한 방울을 떨어뜨립니다. 실온에서 3~4분 동안 배양한 후, 분리된 세포가 포함된 trypsin 용액을 피펫 팁으로 흡입합니다.실란화된 유리 현미경 슬라이드 한쪽 끝에 세포가 포함된 trypsin EDTA 방울을 떨어뜨립니다. 세포를 용해하고 DNA를 방출시키기 위해 5% SDS 용액 10 µL를 가하고, 피펫 팁으로 부드럽게 섞으며 실온에서 3~4분 동안 배양하여 액체 웅덩이의 주변부가 마르게 합니다. 슬라이드를 20도 기울여 액체가 끝부분으로 흘러내리게 합니다.흐르는 액체의 유체역학적 힘이 DNA 섬유를 확장하고 늘려줍니다. 슬라이드를 10분 동안 자연 건조시키십시오. 슬라이드를 메탄올과 아세트산의 3:1 혼합 용액에 담가 10분 동안 고정합니다.그 다음 슬라이드를 고정액에서 꺼내어 다시 공기 중에서 건조시킵니다. 이 단계에서 슬라이드는 20 °C의 70% ethanol에 보관하여 무기한 보관할 수 있습니다. 형광 현미경을 통해 DNA fiber 상의 dig 신호를 검출하기 위해 슬라이드를 처리하려면, stretched DNA가 있는 슬라이드를 70% ethanol 용액에서 꺼내어 공기 중에서 건조시킵니다.이후 염화수소에서 DNA 섬유를 변성시킨 다음, 중화를 위해 pH 8의 tris hydrochloric 용액이 담긴 용기로 옮깁니다. 다음으로 PBS로 샘플을 세척합니다. 마지막으로, 이전에 발표된 절차에 따라 적절한 항체로 염색합니다.dioxigenin 태그가 결합된 trimethylpsoralen의 구조가 제시되어 있습니다. 가닥 간 DNA 교차결합(Interstrand DNA crosslinks, ICLs)은 dig TMP에 대한 면역 형광 염색을 통해 나타낼 수 있습니다. 본 예시는 적색으로 시각화된 레이저 국소 ICLs가 포함된 ROI 내에서, DNA 손상 반응의 잘 알려진 마커인 gamma H2AX가 녹색으로 시각화되어 축적된 세포들을 보여줍니다.DAPI로 염색된 핵은 파란색으로 표시됩니다. 명시야(bright field) 이미지에서는 다이아몬드 펜으로 표시한 지점 위에 세포가 일부 걸쳐 있는 것을 볼 수 있습니다. ROI는 인(nucleoli) 외부로 설정되었음에 유의하십시오.어덕트(adduct)의 빈도와 간격을 결정하기 위해, ICL을 도입하기 24시간 전에 세포를 5-chloro deoxyuridine과 함께 배양하였습니다. 세포를 회수하고 DNA 섬유를 펼친 후, dig 신호는 적색으로 시각화된 amino quantum dot으로 검출하였으며, 5-chloro deoxyuridine은 녹색으로 시각화된 amino 형광으로 검출하였습니다. 섬유상의 dig 신호를 분석한 결과, ICL 간의 거리는 10 KB 미만에서 160 KB 이상까지 나타났습니다. 어덕트가 군집을 이루었다는 증거는 없었습니다.이러한 가이드라인을 따르면 적절한 파장의 레이저로 국소화할 수 있는 산화적 손상과 같은 다른 DNA 부가물로 이 접근 방식을 확장하는 것이 가능할 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 영상을 보여줍니다. 미세유체 설정과 펩타이드 결합 플라즈몬 나노구조 칩을 사용하여 공명 각도에서 반사광 강도의 변화는 단일 세포에서 분비된 단백질과의 상호 작용을 보여줍니다.

단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 이미징

우리는 HF의 시츄 변경이 2 O 2 / H 2 O 용액 (0.01 % -0.5 %) 또는 메탄올 용액 H로 채워진 미세 유체 챔버에서 샘플을 조사함으로써 친수성 또는 소수성 상태의 Si (001) 표면 처리에서의 공정보고 상대적으로 낮은 펄스 UV 플루 언스의 레이저 펄스를 사용.

액체 환경에서의 펄스 자외선 레이저 조사에 의한 실리콘 표면의 젖음성의 선택 영역 수정

전자 분광 이미징은 나노미터 해상도로 핵산과 단백질을 이미지화하고 구별할 수 있습니다. 이 시스템은 투과 전자 현미경 샘플에서 태그가 지정된 단백질을 특이적으로 라벨링할 수 있는 miniSOG 시스템과 결합할 수 있습니다. 이중 가닥 파단 복구 초점을 예로 들어 이러한 기술의 사용을 설명합니다.

전자 분광 이미징과 결합 miniSOG 태그 DNA 복구 단백질의 시각화 (ESI)

이 프로토콜의 목표 레이저 microirradiation를 사용 하 여 다른 유형의 DNA 손상, 비교적 간단한 가닥 나누기 등 복잡 한 손상, DNA 손상 신호 및 복구 요소에서 어셈블리 피해 사이트 vivo에서 공부를 유도 하는 방법을 설명 하는 것입니다. .

간단 하 고 복잡 한 DNA 손상에 세포질 응답 Vivo에서 공부 레이저 Microirradiation

공초점 형광 현미경 검사 법 및 레이저 마이크로 조사 제공 도구 DNA 손상 유도 및 선택한 하위 핵 분야에서 DNA 수 선 단백질의 응답을 모니터링. 이 기술은 크게 손상 감지, 신호, 및 채용의 우리의 지식의 전진 했다. 이 원고에서는 단일 및 이중 가닥 브레이크 수리 검사 이러한 기술을 보여 줍니다.

단일의 검사 및 포유류 세포에서 이중 가닥 브레이크 수리에 대 한 레이저 마이크로-방사선의 응용

DNA 손상 복구 속도 론을 공부 하 고 정의 된 하위 핵 지역에서 병 변 유발 하는 시스템이 필요 합니다. 레이저 검사 confocal 현미경 405 nm 레이저 장비를 사용 하 여 지역화 된 이중 가닥 나누기를 만들고 이러한 병 변에서 수리 요인의 역학을 계량 하는 자동화 된 절차를 제공 하는 방법을 설명 합니다.

단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

여기, 선물이 단일 분자 수준에서 복잡 한 단백질 견본에서 각 단백질 종에 대 한 라벨 동질성을 평가 하는 프로토콜.

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

우리는 병 변의 민감하고 정확한 정량화를 위한 방법을 여기에 설명 합니다. 8-옥 소-7, 8 디 하이드로 deoxyguanosine),1n6조-2-deoxyadenosine 및1, n6조-2dado deoxyguanosine (1,n2-dguo) DNA에. 이 방법은 노출 된 A/J 마우스의 조직 (폐, 간 및 신장)에서 주변 미세 미 립 자 물질 (PM2.5)의 영향에 대 한 평가에 적용 되었다.

질량 분 광 법에 의해 3 개의 DNA 병 변의 정량화 및 주변 미세 입자 상 물질에 노출 된 마우스의 조직에서 그들의 수준에 대 한 평가

이 프로토콜은 플래시 산화 단백질 발자국을 수행하기 위해 인라인 라디칼 도시메트리와 플라즈마 광원을 사용하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 단백질 연구의 빠른 광화학 산화의 재현성을 단순화하고 개선하기 위해 위험한 UV 레이저를 대체합니다.

레이저가 없는 하이드록실 라디칼 단백질 발자국은 단백질의 고주 구조 분석을 수행합니다.

이 프로토콜은 레이저 미세 조사에 의한 DNA 수리 단백질 모집 측정과 같은 하류 현미경 연구를 위한 S상 세포를 효율적으로 식별하는 비침습적 방법을 설명합니다.

S 단계 동안 DNA 모집을 연구하는 레이저 미세 조사

레이저 미세 해부를 통해 인간 사후 흑질 관절 조직으로부터 뉴멜라닌 과립을 분리하기 위한 강력한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 이 개정 및 최적화된 프로토콜은 샘플 수집에 필요한 시간을 크게 최소화하고 필요한 샘플 양을 줄이며 LC-MS/MS 분석을 통해 단백질의 식별 및 정량을 향상시킵니다.

뉴로멜라닌 과립의 단백질체 프로파일의 LC-MS/MS 분석을 위한 레이저 미세 해부 기반 프로토콜

학습하세요 레이저로 국소화된 DNA 가닥간 교차결합의 단일 분자 분석 방법을 통해 세포의 DNA 손상 반응을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 유전체 DNA에서 레이저 활성화 화합물에 의해 유도된 손상을 직접 영상화하여 DNA 복구 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

레이저 지역화 소라렌 부가 물의 단일 분자 분석

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