Name: S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 배우세요 S100A12 발현 및 정제 방법으로 H. pylori에 대한 항균 활성을 측정하는 기술입니다. 안정적인 다이머 형태의 고수율 생산과 금속 결합 능력을 활용한 항균 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 재향 군인의 직무 경력 개발 상 1IK2BX001701, 전진 과학 전담 센터의 CTSA 상 UL1TR000445, 국가 과학 재단 상 번호 1547757 및 1400969 및 NIH 부여 GM05551에 의해 지원되었습니다. 이의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 전진을위한 국립 중앙 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대표하지는 않습니다.

1. S100A12의 발현 <ol><li> 표준 열 충격 프로토콜 18을 사용하여 pGEMEX - S100a12 플라스미드로 유능한 BL21 DE3 세포를 변환하십시오. 얼음에 microcentrifuge 튜브에 박테리아의 50 μL에 플라스미드 1 ~ 5 μL를 추가합니다. 20 분 동안 품어 낸다. </li><li> 42 ° C에서 30 초 동안 세포를 열 충격시킵니다. </li><li> 얼음에 2 분 동안 세포를 품어. </li><li> 세포에 SOC 배지 500 μL를 첨가하십시오. 1 시간 동안 궤도 진탕 기에서 250 rpm으로 흔들어 주면서 37 ° C에서 배양하십시오. </li><li> LB - 한천 배지 (100 μg / ML 암피실린으로 보충)에 변형 반응의 플레이트 150 μL. 37 ° C에서 12-16 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 하나의 식민지를 선택하십시오. LB (100 μg / ML 암피실린과 보충) 2 ML을 예방 접종. </li><li> 궤도 진탕 기 (300 rpm)로 37 ° C에서 4 ~ 6 시간 동안 품어 낸다. OD 600 은 1 ~ 3 흡광도 단위를 읽어야합니다. </li><li> ZYM-5052 autoindu 50 mL에 starter culture 500 μL 첨가ampicillin 100 μg / mL가 보충 된 배양액 26. 최상의 통기와 최대 발현을 위해서는 250 mL의 배플이있는 삼각 플라스크를 사용하십시오. 37 ° C에서 24 시간 동안 흔들어줍니다 (300 rpm). </li><li> 세균 현탁액을 원심 분리 튜브로 옮긴다. 4 ° C에서 원심 분리 (4,000 xg, 10 분)하여 세포를 펠렛. </li><li> 미디어를 기울이십시오, 샘플을 기록하고 -80 ° C에 셀 붙여 넣기를 저장하십시오. 샘플은 수년간 안정적입니다. </li></ol> 2. 저압 크로마토 그래피를 이용한 S100A12의 정제 <ol><li> 20 MM 트리스, 산도 8.0의 30 ML에 Resuspend 세포. </li><li> 세포 현탁액을 얼음으로 녹여 세포를 용해시킵니다. 5 분 동안 ~ 20W 출력, 5 초 켜짐 및 5 초 꺼짐 사이클 사용. </li><li> 솔루션을 고속 원심 분리 튜브로 옮깁니다. 4 ° C에서 30 분 동안 20,000 xg의 원심 분리로 세포 용 해물을 명확히하십시오. </li><li> 상등액을 따라 내고 깨끗한 100 mL 폴리 프로필렌 비이커로 옮긴다. 비이커를 얼음에 붓고 용액을 냉각시킵니다. 약동 추가황산 암모늄 11.20g을 천천히 첨가한다. 용액을 얼음에서 1 시간 더 저어 준다. 이것은 황산 암모늄의 60 % 용액을 만들고 대부분의 대장균 내생 단백질을 침전시킵니다. S100A12는 가용성을 유지합니다. </li><li> 침전 된 단백질을 펠렛으로 만들기 위해 20 분 동안 4 ℃, 20,000 xg에서 용액을 원심 분리한다. </li><li> 상층 액을 버리고 투석 튜브 (MWCO 3,500 kDa)로 옮긴다. 4 ℃에서 1 L의 20 mM Tris, pH 8.0에 대한 Dialyze. 투석 버퍼를 두 번 변경하십시오. 변경 사이에 4 시간을 허용하십시오. </li><li> 음이온 교환 크로마토 그래피 <ol><li> 저압 시스템에서 크로마토 그래피를 수행하십시오. 일반적인 유속은 1 mL / min입니다. </li><li> 20 ML 트리스, 산도 8.0 10 ML 5 ML 세파 로즈 컬럼을 평형. </li><li> 샘플 펌프를 사용하여 ~ 40 mL의 S100A12 용액을 채 웁니다 (흐름을 수집하십시오). </li><li> 컬럼을 20 mM Tris (pH 8) 10 mL로 씻는다. </li><li> 0-30 % 그라디언트로 컬럼을 만듭니다 (BuB 컬럼은 19 컬럼 부피 (CV, 95 mL)에서 20 mM Tris, pH 8.0, 1 M NaCl이다. 5 ML 분수를 수집합니다. </li><li> 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 쿠마시 염색법으로 MES SDS PAGE를 사용하여 분석하십시오. 30 분 동안 정전압 (20V / cm)을 사용하여 겔을 실행하십시오. </li><li> S100A12를 포함한 풀 분획. S100A12는 변성 겔에서 ~ 10 kDa 단백질에서 작동합니다. </li><li> 한외 여과 장치 (MWCO 10 kDa)를 사용하여 분획물을 5 mL로 농축시킨다. ~ 8 분 동안 3,000 xg에서 원심 분리하십시오. 최고 분수를 가져 가라. </li></ol></li><li> 크기 - 배제 크로마토 그래피 <ol><li> S75 컬럼을 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl 1 CV (120 mL)로 평형화한다. </li><li> 이온 교환 크로마토 그래피에서 얻은 5 mL 이하의 농축 S100A12 분획을 주입하십시오. </li><li> 120 mL에 1 mL / m의 유속으로 컬럼을 현상한다. 5 ML 분수를 수집합니다. </li><li> 각 분획의 10 μL 분취 량을 취해 SDS PAGE를 사용하여 Coomassie 염색법으로 분석하십시오. 다음을 사용하여 단백질 확인웨스턴 블랏 또는 질량 분광법 (단량체 서브 유닛 10,575.0Da의 계산 된 분자량, 10575.4Da로 측정). </li></ol></li><li> 풀 분수 <ol><li> 분광 광도계를 사용하여 단백질 A 280 의 흡광도를 측정합니다. SEC 버퍼를 공백으로 사용하십시오. S100A12 호모 다이머의 계산 된 흡광 계수는 5960M -1 cm -1 입니다. 참고 : 일반적인 수확량은 배양액 50 mL 당 S100A12 35-45 mg입니다. </li><li> 분주 한 S100A12를 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브 (1 mg / 튜브)에 넣고 -80 ° C에서 액체 질소와 플래시에서 동결합니다. </li></ol></li></ol> 3. 항균 활성 분석 <ol><li> 5 % 양 혈액 (혈액 한천 플레이트)이 보충 된 tryptic soy 한천 플레이트에 H. pylori 균주 G27 균주. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 2-3 일 성장하십시오. </li><li> H. pylori 를 1x 콜레스테롤이 보충 된 Brucella 배지에 접종합니다. 문화는 끝났어.37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 밤새 (250rpm) 흔들었다. </li><li> H. pylori 1:10을 50 % Brucella broth, 50 % calprotectin 완충액 + 1x cholesterol에 희석하고 배지 단독으로 배양하거나 100 μM zinc chloride와 0, 100 또는 1,000 μg / mL의 정제 된 S100A12를 보충합니다. 37 ℃에서 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기 중에서 밤새 진탕 (250 rpm). </li><li> 다음날, 일련의 희석을 실시하고 혈액 한천 플레이트에 옮긴다. 5 % 이산화탄소가 보충 된 실내 공기에서 37 ℃에서 2 ~ 3 일 동안 박테리아 콜로니가 자랄 수있게하십시오. S100A12 및 / 또는 외인성 아연의 존재 또는 부재하에 박테리아 성장을 계산하기 위해 식민지 형성 단위를 열거하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

인간 S100A12의 발현 및 정제를위한 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 대장균 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 사용되는 가장 일반적인 도구이며 특히 생화학 및 생물 물리학 연구에 mg이 필요한 경우에 사용됩니다. 여기에 설명 된 절차의 핵심적인 향상은 표준 Luria-broth media 18 을 사용한 발현과 비교하여 정제 단백질의 수율을 거의 30 배 증가시키는 자동 유도 미디어 26 의 사용입니다. 또한 자동 유도 미디어는 단백질 발현 워크 플로를 크게 단순화합니다. 재래 성장 매체를 사용하여, 지수 적 성장 단계 동안 유도제를 첨가 할 수 있도록 배양 물을 연속적으로 모니터링해야한다. 자동 유도 미디어를 사용할 때 배증 시간을 모니터링 할 필요가 없습니다. 배양 물은 포화 상태까지 자랄 수 있습니다. 자동 유도를 통한 성장의 초기 단계배지에서 대장균 은 탄소원으로 포도당을 사용합니다. 일단 포도당이...

S100 단백질은 다양한 기능을 가진 칼슘 결합 단백질의 일종입니다. 그것들은 조직과 세포 특유의 방식으로 발현되며 광범위한 세포 기능을 조절합니다 2 , 3 . 칼슘 결합 단백질에 고유 한 S100 단백질은 세포 내 및 세포 외 기능 모두를 나타냅니다 4 , 5 . 세포 내에서 Ca 2+ 결합은 단백질 결합 파트너를 특이 적으로 표적으로하는 소수성 표면을 노출시키는 구조 변화를 유도합니다. 이 세포 내 메커니즘은 세포 증식, 분화 및 에너지 대사와 같은 중요한 과정을 조절합니다. 세포 외 환경에서 S100 단백질은 두 가지 기능을 나타낸다. 하나는 손상된 분자 패턴 (DAMP) 단백질로 작용하고 친 염증을 일으킨다.패턴 인식 수용체와의 상호 작용을 통한 면역 반응의 초기 반응 8 , 9 . 또한 S100 단백질 군의 여러 구성원은 전이 금속을 격리하며 이는 영양 면역 10 , 11 이라고 불리는 과정에서 미생물 병원균을 굶어 죽이는 역할을한다. S100A12 (calgranulin C 및 EN-RAGE라고도 함)는 대 식세포 및 호중구에서 많이 발현되며 염증성 질환의 잠재적 인 바이오 마커로 확인되었습니다 12 , 13 . 그것의 EF-Hand 부위에서 칼슘을 결합시키는 것 외에도, S100A12는 이량 체 인터페이스의 양단에 두 개의 고친 화성 전이 금속 결합 부위를 가지고있다 14,15. 각 결합 부위는 3 개의 히스티딘 잔기 및 1 개의 아스파르트 산 잔기로 구성되며 아연 또는 구리를 킬레이트 할 수있다 &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . 최근에 우리는 S100A12 의존성 아연 결핍이 Helicobacter pylori의 성장과 염증성 독성 인자의 활성을 조절하는데 중요하다고보고했다. 헬리코박터 파일로리 (H. pylori )는 세계 인구의 약 절반에 해당하는 위장에 감염됩니다. 그것은 틀림없이 가장 성공적인 세균성 병원체 중 하나이다 19 . 헬리코박터 파이로리 감염 은 위염 , 소화성 및 십이지장 궤양, 점막 관련 림프 성 조직 (MALT) 림프종 및 침윤성 위암 (위암)을 비롯한 중대한 위암 질환의 결과로 이어질 수 있습니다. 위암은 세계에서 비 - 심장 암 관련 사망의 주요 원인이며, 위암에 대한 가장 큰 관련 위험 요소는 H. pylori 감염 입니다. 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 는 로브에도 불구하고 위장에 계속 존재한다.이 박테리아 감염을 통제하는 면역 기전의 더 나은 이해에 대한 필요성을 강조했다. 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori와 관련된 염증은 감염 부위에 S100A12를 포함한 항균성 단백질의 레파토리를 입금하는 다형 핵 세포 또는 호중구의 심한 침윤을 특징으로합니다 18 , 24 , 25 . 숙주와 병원체 사이의 복잡한 대화를 이해하기 위해 S100A12를 정제하고이 의학적으로 관련이있는 병원균에 미치는 항생제 영향을 연구하기 위해이 기술을 사용하려고했습니다. 아래의 프로토콜은 생물학적 활성 상태에서의 S100A12 정제 기술을 개량 한 것입니다. 높은 affini와 영양 금속을 바인딩 할 수타이 미생물 침입으로부터 그들을 킬레이트 화시킨다. 또한, 아래의 방법은 선천적 인 항균 분자가 박테리아 병원체의 성장을 제한하는 메커니즘을 연구하기위한 중요한 시약으로서이 단백질의 유용성을 강조합니다. S100A 계열 단백질은 숙주 방어뿐만 아니라 면역 신호 전달에 관여하는 선천성 면역계 분자의 중요한 그룹으로 인식되어왔다. 이들 중 가장 잘 연구 된 화합물은 calprotectin (MRP-8 / 14, calgranulin A / B, S100A8 / A9)입니다 (28 , 29 , 30) . Calprotectin은 이합체 계면에서 전이 금속을 결합하는 S100A8과 S100A9 서브 유닛의 헤테로 다이머를 형성하는 호중구 - 관련 단백질이다. Calprotectin은 두 개의 금속 결합 부위를 가지고있는 것으로 나타났습니다. Site 1은 Zn 2+ , Mn 2+ 또는 Fe 2+ 를 결합 할 수 있고 Site 2는<html> Zn 2+ 31 , 32를 결합하라. Calprotectin은 Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , H. pylori 와 같은 다양한 병원균에 대한 항균 활성을 가지고 있으며 저해 효과는 calprotectin 25 , 28 , 29 . 이전 연구에서 calprotectin은 외막의 지질 A 구조를 변경하고, H.pylori 내 주요 proinflammatory virulence factor 인 cag- Type IV 분비 시스템을 억제하고, biofilm 형성을 유도하고, 억제하는 등 헬리코박터 균에 대한 수많은 활동을 수행했다. 헬리코박터 파이로리 성장 및 생존률class = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . 또한, 유전 적 및 생화학 적 분석 결과 칼로필틴의 H. pylori 에 대한 항균 활성은 주로 영양소 인 아연 결합 능력에서 비롯된 것으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 는 아연이 필요하며,이 병원균의 미량 영양소 요구량을 확인하기 위해 화학적으로 정의 된 배지를 이용하여 성장하고 증식시키는 이전의 연구에 의해 결정되었다. 또한 칼로 펙틴은 헬리코박터 파일로리에 감염된 조직 내에서 매우 풍부하게 존재하며 호중구의 침윤 물과 관련이 있으며, 이는 감염 및 후속 염증시 항균제로 calprotectin을 사용할 수 있음을 나타냅니다 25 , 35 . 편향된 프로테오믹스 스크리닝 기술로부터 얻은 최근의 증거에 따르면, 반응성 산소 종이 풍부한 조건 하에서는 calprotec주석은 hexa-histidine 결합 부위를 변경하는 post-translational modification을 거침으로써 단백질 36 의 금속 결합 활성을 억제한다. 이와 같이, 우리는이 분자의 광범위한 레파토리 중 다른 S100A 계열 단백질이 잠재적으로 보조 금속 킬레이트 화제로 작용할 수 있다고 가정했다. S100A12는 후속 연구를 위해 전술 한 스크린에서 확인되지 않았기 때문에 S100A12를 선택했다. 아연과 결합 할 수있는 능력을 가지고 있으며 H. pylori 감염 개체에서 유래 한 인간 조직에서 매우 풍부하다. 우리의 연구 결과에 따르면 S100A12는 H. pylori 의 G27 균주에서 H. pylori의 생장 및 생존력을 용량 의존적으로 억제 할 수 있으며,이 단백질의 항균 활성은 과량의 영양소 아연을 첨가함으로써 역전 될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 PMSS1 및 7.1에 대한 S100A12 항균 활성을 나타내는 이전 연구를 보완합니다3 종의 H. pylori 균주가 H. pylori 18 균주 및 임상 분리 균주에 대한 광범위한 항균 활성을 입증했다. 함께, 이러한 결과는 영양 면제를 통해 박테리아 성장 및 증식을 조절하는 메커니즘으로서 S100A12의 중요성을 확인합니다. 이 중요한 숙주 - 박테리아 상호 작용에 대한 향후 연구에는 숙주 조직 내 박테리아 부담을 줄이거 나 H. pylori 감염과 관련하여 면역 신호 전달에 대한이 단백질의 기여도를 결정하기 위해 S100A12의 활성을 이용하는 것이 포함될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>S100A12 Expression </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expression cells </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) competent cells</td><td>New England Biolabs</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>자동 유도 배지 구성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>요소 효모 추출물</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Research Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Research Products International</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Research Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>연구 제품 국제</td><td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr><td>D-포도</td>당 <td>연구 제품 국제</td><td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>유당</td><td>시그마-알드리치</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td><강력한>선택제</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암피실린</td><td>연구 제품 국제</td><td>A40040-5.0</td><td></td></tr><tr><td>S100A12 Purification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA 시작 크로마토그래피 시스템</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop lite 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>혈액 한천 플레이트</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>브루셀라 국물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤(250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>염화아연</td><td>시그마-알드리치</td><td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

s100a12의 발현, 정제 및 항균 활성

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin 단백질은 타고난 면제의 중요한 매개체이며 칼슘 결합 단백질 인 EF-hand 계열의 S100 클래스의 구성원입니다. 일부 S100 단백질은 전이 금속을 높은 친 화성으로 결합시킬 수 있고 &quot;영양 면역&quot;과정에서 미생물 병원균 침입으로부터 효과적으로 격리 할 수 ​​있습니다. S100A12 (EN-RAGE)는 아연과 구리를 모두 결합하며 대 식세포와 호중구와 같은 타고난 면역 세포에서 매우 풍부합니다. 우리는 활성, 금속 결합 구성에서 S100A12의 발현, 농축 및 정제를위한 정제 된 방법을보고합니다. 박테리아 증식 및 생존력 분석에서이 단백질의 이용은 S100A12가 박테리아 병원체 인 Helicobacter pylori 에 항균 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 항균 활성은 영양소 아연을 킬레이트 화하는 S100A12의 아연 결합 활성에 기인하며, 이로 인해 아연이 성장 및 P를 필요로하는 H.pylori 가 굶어 죽는다.위험.

S100A12 발현 및 정제 세 단계의 정제로 세균 배양액 50 mL에서 재조합 S100A12를 ~ 40 mg 생산했습니다. 첫 번째 단계는 내재 E. coli 단백질의 황산 암모늄 침전이었다. 이 단계 다음에 음이온 - 교환 크로마토 그래피 ( 그림 1A )가 뒤따 랐다. 단백질은 Coomassie Brilliant Blue로 염색 된 SDS-PAGE에 의해 추적됩니다 ( 그림 1B ). 정화 절차의 마지막 단계는 단백질을 분자량과 형태로 분리하는 크기 - 배제 크로마토 그래피 ( 그림 2A )를위한 S100A12를 포함하는 분획을 모으는 것이 었습니다. S100A12는 호모 다이머 (서브 유닛 당 92 아미노산)이고 총 분자량...

여기에서는 S100A12 (calgranulin C)를 발현 및 정제하는 방법을 제시합니다. 우리는 인간 병원균 H. pylori 에 대한 항균 활성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다.

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 S100A12를 활성 형태로 분리 및 정제하여 항균 분석에 활용할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 병원성 세균의 감염에 반응하여 생성되는 항균 펩타이드인 S100A12의 역할은 무엇인가와 같은 미생물학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 최적화된 프로토콜을 통해 영양 금속을 결합하고 격리할 수 있는 능력을 가진 안정적인 고순도 S100A12 이량체를 높은 수율로 얻을 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 S100A12가 특정 조건에서 다양한 크기의 올리고머를 형성하고, 이러한 올리고머들은 인비트로(in vitro)에서 항균 활성이 감소하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 저희는 calprotectin이라 불리는 관련 S100A 가족 단백질의 항균 활성을 정제하고 연구하기 시작했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 처음 얻었습니다. 이 방법의 크기 배제 및 컬럼 최종 정제 단계에서는 시각적 시연이 매우 중요합니다.그리고 항균 분석은 이 과정의 성공에 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 컴피턴트 BL21 DE3 세포를 형질전환시키십시오. 다음으로, 얼음 위에 놓인 마이크로 원심분리 튜브 내의 박테리아 50 µL에 플라스미드 1~5 µL를 추가하십시오.20분 동안 배양합니다. 그 후, 42°C에서 30초 동안 세포에 열 충격을 줍니다. 얼음 위에서 2분 동안 배양합니다.그 다음, SOC 배지 500 µL를 첨가합니다. 37 °C의 오비탈 쉐이커에서 250 rpm으로 1시간 동안 배양합니다. 이어서, 100 µg/mL의 ampicillin이 첨가된 LB agar 배지에 형질전환 반응액 150 µL를 도말합니다.37°C에서 12~16시간 동안 배양합니다. 배양 후, 단일 콜로니를 선택하여 ampicillin이 첨가된 LB 배지 2mL에 접종합니다. 300rpm의 궤도 진동 혼합기(orbital shaker)를 사용하여 37°C에서 4~6시간 동안 배양합니다.다음으로, 500 µL의 스타터 배양액을 ampicillin이 첨가된 50 mL의 ZYM 5052 자동 유도 배지에 첨가합니다. 37 °C에서 300 rpm으로 24시간 동안 흔들어 배양합니다. 그 후, 박테리아 현탁액을 원심분리 튜브로 옮깁니다.4,000 x g, 4°C에서 10분 동안 원심분리하십시오. 원심분리 후 배지를 버리고 샘플을 기록한 다음, 세포 펠렛을 -80°C에서 보관하십시오. 시작하려면, pH 8.0의 20mM Tris 30mL에 세포 펠렛을 재현탁하십시오. 다음으로, 세포를 용해시키기 위해 20W 출력으로 5초 작동 및 5초 휴지 사이클을 적용하여 얼음 위에서 5분 동안 현탁액을 초음파 처리하십시오.초음파 처리된 용액을 고성능 원심분리 튜브로 옮깁니다. 세포 용해물을 투명하게 만들기 위해 4 °C에서 20,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상층액을 깨끗한 100 mL 폴리프로필렌 비커에 따라냅니다.비커를 얼음 위에 올려 용액을 냉각시키십시오. 마그네틱 바를 넣고 황산암모늄 11.20 g을 천천히 첨가하십시오. 얼음 위에서 용액을 1시간 동안 교반하십시오.그 다음, 용액을 원심분리관으로 옮기고 4°C에서 20,000 ×g로 20분 동안 원심분리하여 침전된 단백질을 펠렛화합니다. 상층액을 투석 튜브로 옮깁니다. 4°C, pH 8.0의 20 mM Tris 1L를 이용하여 투석합니다. 투석 버퍼는 4시간 간격으로 두 번 교체합니다.그 후, 5 mL sepharose 컬럼을 10 mL의 20 mM tris로 평형화합니다. 샘플 펌프를 사용하여 약 40 mL의 S100A12 용액을 로딩합니다. 통과액을 수집합니다.다음으로, 20 millimolar tris로 컬럼을 세척합니다. 19 컬럼 부피(column volumes)에 걸쳐 0에서 30% 기울기(gradient)를 사용하여 컬럼을 전개합니다. 5 milliliter씩 분획을 수집합니다.Coomassie 염색을 이용한 MES SDS page를 사용하여 각 분획의 10 µL aliquot을 분석합니다. 그런 다음, S100A12가 포함된 분획을 회수합니다. 초여과 장치를 사용하여 해당 분획들을 5 mL로 농축합니다.그 다음, 20 millimolar tris와 100 millimolar sodium chloride가 포함된 120 milliliter 용액으로 S75 컬럼을 평형화합니다. 농축된 분획물 5 milliliter 샘플을 주입합니다. 이어서, 1 milliliter per minute의 유속으로 120 milliliter까지 컬럼을 전개합니다.5 mL씩 분획을 수집합니다. Coomassie 염색을 이용한 SDS-PAGE를 통해 각 시료의 20 µL 분취물을 분석합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 단백질의 정체성을 검증하고 해당 분획을 회수합니다.먼저, 1X 콜레스테롤이 첨가된 브루셀라 배지(brucella broth)에 H.pylori를 스트리킹합니다. 5% 이산화탄소가 공급되는 환경에서 37°C, 250 rpm으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 배양된 H.pylori를 50% 브루셀라 배지와 50% 칼프로텍틴 완충액(calprotectin buffer) 및 1X 콜레스테롤 혼합액에 1:10 비율로 희석합니다.그리고 필요에 따라 S100A12 단백질 및/또는 외인성 금속을 추가합니다. 항균 분석은 매우 중요한 단계입니다. S100A12 이량체의 안정성을 보장하기 위해 calprotectin 버퍼를 사용하는 것이 중요하며, 세균 성장 분석 시에는 금속 결핍 미네랄 배지를 제공하여 단백질이 일반적인 풍부한 복합 세균 배지에 흔히 존재하는 과잉 미량 영양소에 의해 영향을 받지 않도록 해야 합니다.다음 날, 샘플을 단계별로 희석합니다. 그 다음, 혈액 우무 배지에 도말합니다. 5% 이산화탄소가 공급되는 공기 중에서 37°C로 2~3일 동안 박테리아 콜로니를 배양합니다.이후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 박테리아 성장을 계산하십시오. 본 연구에서는 활성 금속 결합 구성의 S100A12를 발현하고 정제하기 위한 개선된 방법을 제시합니다. 3단계 정제 과정은 내인성 E.coli 단백질의 황산암모늄 침전으로 시작되며, 이어서 음이온 교환 크로마토그래피가 진행됩니다.Coomassie Brilliant Blue 염색 SDS-PAGE를 통해 단백질을 추적한 후, S100A12가 포함된 분획을 크기 배제 크로마토그래피를 위해 추출합니다. S100A12는 서브유닛당 92개의 아미노산으로 구성된 호모다이머이며, 총 분자량은 약 21 kilodaltons입니다.그 다음으로 정량적 미생물 배양 기술을 통해 S100A12의 항균 활성을 조사합니다. 박테리아 세포 수를 측정한 결과, 외인성 영양원인 zinc의 존재 유무와 관계없이 100 µg/mL의 S100A12에 노출되었을 때 박테리아 생존력은 유의미하게 억제되지 않았습니다. 그러나 배지만이 있는 환경에서 1,000 µg/mL의 S100A12에 노출되면 박테리아 생존력이 69배 감소하는 결과가 나타납니다.외생적 아연 영양원을 첨가하면 이러한 결과가 역전되며, 이는 S100A12의 항균 활성이 아연 격리 활성에 의존한다는 것을 입증합니다. 숙련된 후라면, 적절히 수행했을 때 단백질 발현 및 정제를 3~4일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 추가적인 질문에 답하기 위해 유도결합플라즈마 질량분석법과 같은 다른 방법들을 사용할 수 있습니다.금속 격리가 미생물의 성장을 어떻게 억제할까요? 이 기술이 개발된 이후, 미생물학 분야의 연구자들은 H.pylori의 영양 면역을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 항균 단백질 S100A12를 발현, 정제하고 그 활성을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.H.pylori를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있다는 점에 유의하십시오. 따라서 이 절차를 수행할 때는 항상 BS2 인증 공간에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다. 이 기술의 응용 범위는 궤양, 위염 및 침습성 부속 암을 포함한 위장 질환까지 확장됩니다.이러한 과정들을 이해함으로써, 우리는 해당 과정들을 표적으로 하는 새로운 항균 분자를 구축하는 데 더 나은 역량을 갖추게 될 것입니다. 이 방법은 S100A 가족 단백질의 생화학적 특성에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 면역 신호 전달 및 암, 관절염, 감염성 질환과 같은 수많은 질병 과정에서의 역할 연구에도 적용될 수 있습니다.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 대장균 배양에서 얻은 단백질의 순 표면 전하를 기반으로 인간 칼슘 결합 단백질 S100A12를 정제하는 음이온 교환 크로마토그래피 기술을 시연합니다.

음이온 교환 크로마토그래피 기반 단백질 정제: 순 전하를 기준으로 투석된 박테리아 용해물에서 관심 단백질을 분리하는 분리 기술

이 비디오는 병원성 박테리아인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 분리한 인간 다형성핵 백혈구(PMN)에서 생성된 단백질의 세포 독성을 조사하기 위한 분석을 보여줍니다. 분비된 세포독성 단백질은 PMN 세포막에 공극을 형성하여 세포 사멸을 시작합니다. 프로피듐 요오드화물을 사용하여 죽은 세포를 염색할 때 유세포 분석법을 수행하여 죽은 세포를 정량화하고 박테리아의 세포 독성을 평가합니다.

PMN에 대한 박테리아 세포외 단백질 매개 세포 독성에 대한 분석

높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

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여기서, 케 라티노 사이트에 Streptolysin S, 그룹 A 연쇄상 구균에 의해 생성되는 독소 분비 효과를 연구하기 위해 투과성 막 삽입 계 감염 시스템을 사용하는 방법을 설명한다. 이 시스템은 용이하게 감염 동안 각종 숙주 세포 유형에서 다른 박테리아 분비 단백질의 연구에 적용 할 수있다.

투과성 막 삽입 기반 감염 시스템의 구현은 포유 동물 숙주 세포에서 분비 세균 독소의 효과를 연구하기

프로토콜 선물 대장균-lactococcal 항균 성 펩 티 드 nisin에 비정규 아미노산 (ncAAs)의 선택적 압력 관을 기반으로. 재조합 식을 통해 대체 정의 된 성장 매체에서 원하는 ncAAs로 동안 그것의 속성을 변경할 수 있습니다. Bioactivity 결과 변화 성장 금지 분석 실험 및 형광 현미경 검사 법에 의해 매핑됩니다.

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 생산 하는 항균 성 펩 티 드

MALT1 타고 난 면역을 조절 하지만 병이 정의 남아 어떻게이 발생 합니다. 우리는 타고 난 신호 통행세 같이 또는 C 형 lectin 같이 수용 체의, MALT1 골수성 cytokines의 생산 조절 시연 다운스트림 다운스트림 MALT1의 기여를 푸는 선택적 MALT1 paracaspase 억제제 MLT-827 사용 C-타입 lectin 같이 수용 체의 선택적으로.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.

면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화

그의 태그 정제, 투석 및 활성화는 박테리아에서 가용성, 활성 매트릭스 메탈로프로테이나제-3 촉매 도메인 단백질 발현의 수율을 증가시키기 위해 사용된다. 단백질 분획은 SDS-PAGE 겔을 통해 분석된다.

박테리아 발현 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 인간 매트릭스 메탈로프로테이나제-3의 정제

이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

이 문서에는 분 광 분석에 대 한 세제 solubilized TRPV1의 생 화 확 적인 수량을 얻기 위해 특정 방법을 설명 합니다. 결합 된 프로토콜 막 제어 환경에서 포유류 이온 채널에 대 한 구조 및 기능 연구를 촉진 하기 위하여 적응 시킬 수 있다 생 화 확 및 생물 도구를 제공 합니다.

정화 및 분 광 분석에 대 한 TRPV1의 재구성

배우세요 S100A12 발현 및 정제 방법으로 H. pylori에 대한 항균 활성을 측정하는 기술입니다. 안정적인 다이머 형태의 고수율 생산과 금속 결합 능력을 활용한 항균 메커니즘 연구에 활용됩니다.

S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성

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