차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

본 절차의 전반적인 목표는 차세대 전기천공법(electroporation)을 사용하여 일차 인간 T 세포에 소형 RNA 시약을 효율적으로 형질전환하는 것입니다. 이 방법은 특정 유전자 산물이 T 세포 분화와 면역 기능을 어떻게 조절하는지와 같은 T 세포 생물학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일차 인간 T 세포에 sRNA 및 기타 합성 소형 RNA 시약을 형질전환하는 매우 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법이라는 점입니다.

이 방법은 인간 Th17 세포의 생물학적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 인간 또는 마우스의 다른 림프구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 0일 차에, 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS에 희석한 항인간 CD3 및 항인간 CD28을 1.5 mL씩 코팅하여 37 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 제대혈 단핵구(CBMC)를 분리하고 세척한 후, 상용 인간 CD4 양성 T 세포 키트를 사용하여 음성 선택 방식으로 CD4 양성 T 세포 분리를 수행합니다.

분리 버퍼를 추가하고 단핵구를 재부유시킵니다. 세포를 새로운 5 mL 튜브로 옮긴 후, 튜브당 100 µL의 소태아혈청(FBS)과 100 µL의 항체 혼합물을 추가하고, 오비탈 쉐이커에서 4 °C로 20분 동안 배양하여 충분히 혼합합니다. 배양 후, 세포를 세척하기 위해 3~4 mL의 분리 버퍼를 추가합니다.

세포를 4 °C에서 300 ×g로 8분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 자성 비드를 새 튜브로 옮기고, 비드를 세척하기 위해 동일한 부피의 분리 버퍼를 추가합니다.

1 mL 마이크로피펫을 사용하여 비드를 잘 섞은 다음, 튜브를 자석에 최소 1분 동안 둡니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 세척 전 처음에 옮겼던 양과 동일한 부피로 자기 비드를 다시 현탁합니다. 각 튜브에 500 µL의 분리 버퍼를 첨가하여 세포를 재현탁한 후, 미리 세척된 자기 비드 500 µL를 첨가합니다.

세포와 자기 비드를 오비탈 쉐이커를 이용해 상온에서 15분 동안 배양하여 충분히 혼합합니다. 배양 후, 1mL 마이크로피펫을 사용하여 세포를 최소 10회 이상 충분히 피펫팅한 다음, 분리 버퍼 3~4mL를 첨가하고 각 튜브를 자석에 2분 동안 놓아둡니다. 상층액에 있는 음성 선택된 CD4 양성 T 세포를 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

CD4 양성 T 세포 분리가 완료되면, 세포를 얼음에 보관하고 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 항체가 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 2배 농도의 Th17 분화 유도 배지 1.5 milliliters를 첨가합니다. 다음으로, 인간 CD4 양성 T 세포를 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.

상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 다음, 혈청이 없는 기본 배지에 세포를 재부유하고, 웰당 최종 부피가 3 mL가 되고 분극화 사이토카인의 최종 농도가 1X가 되도록 세포를 분주한 후, 5% CO2 및 37 °C 인큐베이터에서 2일 동안 배양합니다. 2일 차에, 48웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 calcium과 magnesium이 포함된 PBS에 희석한 antihuman CD3 및 antihuman CD28을 250 µL씩 코팅하여 37 °C에서 최소 2시간 동안 반응시킵니다. 형질전환용 small RNA를 준비하려면, 각 형질전환당 5 µM siRNA 스톡 용액 1 µL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 각각 분주합니다.

모든 튜브를 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 항체가 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 각 웰에 1X Th17 분화 배지 500 microliters를 첨가합니다. 배양 플레이트와 형질전환 시약이 준비되면, 1 milliliter 마이크로피펫을 사용하여 세포를 다시 부유시키되, 모든 세포가 웰 바닥에서 떨어지도록 부드럽게 피펫팅하십시오.

세포를 원추형 튜브에 모은 뒤 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 다음, 세척을 위해 최소 1 mL의 PBS에 세포를 재부유시킵니다. 헤모사이토미터를 사용하여 살아있는 Th17 세포의 수를 측정하고, trypan blue 배제법으로 생존율을 평가한 후, 마이크로 원심분리 튜브에서 세포를 펠렛화합니다.

상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 키트에 제공된 재현탁 버퍼를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 세포는 실온에서 보관하십시오. 각 마이크로원심분리 튜브에 1 µL의 small RNA와 9 µL의 세포를 첨가합니다.

세포와 transfection을 위한 소형 RNA를 혼합하기 위해 한 번 피펫팅한 후, 제공된 피펫 전극 팁에 세포를 로딩합니다. 최적의 transfection을 위해 transfection 전 피펫 전극 팁에 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오. 전기천공법 피펫 내에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 충분한 양의 혼합물이 확보되도록 9.5 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다.

제공된 큐벳에 상온의 전기분해 버퍼 3 mL를 채웁니다. 큐벳을 네온 피펫 스테이션(neon pipet station) 안에 넣은 다음, 피펫을 큐벳 내부의 정해진 위치에 배치합니다. 세포와 소형 RNA가 혼합된 10 µL 혼합물을 즉시 전기천공합니다.

전기천공이 완료되면, 세포 혼합물을 배양 플레이트의 준비된 웰에 담긴 500 µL의 1X Th17 분화 배지에 직접 첨가합니다. 마지막으로, 플레이트를 5% CO2, 37 °C 인큐베이터에 넣고 이틀 더 배양합니다. 세포 사멸을 방지하기 위해 신속하고 주의 깊게 작업하십시오.

전기천공법을 수행할 샘플이 많은 경우, 세포를 수집하여 배치별로 형질전환할 수 있습니다. 이 등고선 도표(contour plot)는 Th17 분화 조건에서 배양된 T 세포가 케모카인 수용체인 CCR6와 전사 인자인 ROR gamma T를 발현한 반면, 비분화 조건에서 배양된 T 세포에서는 이들이 발현되지 않았음을 보여줍니다. 또한 Th17 분화 조건에서 배양된 T 세포는 재자극 시 IL-17A를 생성했으나, ThN 조건에서는 생성하지 않았습니다.

small RNA를 통한 transfection 후에도 Th17 분화는 여전히 일어나지만, 일부 실험에서는 IL-17A 생성 빈도의 감소가 관찰됩니다. 이는 각 실험 내에서 비교를 위해 화학적 조성이 일치하는 small RNA 대조군을 확보하는 것이 중요함을 보여줍니다. small RNA transfection 후에도 세포 생존율은 유지되며 일반적으로 70% 이상입니다. 2일 차에 CD45를 인코딩하는 PTPRC 유전자를 표적으로 하는 siRNA 풀을 인간 Th17 세포에 transfection한 결과, 화학적 조성이 일치하는 대조군 siRNA에 비해 CD45의 발현이 크게 감소했습니다.

여기서 보이는 CD45 발현의 단일 모드 인구 이동은 거의 100%의 형질전환 효율을 나타냅니다. RNAi를 통해 ROR gamma T 발현을 감소시킨 결과, 이 세포들은 대조군 siRNA를 형질전환한 세포들에 비해 IL-17A 생성 감소라는 기능적 효과를 보였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 차세대 전기천공법을 사용하여 인 비트로(in vitro) 분화된 인간 Th17 세포에 소형 RNA를 형질전환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.