Name: 차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 학습하세요 차세대 일렉트로포레이션을 이용한 인간 Th17 세포의 소형 RNA 형질도입 기법을 통해 T 세포 분화와 면역 기능 연구를 수행하는 방법을 알아보세요.

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이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금(R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), 백혈병 및 림프종 학회 학자상(K.M.A.), 미국 국립일반의학연구소(NIGMS) 의학과학자 교육 프로그램(보조금 #T32GM007618)(M.M.)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 인간의 연구 윤리에 대한 UCSF의 지침을 준수합니다. T 세포 배양, CD4 + T 세포의 분리와 Th17 분극 1. 제조 <ol><li> 0 일에, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 1.5 ㎖의 코트 6 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C. <ol><li> 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸. </li></ol></li><li> 제조업체의 지침에 따라 밀도 구배 원심 분리하여 제대혈 단핵 세포 (CBMCs)를 준비합니다. 주의 :주의 깊게 작업 및 혈액 매개 병원균에 노출의 위험을 피하기 위해 인간의 피를 처리 할 때 착용 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 확인합니다. </li><li> 단핵 세포를 분리하여 세척 한 후, 음극 실리 의해 인간 CD4 + T 세포의 분리를 수행ction 특 상업용 인간 CD4 + T 세포를 이용하여 키트. 참고 : 단핵 세포 분리 후 적혈구 오염이있는 경우, 옵션 적혈구 세포 용해가 CD4 + T 세포의 분리 단계 이전에 수행 될 수있다. 차단 완충액 (PBS 2 % FBS)의 1 mL의 단핵 세포를 재현 탁. 1 배 용균 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 실온에서 15 분 동안 인큐베이션. 그런 다음 세포 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 300 XG에 차단 완충액 원심 5 mL를 추가한다. <ol><li> 새로운 5 ㎖ 튜브에 차단 완충액 500 μL 당 50 × 106의 밀도에서 단핵 세포를 재현 탁. </li><li> FBS 100 μL 후 잘 섞어 오비탈 진탕 기에서 20 분 동안 4 ℃에서 각각 배양 튜브를 튜브 당 항체 믹스 100 μL를 추가한다. </li><li> 배양 후, 세포를 세척 버퍼 분리 3-4 mL를 첨가. 세포 펠렛을 39 ° C에서 8 분간 300 XG에 세포를 원심 분리기. 조심스럽게 공중으로 대기음rnatant. </li><li> 이 회전하는 동안, 자기 구슬을 미리 씻는다. (1에서 사용했을 때 세포로 1) 새로운 튜브에 자성 비드의 원하는 양을 옮기고 비드를 세척 완충액 분리 동량을 추가한다. 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 잘 혼합 한 다음, 적어도 1 분 동안 자석에 튜브를 놓는다. 조심스럽게 뜨는을 대기음. 초기 세척 전에 전송 된 동일한 부피의 자성 비드를 재현 탁. </li><li> 분리 완충액 500 μL 각 튜브에 세포를 재현 탁 및 사전 세정 자성 비드 500 μL를 추가한다. </li><li> 잘 섞어 상온 (25 ° C 내지 18 ° C)에서 오비탈 진탕 기에서 15 분 동안 자성 비드와 세포를 인큐베이션. </li><li> 인큐베이션 후, 충분히 1 mL의 마이크로 피펫을 적어도 10 배를 사용하여 세포를 피펫. 이어서 분리 버퍼 3-4 mL를 첨가하고 2 분 동안 상기 자석의 각각의 튜브를 배치했다. </li><li> 조심스럽게에있는 부정적인 선택 CD4 + T 세포를 전송새로운 튜브에 뜨는. </li></ol></li><li> CD4 + T 세포의 분리가 완료되면, 혈구와 세포를 계산하고 얼음에 세포를 유지한다. </li><li> PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 이어서 각 웰에 Th17 - 편광 미디어 1.5ml의 배의 혼합물을 추가 항 - 인간 IFNγ (20 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (20 ㎍ / ㎖) 인간 TGFβ (10 NG / ㎖) 인간 IL-1β (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (40 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (50 NG / ㎖) 총 2 mM의 L- 글루타민이 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 100 U / ㎖ 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올). 참고 : 형질 및 RNA 간섭 혈청 함유 미디어에서 작업을 수행합니다. 이 프로토콜과 혈청이없는 미디어를 사용하는 목적은 더 나은 IL-17의 생산을 달성하는 것입니다. </li><li> 원심 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 인간 CD4 + T 세포는 세포 펠렛. 조심스럽게 supernat를 대기음개미. 그런 다음, 최종 부피가 웰 당 3 ㎖이고 편광 사이토킨은 1X 최종 농도 이제 잘되도록 1.5 mL의 3 × 106의 밀도로 세포를 무 혈청베이스 미디어 세포를 재현 탁하고 접시. <ol><li> 5 % CO 2에서, 이틀 동안 37 ° C의 배양기 판을 놓는다. </li></ol></li></ol> 2. 일렉트로 체외 편광 인간 Th17 세포 <ol><li> 제 2 일, CD3에게 항 - 인간 (2 ㎍ / ㎖) 및 항 - 인간 CD28의 웰 당 250 μL로 코팅 48- 웰 조직 배양 플레이트 (4 ㎍ / ㎖), 적어도 2 시간 동안 칼슘 및 마그네슘에 함께 PBS에서 37 ° C. <ol><li> 대안 적으로, 코트 밤새 39 ° C에서 플레이트. 파라 필름에서 접시를 감싸. </li></ol></li><li> 형질 전환을위한 작은 RNA를 준비. 각 형질 1.5 ML의 마이크로 원심 튜브에 siRNA를 5 μM 스톡 용액의 분취 액 1 μL. 적절한 화학 - 일치하는 작은 RNA의 제어 방식을 포함OL. 얼음의 모든 튜브를 유지합니다. </li><li> PBS와 항체 코팅 된 플레이트를 두 번 씻으십시오. 인간 TGFβ (5 NG / ㎖) 인간 IL-항 인간 IFNγ (10 ㎍ / ㎖), 항 인간 IL-4 (10 ㎍ / ㎖) : 500 μL 1X 각 웰 미디어 Th17가 - 편광의 추가 1β (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-23 (20 ng의 / ㎖) 인간 IL-6 (25 NG / ㎖) 모두 2 mM L- 글루타민, 100 U 보충 된 무 혈청베이스 미디어 (희석 / mL의 페니실린, 100 ㎍ / ㎖의 스트렙토 마이신, 10 mM의 HEPES, 1 mM 피루브산 나트륨 및 100 μM 2- 머 캅토 에탄올). </li><li> 배양 플레이트와 형질 전환 시약을 제조 한 후, 1 ㎖의 마이크로 피펫, 피펫으로 부드럽게 세포를 제외한 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장을 재현 탁. 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 원심 분리 튜브에 세포를 풀. 참고 : 여기에 제시된 나흘 프로토콜 이상 문화 기간의 경우, 세포는이 같은 프로토콜을 사용하여 3 일마다 약 형질 전환되어야한다. 2 단계다른 작은 RNA를 처리 한 세포를 풀링 안 보낸 .4 그러나 수정되어야한다. 시험되는 조건이 모두 수집 계산, 별도로 형질 전환해야합니다. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 PBS 세척 중 적어도 1 mL 중에 세포를 재현 탁. 다음 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송 (생존 능력을 평가하기 위해 트리 판 블루 배제를 사용하여 혈구와 예) 라이브 Th17 세포를 계산합니다. </li><li> 세포 펠렛을 실온에서 5 분 동안 500 XG 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 상층 액을 흡인하고 용액 당 2.5-4 X 107 세포의 밀도로 형질 감염 시스템 10 μL 키트에서 제공 재현 탁 완충액을 사용하여 세포를 재현 탁. 실온에서 세포를 유지합니다. 참고 : 가이드 라인으로, 30 분 내에 형질 전환 될 수만큼의 세포를 준비하려고합니다. 다수의 배치는 비교 될 수있다. </li><li> 각는 MicroC 작은 RNA 1 μL에 세포의 9 μL를 추가entrifuge 튜브. 피펫은 한번 설치 후 피펫 팁 전극에로드 형질 세포 작은 RNA를 혼합한다. 주 : 일반적으로, 형질 감염 이전 피펫 팁 전극에 거품을 만드는 것을 방지하기 위해 충분히 혼합가되도록 세포 현탁액 9.5 μL를 추가한다. </li><li> 실온 전해 버퍼 E. 장소 3 ㎖ 피펫 스테이션 큐벳 내부로 제공 큐벳을 기입 한 후, 큐벳 내부의 위치에 배치 피펫. </li><li> 바로 다음의 파라미터를 이용하여 셀과 작은 RNA 각각 10 μL를 혼합 electroporate : 1,500-1,550 펄스 전압을 V, 펄스 폭 10 밀리 초, 3 펄스 형질 장치 합계. </li><li> 일렉트로가 완료되면 바로 1X 배양 플레이트의 웰에 제조 된 미디어 Th17가 편광-500 μL에 세포 혼합액을 추가한다. 5 % CO 2 개의 일 이상 37 ℃ 인큐베이터에 넣어 판. 참고 : 피펫 팅하여 피펫 전극의 끝 부분을 세척위아래로 PBS에서의 각 형질 사이. </li></ol> 3. 인간 수확 Th17 세포 <ol><li> 부드럽게 피펫 팅하지만 모든 세포가 웰의 바닥으로부터 분리되는 것을 보장하는, 마이크로 피펫으로 배양 배지에서 세포를 재현 탁. 기능적 및 / 또는 유전자 발현의 분석을 위해 세포를 준비한다. 주 : 일상적 충분한 세포가 형질 Th17 세포의 단일 웰에서 수득되는 표면 마커 및 세포 내 사이토 카인 및 전사 인자 염색 유세포 분석 또는 유전자 발현 분석 RNA의 제조에 사용된다. </li></ol>

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이 프로토콜은 인간 Th17 세포로 소형의 RNA 전달하기위한 개선 된 방법을 제공한다. 인간 Th17 세포가 여기에 사용되었지만, 소형 RNA를 가진 전기의 방법은받은 Th1, TH2 및 Tregs 다른 기본 인간 T 헬퍼 집합으로 사용될 수있다. 세포가 이전에 형질 전환에 문화를 활성화해야합니다 그래서 순진한 CD4 + T 세포에 대해 잘 작동되지 않았습니다. 이 프로토콜을 위해, 우리는 먼저 더 나은 IL-17의 생산을 위해 체외 배양 시스템을 최적화. 가장 큰 요인은 기본 미디어이었다. 우리는 혈청이없는 미디어는 기존의 혈청 함유 생산 IL-17A의 더 나은 유도를 위해 미디어를 인간의 Th17 세포에 우수한 것을 알았다. Th17 세포가 사이토킨 TGFβ, IL-1β, IL-23 및 IL-6의 서브 세트에 의해 발생 될 수 있기 때문에, 우리는 다른 시토 킨의 혼합물을 시험했다. 네 편광 사이토 카인이 포함 된 경우 본 연구에서는보다 강력한 IL-17의 생산을 달성했다. 또한, 우리...

CD4 + T 세포는 적응 면역 반응의 중요한 관현악입니다. 나이브 CD4 + T 세포는 여러 이펙터 T 세포 (예받은 Th1, TH2, Th17 등)로 현상 할 수있는 로컬 미세 1에 따라 특성 사이토킨 및 전사 인자의 그 자신의 세트 각각. T 세포가 만들어 계보 결정은 자기에게 모두 보호 면역 관용에 대한 중요합니다. Th17 세포 외 박테리아 및 곰팡이를 방지하기 위해 공지 된 T 세포의 서브 세트 중 하나이지만, 그 부적절한 반응은 또한 다발 경화증, 건선과 2, 3과 같이 다수의자가 면역 및 염증성 질환의 병인에 연루되어있다. 인간 Th17 세포는 적절한 환경 편광판 (4)을 제공함으로써 체외 나이브 CD4 + T 세포로부터 생성 될 수있다. 바리오<html> 사이토 카인의 우리 조합은 IL-1β, IL-23, TGFβ, 및 IL-6는 인간의 Th17 세포의 개발을 위해 사용되어왔다. 인간 Th17 세포 CCR6, 통상이 세포 집단을 식별하는 데 사용되며, 그 주요 전사 인자 (RORC 의해 코딩) RORγt (5, 6)의 식에 의해 정의된다 케모카인 수용체 발현. Th17 세포는 여러 사이토 카인을 발현하는 능력을 가지고 있지만, IL-17A는 이들 세포에 의해 생성 된 계통 정의 이펙터 사이토 카인이다. 우리는 우리의 인간 Th17 체외 분화 분석의 견고성을 평가하기 위해 세 가지 Th17 관련 마커 (CCR6, RORγt, IL-17A)의 발현을 조사 하였다. 또한, 우리는이 Th17 마커의 발현이 매우 낮은 또는 부재이어야 이후에는 사이토 카인이나 차단 항체를 음성 대조군으로 사용하는 배지에 첨가되지 않았다 비 편광 조건 하에서 인간 CD4 + T 세포를 배양 하였다. ve_content는 &quot;&gt; 정상적인 인간 T 세포의 발달 및 생물학을 연구하는 하나의 방법은 개발 중에 유전자 발현을 조작 할 수있다. 짧은 간섭 RNA (siRNA와)는 단백질을 코딩하는 mRNA를 타겟팅 특정 유전자의 발현을 감소시키기 위해 이용 될 수있는 합성 작은 RNA 분자이다 . 마이크로 RNA (miRNA가)는 포스트 - 전사적 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 내인성 비 코딩 작은 RNA를이다.의 miRNAs는 Th17 전지 7, 8, 9를 포함하여 쥐와 인간 T 세포 생물학 모두에서 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이는 유전자 발현에 궁극적으로 인간 T 세포 생물학에 미치는 영향을 연구하기 위해 인간 T 세포에서 작은 RNA 활동을 조작하는 신뢰할 수있는 방법을 가지고 매우 중요하다. 여기에서, 우리는 우리가 도입 용으로 개발 된, 사용하기 쉽고 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜을 설명 작은 합성 RNA를 잠긴 핵산 (LNA들에서는 화학적 안정성이 증가 된 핵산을 개질)면역 세포로, 특히 인간의 Th17 세포로. 일반적으로, 생물 화학적 또는 물리적 카테고리 (10)에 속하는 포유 동물 세포 내로 RNA를 작은 도입 여러 다른 방법들이있다. 지질 계 형질 감염, 칼슘 포스페이트 형질 비롯한 일반적으로 사용되는 화학적 방법이 더 효율적으로 세포에 의해 흡수되는 화학-DNA 복합체를 만드는 방법에 의존한다. 일반적으로, 화학적 방법은 일차 T 세포의 형질 감염에 대해서는 비효율적이다. 가장 일반적인 생물학적 방법은 직접 자연 복제주기의 일환으로 호스트에 외국 RNA를 삽입하는 바이러스 벡터 (예 : 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스)를 사용하는 것입니다. 바이러스 성 전달은 일반적으로 하나가 프로 바이러스 플라스미드의 분자 클로닝 시간에 요인 특히, 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다. 또한, 바이러스 전달 벡터는 인간의 연구자들에게 잠재적으로 해로울 수 있습니다. 전기 물리적 인 m핵산은 일시적으로 그들의 타겟에 작용할 수있는 세포에 들어갈 수 있도록, 고전압 펄스에 세포를 실시함으로써 막 permeabilization 유도 ethod. 전통적인 전기 장비는 차 림프구를 형질 감염에 효과가 없었다. 그러나, 최적화 된 차세대 전기가 작은 물질 인 RNA 형질 감염 될 때, 특히 매우 높은 효율로 T 세포를 형질 감염 할 수있는 것으로 입증되었다. 용어 차세대 느슨하게 기존의 전기 기계에서 두 개의 새로운 플랫폼 (예를 들어, 네온, Amaxa의)를 구분하는 데 사용됩니다. 또한,이 방법은 하나의 실험에서 약 120 작은 RNA를, 최대 종종 검증 합성 시약을 사용하여 함께 적당한 처리량 스크린의 확장이 용이하다. 중요한 것은, 성공적인 형질 감염은 T 세포 활성화 후 적게 16 시간 후에 달성 될 수있다. 이 방법의 단점은, 그러나, 안정한 유전자 incorporati 초래하지 않는다는 점이다에, 그리고 것은 그러므로 과도이다. 따라서, 그것은 바이러스 벡터에 패키지 성공적으로 작은 RNA의 장기 발현이 요구되는 경우에 T 세포에서 발현 할 수있는 안정적인 발현 구조를 만들 수있는 여분의 노력이 가치가있다. 우리는 서로 다른 목적으로 11, 12, 13에 대한 다양한 합성 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 LNA 올리고 뉴클레오티드 도구를 제공하는 차세대 형질 (예를 들어, 네온)을 사용했다. 효율적인 RNA 간섭은 이중 가닥 짧은 간섭 RNA (siRNA에)를 사용하여 기본 마우스와 인간 T 세포에서 유도 할 수있다. 이 프로토콜은 인간 Th17 세포에서이 기술을 사용하기위한 최적의 조건을 설명한다. siRNA를 외에도 시판 합성 miRNA의 모방 및 억제제 miRNA의 이득 및 기능 상실을 연구하는데 사용될 수있다. miRNA의 모방은 siRNA를 매우 유사 이중 가닥 RNA 분자하지만 고안은성숙한 miRNAs는 내생의 시퀀스 D. miRNA의 억제제는 고유의 miRNA에 결합하여 그 기능을 길항하는 RNA 및 / 또는 LNA 기초하여 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드를 화학적으로 변성된다. 우리는이 모든 도구가 포함 배양 차 T 림프구에서 효과적으로 사용하지만 인간 Th17 세포에 국한되지 될 수 있다는 것을 발견했다.

<table><tbody><tr><td>항-인간 IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>클론: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-human IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>클론 : 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-human CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>클론: SK3</td></tr><tr><td>마우스 anti-human CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>클론: 11A9</td></tr><tr><td>anti-human RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>클론: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-human CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>클론: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/transcription factor staining 버퍼 세트</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>세포 내 전사 인자 유세포 분석 염색</td></tr><tr><td>Hu FcR 결합 억제제 정제</td><td>ebioscience</td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T 세포 확장 매체</td><td>줄기세포 기술</td><td>10981</td> <td>"무혈청 염기 매체"</td></tr><tr><td>MACS CD28 순수 기능 등급, 인간</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>클론: 15E8</td></tr><tr><td>항-인간 CD3 정제</td><td>UCSF 단클론 항체 코어</td><td>N/A</td><td>클론: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF 정제 안티-휴먼 IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>클론: MP4-25D2</td></tr><tr><td>안티-휴먼 IFNg, 기능성 등급 정제</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>클론: NIB42</td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-1&베타;</td><td>페프로텍&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 TGF-&베타; 1</td><td>페프로텍&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-6</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME 제어 풀, 비표적 #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Human CD4+ T cell 분리 키트</td></tr><tr><td>네온 Tranfection 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>차세대 electroporation 기기</td></tr><tr><td>Neon Tranfection 시스템 10 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>키트(MPK1096)"</td><td>Transfection Resuspension Buffer"</td>에 제공림</tr><tr><td>Mphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>밀도 구배 매체</td></tr><tr><td>costar 6-well tissue culture treated plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>flat bottom plates</td></tr><tr><td>costar 48-well 조직 배양 처리 플레이트</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>플랫 바닥 플레이트</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>사용하기 전에 증류수로 1x 용액을 만들어야 합니다</td></tr></tbody></table>.

차세대 일렉트로 차 인간 th17 세포 작은 rna 형질

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cell은 주변 cytokine 환경에 따라 effector T helper cell의 여러 subset으로 분화할 수 있습니다. Th17 세포는 편광 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-23 및 TGFβ의 존재 하에서 활성화하여 in vitro에서 naive CD4+ T 세포에서 생성할 수 있습니다. Th17 세포는 세포외 박테리아 및 곰팡이에 대한 면역을 조직하지만, 이들의 비정상적인 활동은 여러 자가면역 및 염증성 질환과도 관련이 있습니다. Th17 세포는 케모카인 수용체 CCR6에 의해 식별되며 마스터 전사 인자인 RORγt와 특징적인 효과기 사이토카인인 IL-17A에 의해 정의됩니다. Th17 세포 분화를 위한 최적화된 배양 조건은 통제된 환경에서 인간 T 세포 생물학의 기계론적 연구를 용이하게 합니다. 또한 RNA 간섭 또는 microRNA(miRNA) 모방 또는 억제제의 도입을 통해 특정 유전자 및 유전자 발현 프로그램의 중요성을 연구하기 위한 환경을 제공합니다. 이 프로토콜은 차세대 전기천공법(electroporation) 장치를 사용하여 작은 RNA로 분화하는 1차 인간 Th17 세포의 일시적 transfection을 위한 사용하기 쉽고 재현 가능하며 매우 효율적인 방법을 제공합니다.

성공적으로 인간의 Th17 세포를 electroporating의 신뢰할 수있는 시스템을 개발하는 첫 번째 단계는 체외 차별화 된 인간의 Th17 세포 배양에서 강력한 생성하는 것이었다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 케모카인 수용체 CCR6 및 전사 인자 RORγt (도 1a 왼쪽)을 나타냈다. T 세포 (오른쪽 그림 1A) 비 편광 (THN) 조건에서 배양했을 때 이러한 마커는 발현되지 않았다. Th17 - 편광 조건 하에서 배양 된 T 세포는 재 자극시 IL-17A를 생성하지만 THN 조건 (도 1B, 우측) (좌측도 1b). Th17 분화 여전히 작은 RNA를 가진 형질 전환 후에 발생하지만, 일부 실험에서, IL-17의 생산의 주파수 (도 1C)에서 관측 된 환...

차세대 전기천공법은 유전자 발현과 세포 거동을 변경하기 위해 인간 Th17 세포를 작은 RNA로 형질 주입하는 효율적인 방법입니다.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

본 절차의 전반적인 목표는 차세대 전기천공법(electroporation)을 사용하여 일차 인간 T 세포에 소형 RNA 시약을 효율적으로 형질전환하는 것입니다. 이 방법은 특정 유전자 산물이 T 세포 분화와 면역 기능을 어떻게 조절하는지와 같은 T 세포 생물학의 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일차 인간 T 세포에 sRNA 및 기타 합성 소형 RNA 시약을 형질전환하는 매우 효율적이고 신뢰할 수 있는 방법이라는 점입니다.이 방법은 인간 Th17 세포의 생물학적 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 인간 또는 마우스의 다른 림프구와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 0일 차에, 6-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 칼슘과 마그네슘이 포함된 PBS에 희석한 항인간 CD3 및 항인간 CD28을 1.5 mL씩 코팅하여 37 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 제대혈 단핵구(CBMC)를 분리하고 세척한 후, 상용 인간 CD4 양성 T 세포 키트를 사용하여 음성 선택 방식으로 CD4 양성 T 세포 분리를 수행합니다.분리 버퍼를 추가하고 단핵구를 재부유시킵니다. 세포를 새로운 5 mL 튜브로 옮긴 후, 튜브당 100 µL의 소태아혈청(FBS)과 100 µL의 항체 혼합물을 추가하고, 오비탈 쉐이커에서 4 °C로 20분 동안 배양하여 충분히 혼합합니다. 배양 후, 세포를 세척하기 위해 3~4 mL의 분리 버퍼를 추가합니다.세포를 4 °C에서 300 ×g로 8분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다. 자성 비드를 새 튜브로 옮기고, 비드를 세척하기 위해 동일한 부피의 분리 버퍼를 추가합니다.1 mL 마이크로피펫을 사용하여 비드를 잘 섞은 다음, 튜브를 자석에 최소 1분 동안 둡니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고, 세척 전 처음에 옮겼던 양과 동일한 부피로 자기 비드를 다시 현탁합니다. 각 튜브에 500 µL의 분리 버퍼를 첨가하여 세포를 재현탁한 후, 미리 세척된 자기 비드 500 µL를 첨가합니다.세포와 자기 비드를 오비탈 쉐이커를 이용해 상온에서 15분 동안 배양하여 충분히 혼합합니다. 배양 후, 1mL 마이크로피펫을 사용하여 세포를 최소 10회 이상 충분히 피펫팅한 다음, 분리 버퍼 3~4mL를 첨가하고 각 튜브를 자석에 2분 동안 놓아둡니다. 상층액에 있는 음성 선택된 CD4 양성 T 세포를 새 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.CD4 양성 T 세포 분리가 완료되면, 세포를 얼음에 보관하고 혈구계수기로 세포 수를 측정합니다. 항체가 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 다음, 각 웰에 2배 농도의 Th17 분화 유도 배지 1.5 milliliters를 첨가합니다. 다음으로, 인간 CD4 양성 T 세포를 원심분리하여 세포 펠릿을 형성합니다.상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 다음, 혈청이 없는 기본 배지에 세포를 재부유하고, 웰당 최종 부피가 3 mL가 되고 분극화 사이토카인의 최종 농도가 1X가 되도록 세포를 분주한 후, 5% CO2 및 37 °C 인큐베이터에서 2일 동안 배양합니다. 2일 차에, 48웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 calcium과 magnesium이 포함된 PBS에 희석한 antihuman CD3 및 antihuman CD28을 250 µL씩 코팅하여 37 °C에서 최소 2시간 동안 반응시킵니다. 형질전환용 small RNA를 준비하려면, 각 형질전환당 5 µM siRNA 스톡 용액 1 µL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 각각 분주합니다.모든 튜브를 얼음에 보관하십시오. 다음으로, 항체가 코팅된 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후, 각 웰에 1X Th17 분화 배지 500 microliters를 첨가합니다. 배양 플레이트와 형질전환 시약이 준비되면, 1 milliliter 마이크로피펫을 사용하여 세포를 다시 부유시키되, 모든 세포가 웰 바닥에서 떨어지도록 부드럽게 피펫팅하십시오.세포를 원추형 튜브에 모은 뒤 4°C에서 500 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 다음, 세척을 위해 최소 1 mL의 PBS에 세포를 재부유시킵니다. 헤모사이토미터를 사용하여 살아있는 Th17 세포의 수를 측정하고, trypan blue 배제법으로 생존율을 평가한 후, 마이크로 원심분리 튜브에서 세포를 펠렛화합니다.상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 키트에 제공된 재현탁 버퍼를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 세포는 실온에서 보관하십시오. 각 마이크로원심분리 튜브에 1 µL의 small RNA와 9 µL의 세포를 첨가합니다.세포와 transfection을 위한 소형 RNA를 혼합하기 위해 한 번 피펫팅한 후, 제공된 피펫 전극 팁에 세포를 로딩합니다. 최적의 transfection을 위해 transfection 전 피펫 전극 팁에 공기 방울이 들어가지 않도록 주의하십시오. 전기천공법 피펫 내에 기포가 생기는 것을 방지하기 위해 충분한 양의 혼합물이 확보되도록 9.5 µL의 세포 현탁액을 첨가합니다.제공된 큐벳에 상온의 전기분해 버퍼 3 mL를 채웁니다. 큐벳을 네온 피펫 스테이션(neon pipet station) 안에 넣은 다음, 피펫을 큐벳 내부의 정해진 위치에 배치합니다. 세포와 소형 RNA가 혼합된 10 µL 혼합물을 즉시 전기천공합니다.전기천공이 완료되면, 세포 혼합물을 배양 플레이트의 준비된 웰에 담긴 500 µL의 1X Th17 분화 배지에 직접 첨가합니다. 마지막으로, 플레이트를 5% CO2, 37 °C 인큐베이터에 넣고 이틀 더 배양합니다. 세포 사멸을 방지하기 위해 신속하고 주의 깊게 작업하십시오.전기천공법을 수행할 샘플이 많은 경우, 세포를 수집하여 배치별로 형질전환할 수 있습니다. 이 등고선 도표(contour plot)는 Th17 분화 조건에서 배양된 T 세포가 케모카인 수용체인 CCR6와 전사 인자인 ROR gamma T를 발현한 반면, 비분화 조건에서 배양된 T 세포에서는 이들이 발현되지 않았음을 보여줍니다. 또한 Th17 분화 조건에서 배양된 T 세포는 재자극 시 IL-17A를 생성했으나, ThN 조건에서는 생성하지 않았습니다.small RNA를 통한 transfection 후에도 Th17 분화는 여전히 일어나지만, 일부 실험에서는 IL-17A 생성 빈도의 감소가 관찰됩니다. 이는 각 실험 내에서 비교를 위해 화학적 조성이 일치하는 small RNA 대조군을 확보하는 것이 중요함을 보여줍니다. small RNA transfection 후에도 세포 생존율은 유지되며 일반적으로 70% 이상입니다. 2일 차에 CD45를 인코딩하는 PTPRC 유전자를 표적으로 하는 siRNA 풀을 인간 Th17 세포에 transfection한 결과, 화학적 조성이 일치하는 대조군 siRNA에 비해 CD45의 발현이 크게 감소했습니다.여기서 보이는 CD45 발현의 단일 모드 인구 이동은 거의 100%의 형질전환 효율을 나타냅니다. RNAi를 통해 ROR gamma T 발현을 감소시킨 결과, 이 세포들은 대조군 siRNA를 형질전환한 세포들에 비해 IL-17A 생성 감소라는 기능적 효과를 보였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 차세대 전기천공법을 사용하여 인 비트로(in vitro) 분화된 인간 Th17 세포에 소형 RNA를 형질전환하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 murine 골수에서 조혈 세포 기본 문화를 확립하고 진 Pulser MXCell의 electroporation 시스템을 사용 transfection하여 다음 방법을 설명합니다.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

이 프로토콜은 높은 세포 활력과 분화 및 편광에 대한 완전한 식세포 용량을 유지하면서 높은 형질 전환 효율로 전기 천공에 의해 또는 siRNA의 플라스미드 DNA와 함께 인간 대 식세포 THP-1을 형질 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

우리는 잠자는 숲속의 미녀 (SB) 트랜스포존 시스템을 사용하여 색소 상피 유래 인자 (PEDF)를 코딩하는 유전자로 전기 천공함으로써 1 차 인간 색소 상피 세포를 형질 감염시키는 프로토콜을 개발했습니다. 성공적인 형질감염은 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR), 면역블로팅 및 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 입증되었다.

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

B세포 치료제 연구를 위해 CRISPR/Cas9 및 재조합 아데노 관련 바이러스 혈청형 6을 이용하여 일차 붉은털원숭이 B세포를 배양하고 유전자를 편집하는 방법을 제시합니다.

일차 붉은털 원숭이 B 세포의 유전자 편집

Cas9 형질전환 마우스의 일차 T 세포로 가이드 RNA를 레트로바이러스 형질전환하기 위한 프로토콜을 제시하여 Th17 분화 연구에서 유전자 편집을 위한 효율적인 대안을 제공합니다.

체외(in vitro)의 Th17 분화 연구를 위한 레트로바이러스 CRISPR/Cas9 매개 유전자 표적화

이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.

인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포의 생성

CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 homology-mediated end joining (HMEJ) DNA repair pathway를 통해 1차 인간 T 세포에서 큰 multicistronic 구조체의 고효율 표적 knock-in을 달성하기 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 cGMP 적응 프로토콜로 조작된 T 세포는 우수한 세포 증식, 세포 독성 및 사이토카인 생산을 유지합니다.

대형 DNA 주형의 상동성 매개 말단 결합을 통한 일차 인간 T 세포의 비바이러스 공학

RNA로서 게놈 편집자를 전달하는 것은 1차 포유류 세포와 세포주의 게놈을 변형하는 데 특히 강력한 방법입니다. 이 프로토콜의 목표는 유전체 편집기를 mRNA로 1차 포유류 세포와 세포주에 전달한 후, 표적 Illumina 시퀀싱과 분석을 통해 편집 결과를 정량화하는 것입니다.

1차 포유류 세포에서 편집자 RNA의 전기천공을 통한 유전체 편집

학습하세요 차세대 일렉트로포레이션을 이용한 인간 Th17 세포의 소형 RNA 형질도입 기법을 통해 T 세포 분화와 면역 기능 연구를 수행하는 방법을 알아보세요.

차세대 일렉트로 차 인간 Th17 세포 작은 RNA 형질

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