Name: 안 체외에서 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 Caseum Binding Assay (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 학습하세요 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 신속 평형 투석법을 사용하는 방법을. 거품 대식세포 유래 매트릭스를 활용하여 비용 효율적인 약물 결합 분석이 가능합니다.

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Bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid 및 tedizolid를 제공 한 Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X 및 Trius Therapeutics에 감사드립니다. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li 및 Danielle Weiner는 MALDI 분석, 생물 분석 방법, caseum 대리인의 준비, 화학 합성 및 토끼 caseum의 분리에 대한 지원을 제공했습니다. 이 작업은 Bill and Melinda Gates Foundation, # OPP1044966 및 OPP1024050 보너스, V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072 및 Bill and Melinda Gates Foundation의 공동 기금 및 우수 센터를위한 Wellcome Trust의 기금으로 수행되었습니다 개발 도상 세계의 질병에 대한 리드 최적화를 위해 P. Wyatt에게

모든 동물 연구는 메릴랜드 주 베데스다의 NIAID (NIH) 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행되었습니다. 결핵과 관련된 모든 연구는 생물 안전성 봉쇄 수준 3 (BSL-3)의 실험실에서 수행되었습니다. 1. 토끼 감염 모델 및 Caseum 수집 <ol><li> 이전에 설명한대로 코에 에어로졸 노출 시스템을 사용하여 M. tuberculosis로 뉴질랜드 흰 토끼를 감염시킵니다. 12 , 13 12-16 주 동안 감염이 진행되도록하십시오. 토끼에게 35 mg / kg ketamine과 5 mg / kg xylazine을 근육 내 주사하고, 0.22 mL / kg pentobarbital sodium과 phenytoin sodium을 정맥 내로 안락사시키고 부검을 진행하십시오. </li><li> 족집게와 메스를 사용하여 가슴에서 폐를 제거하십시오.vity. 각 폐 엽으로부터 메스를 사용하여 개별 공동 큰 괴사 육아종 해부. 조심스럽게 캐비티 및 육아종 벽에서 caseum을 긁어. 사용 전까지 -20 ℃에서 2 ㎖의 스크류 캡 튜브에서 기록 및 저장 샘플을 단다. </li><li> BSL-2 실험실에서 사용하기에 uninfectious 안전 렌더링하기 위해 드라이 아이스에 3 MegaRad에 감염 caseum 샘플을 감마 - 조사. </li></ol> THP-1 세포로부터의 시험 관내 Caseum 대리 2 세대 <ol><li> (80 ㎖ / 플라스크) T175 세포 배양 플라스크 RPMI 1640 배지 (2 mM의 L- 글루타민 및 10 % 소 태아 혈청)에서 THP-1 단핵 세포 성장. 3-4 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2 분위기에서 플라스크를 인큐베이션. </li><li> 5 분 동안 150 XG 두 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 T175 플라스크로부터의 배양 물을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 RPMI 1640 매체 10ml에 펠렛을 정지. </li><li> t의 45 μL를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 피펫이 배양 5 μLrypan 블루. 피펫에 의해 철저하게 섞는다. 혈구 10 μL 전송 및 광학 현미경 (배율 10 배)를 사용하여 (흠) 가능한 THP-1 단핵 세포 수를 계산. 배양액 1 ㎖ 당 생존 세포의 수를 계산한다. 1.25 × 106 세포 / ㎖의 최종 농도로 RPMI 배지로 희석한다. </li><li> 대규모 세포 배양 판 (50 × 106 세포 / 플레이트)에 배양액 40 ㎖의로드. 100 μM PMA (포르 에탄올을 제조 12 myristate13 아세테이트) 40 μL를 첨가하고 세포 배양기에서 밤새도록 부착 할 수있다. 참고 : PMA의 최종 농도는 100 nm의입니다. </li><li> 0.1 M (968.3 μL 에탄올 즉 31.7 μL OA)의 농도로 순수 에탄올 올레산 (OA) (0.89 g / ml)로 희석. 10 mM의 농도로 신선한 예열 RMPI 매체에 상기 용액을 희석. RPMI 배지에서 0.4 밀리미터 (최종 작업 농도)이 OA 현탁액을 희석하여 37 ℃로 예열. </li><li> 기존의 미디어와 비를 제거세포 배양 플레이트에서 첨부 된 세포와 부드럽게 THP - 1 macrophages (THP - M)에 0.4 MM OA 40 ML을 추가합니다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 품어. </li><li> 40 배 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 THP-M에서 수많은 지질 바디 함유 물의 존재를 시각적으로 확인합니다. 세포 배양 플레이트에서 모든 RPMI 매체를 제거하고 부드럽게 50 ML 혈청 피펫을 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 접착 세포를 씻으십시오. 참고 : 지질 체는 THP-M의 세포질에 작고 깨끗한 구형 구조로 나타납니다. </li><li> 각 플레이트에 5 MM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 40 mL를 넣는다. 37 ° C에서 15 분 동안 품어 라. </li><li> 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 전체 접시의 표면 위에 반복적으로 pipetting하여 거품 macrophages (FM)를 분리하십시오. 세포 현탁액을 50 ML 원추형 튜브에 전송하고 5 분 150 XG에서 스핀 다운. </li><li> PBS (세 번째 PBS 세척) 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend사전 칭량 된 15-mL 원뿔 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 150 xg에서 다시 스핀 다운하십시오. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 뜨는을 기음과 폐기하십시오. </li><li> FM 펠렛을 3 회 동결 - 해동시켜 세포를 녹이고 75 ° C에서 20-30 분 동안 배양하여 매트릭스의 단백질을 변성시킵니다. 사용 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 알약을 보관하십시오. </li></ol> 3. 신속한 평형 투석 (RED) 분석 <ol><li> DMSO (dimethyl sulfoxide)에 모든 시험 화합물의 10 mM 저장 용액을 준비하십시오. 각 분석 전에 DMSO에서 500 μm의 작업 솔루션으로 희석. </li><li> caseum 대리 대리인을 포함하는 튜브의 무게를 단다. 빈 튜브의 무게를 빼서 펠렛의 무게만을 뽑아 낸다. 튜브 당 2-3 금속 구슬을 추가하고 1 분 동안 1,200 스트로크 / 분의 조직 균질기를 사용하여 각 매트릭스의 10 배 희석 된 현탁액을 달성하기 위해 1 분 동안 caseum 또는 대리모 매트릭스를 PBS (1 : 9 w / v)에서 분출하십시오. </li><li> 스파이크 6.5 μL의 5005 μM (≤1 % DMSO) 및 와동의 최종 농도를 달성하기 위해 643.5 μL의 균질 액에 시험 화합물의 μM 용액. </li><li> RED 인서트를베이스 플레이트에 놓습니다. 각 RED 인서트의 기증자 챔버 (빨간 링)와 각 수신기 챔버에 PBS 350 μL에 마약 스파이크 매트릭스의 200 μL를 추가합니다. 각 시험 화합물에 대해 3 개의 인서트를 준비하십시오 (3 중 샘플). 플레이트를 접착 플레이트 씰로 밀봉하고 37 ° C에서 200 rpm (1 xg)으로 4 시간 동안 Thermomixer에서 배양합니다. </li><li> 부화 후, 2-3 회 위 아래로 pipetting하여 기증자 및 수신기 챔버의 내용을 부드럽게 섞는다. 기증자 챔버에서 homogenate의 20 μL aliquots을 피펫과 1.5 ML 튜브 (1시 1 분)에 깨끗한 PBS 20 μL에 추가하십시오. 마찬가지로, 리시버 챔버에서 PBS 샘플의 20 μL aliquots을 피펫 깨끗한 homogenate (매트릭스 일치) 20 μL에 추가합니다. 8 참고 : 매트릭스 일치는 ne를 제거합니다.정량 분석을 위해 2 개의 개별 보정 곡선 (균질 액 및 PBS 중)을 제조 할 수 있습니다. 도너 챔버의 내용물은 시간이 지남에 따라 침전 될 수 있습니다. 분액을 제거하기 전에 pipetting으로 내용물을 천천히 혼합하십시오. </li></ol> 4. LC-MS 정량 및 데이터 분석 <ol><li> 각 튜브와 볼텍스에 500 ng / mL diclofenac 또는 10 ng / mL verapamil (내부 표준 물질)이 함유 된 1 : 1 메탄올 : 아세토 니트릴 160 μL를 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하여 침전물을 침전시키고 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석기 (LCMS) 분석을 위해 상층 액을 96- 웰 심층 플레이트로 옮긴다. 7 </li><li> 위의 샘플과 동일한 매트릭스 구성을 유지하면서 각 테스트 화합물에 대해 1 ~ 1,000 nM의 보정 곡선을 작성하십시오. LC-MS 방법을 사용하여 기증자 및 수용기 챔버의 시료에서 시험 화합물의 농도를 정량화합니다. </li><li> 언 바운드 분율 ( f u ) 계산식 1을 사용하여 희석 된 매트릭스에서 약물을 계산하십시오. 식 2 ( D = 희석 계수 10)를 사용하여 희석되지 않은 매트릭스에서 f u 를 계산하십시오. 14 <img alt="방정식 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="등식 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> 안정성 / 신진 대사 / 비특이적 결합 문제가있는 화합물을 확인하기 위해 식 3을 사용하여 각 화합물의 회복 (물질 수지)을 확인하십시오. 참고 : 복구 속도는 일반적으로 70 %에서 130 % 사이입니다. 15 명 <img alt="등식 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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</ol>

더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.

결핵에 감염된 환자의 폐 괴사 성 병변 및 충치는 약물 치료에 저항력이있는 세균 집단을 포함합니다. 이러한 구조물의 핵심은 세포 외 환경에서 이러한 잔류 물을 보유하는 데 특히 책임이있다. 이러한 원격 위치에 항균제를 유리하게 분배하는 것이 결핵약 효능의 중요한 결정 인자로 여겨진다. 이 프로토콜의 유효성을 검증하기 전에, 소변 병변에서 약물 발견 화합물의 분포를 예측할 수 있는 in vitro 기술은 존재하지 않았다. 결과적으로,이 중점 병변에서의 약물 분포 평가는 동물 감염 모델, 병변 중심 약동학 연구 및 MALDI 질량 분석 이미징 기술에 크게 의존했다. 5 , 17 시험 관내 분석에서 그는다시는 생체 내 약물 동력학 연구의 번거 로움과 비용없이 결핵 병변에 약물 침투를 예측하는 빠르고 효과적인 방법입니다. 프로토콜은...

폐결핵병의 치료에는 약물을 여러 종류의 병변으로 효과적으로 분배해야합니다. Necrotic 병변과 충치는 약물 내성 또는 &#39;영구&#39;박테리아의 subpopulations을 보유 caseous 센터가 포함되어 있습니다. 1 , 2 공동 질환은 열등한 치료율과 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 3 , 4 이전의 연구들은 정량적 및 영상 기법을 사용하여 caseum을 투과시키는 능력이 약물 종류에 따라 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 방법은 느리고 지루한 동물 감염 모델을 사용해야합니다. 생체 외 caseum에 대한 약물 결합을 측정하는 in vitro 분석이 설계되었습니다. 이 결합은 육아종 육아종의 약물 침투와 역으로 상관 관계가 있으며, 따라서예측 도구로 사용됩니다. 7 평형 투석은 혈장 단백질 결합 연구에 대한 금 기본 접근법으로 간주됩니다. 빠른 평형 투석 (RED) 장치는 그러한 분석을 수행하는 데 빠르고, 사용하기 쉽고 신뢰할 수있는 시스템을 제공합니다. 8 장치는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있습니다. 일회용, 일회용 멤브레인의 수직 실린더로 분리 된 2 개의 챔버로 구성된 일회용 인서트. 한 번에 최대 48 개의 인서트를 고정 할 수있는 재사용 가능한베이스 플레이트가 있습니다. 투석막은 약물 - 고분자 결합 연구에 이상적인 8kDa 분자량 컷오프 (MWCO)를 가지고 있습니다. 멤브레인 격실의 높은 표면적 대 부피 비율은 신속한 투석 및 평형을 가능하게합니다. 인서트와베이스 플레이트는 최소한의 비특이적 결합을 위해 검증되었습니다. RED 장치와 생물 분석 기술의 결합은 p에서 약물의 결합되지 않은 분율을 정확하게 추정합니다lasma. 8 , 9 원래 혈장 단백질 결합을 측정하기 위해 고안되었지만 RED 장치는 균질 물질을 사용하는 여러 조직 결합 연구에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 괴사 성 병변과 결핵에 감염된 토끼의 충치에서 절제 된 괴사 잔해 인 caseum에 대한 약물 결합을 측정합니다. 소포 성 물질의 무 세포 및 비 - 혈관 성질은 분석과 양립 가능한 균질 현탁액으로 균질화하는 것을 용이하게한다. caseum이 생산이 어려우며 오기가 어렵다는 것을 감안할 때, 의정서는 포말 성 대 식세포로 준비된 대용 매트릭스와 함께 사용하도록 검증되었습니다. THP-1 단핵 세포 유래 대 식세포는 올레산으로 유도되어 여러 개의 지질을 축적하여 &#39;거품&#39;을 일으 킵니다. 이러한 지질로드 된 세포를 수확하고우리가 caseum에 대한 대용 물로 사용하는 행렬을 생성하기 위해 처리됩니다. 이 연구는이 대용 행렬에 대한 약물 결합이 caseum에 결합하는 것과 잘 연관되어 육아종 및 충치의 중대한 코어에서 약물 침투를 방해하는 생체 내 과정을 효과적으로 모방 함을 보여주었습니다.

<table><tbody><tr><td>뉴질랜드 흰 토끼</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI 리소스</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (케타민) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨) 용액&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 단핵 세포주</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체 w/o 글루타민</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 태아 소 혈청, 감마 방사선 조사&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-글루타민, 200mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC 접시, 145mm x 20mm, 통풍</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>올레산&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED 장치 재사용 가능한 베이스 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED 장치 삽입물, 50개/박스&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED 삽입 제거 도구&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>접착 플레이트 씰</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>시그마</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>베라파밀 하이드로클로라이드</td><td>시그마</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>디클로페낙 나트륨 염</td><td>시그마</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>비드 밀 균질화 액세서리, 금속 벌크 비즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R 코발트 60 조사기</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; C-Chip 일회용 혈구계</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>정립 광 현미경</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>이진 액체 크로마토그래피 시스템</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>다중 구성</td></tr><tr><td>질량 분석기</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

안<em&gt; 체외에서</em&gt; 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 caseum binding assay

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

결핵성 질병 퇴치는 복잡한 폐 병변의 여러 층을 침투 할 수있는 약물 요법을 필요로합니다. 충치 및 병변의 caseous 코어의 약물 분포는 일반적으로 persisters로 알려진 약물 내성 박테리아의 subpopulations을 보유하기 때문에 특히 중요합니다. 결핵 병변에서 약물 침투를 측정하기위한 기존의 방법 은 생체 분석 또는 영상 기술과 결합 된 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 생체 내 약물 동태 학 연구를 필요로한다. Caseum macromolecules에 결합하는 약물의 in vitro 측정은 이러한 결합이 caseum을 통한 약물 분자의 수동 확산을 방해하기 때문에 그러한 기술의 대안으로 제안되었다. 신속한 평형 투석은 혈장 단백질 및 조직 결합 연구를 수행하는 빠르고 안정적인 시스템입니다. 이 프로토콜에서 우리는 빠른 평형 투석 (RED) 장치를 사용하여 excis 인 caseum의 균질 액에 대한 약물 결합을 측정했습니다병변 결핵 감염 토끼 공동 에드. 이 프로토콜은 또한 caseum 대신 사용할 THP-1 식세포로드 지질에서 대리 매트릭스를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 caseum / 대리 결합 분석은 결핵 신약 개발에 중요한 도구입니다 및 기타 질병으로 인한 병변이나 농양의 약물 분포를 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.

이 프로토콜을 사용하여 우리는 침투성 caseum에서 예상되는 효율성을 위해 수백 가지의 결핵 약물 개발 화합물을 테스트했습니다. 그림 1 은 RED 분석의 기본 개념을 시각화합니다. RED 인서트의 투석 막은 언 바운드 소분자가 기증자 우물에서 수용기 우물로 확산되도록하여 결국 두 구획 사이의 평형을 이룹니다. 단백질이나 지질과 같은 거대 분자에 결합 된 작은 분자는 기증자에 잘 포획됩니다. 두 구획의 시료를 정량 분석하면 caseum 또는 대리 기질의 각 작은 분자의 결합되지 않은 분율 ( f u )을 계산할 수 있습니다. 이 분획은 생체 내 caseum의 약물 침투와 직접적인 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다. 7 그림 2는 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 질량 분석법metry 화상...

여기에서는 폐결핵 병변 및 충치에서 caseum에 대한 약물 결합을 측정하기위한 신속한 평형 투석 (RED) 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜은 또한 caseum에 효과적인 대리 대리인 거품 마크로파지 파생 매트릭스와 함께 사용됩니다.

안<em&gt; 체외에서</em&gt; 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 Caseum Binding Assay

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

이 프로토콜의 전체적인 목표는 결핵 병변에서 유래한 카세움(caseum)에 대한 약물 결합을 예측하는 것입니다. 이 방법은 동물 모델이나 고가의 영상 기술을 사용하지 않고도 항균제가 괴사성 병변의 카세움 중심부로 얼마나 효과적으로 침투하는지 결정하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 방법은 결핵의 직접적인 발견에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 약물 침투가 제한적인 병변이나 농양의 형성이 특징인 다른 질환에도 적용될 수 있습니다.프로토콜 수행의 일관성이 실험 간 데이터의 재현성을 보장하므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 오늘은 세포 배양 절차와 대리 매트릭스 준비 과정을 시연하겠습니다. 저희 연구실의 연구원인 Hsin-pin 씨가 나머지 분석 과정을 시연하겠습니다.2mM l-glutamine과 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 포함된 80mL RPMI 1640 배지가 들어있는 T-175 세포 배양 플라스크에서 THP-1 단핵구를 배양합니다. 플라스크를 37°C, 5% 이산화탄소 조건에서 3~4일 동안 배양합니다. 세포의 합류도(confluence)가 약 70%에 도달하면, 세포를 두 개의 50mL 원뿔형 튜브에 나누어 담고 150×g에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 버리고 펠렛을 10 mL의 RPMI 1640 배지에 부유시킵니다. 이 배양액 5 µL를 45 µL의 trypan blue가 들어 있는 1.5 mL 튜브에 파이펫팅하여 넣습니다. 파이펫팅을 통해 충분히 혼합합니다.10 µL를 혈구계(hemocytometer)로 옮깁니다. 그리고 10배율의 광학 현미경을 사용하여 생존 가능한 THP-1 단핵구의 수를 측정합니다. 배양액 mL당 생존 세포 수를 결정한 후, RPMI 배지를 사용하여 최종 밀도가 1.25 × 10⁶ cells/mL가 되도록 희석합니다.튜브에 100 µM PMA 40 µL를 첨가합니다. 그런 다음 배양물을 140 x 20 mm 세포 배양 플레이트로 옮깁니다. 인큐베이터에서 세포가 밤새 부착되도록 둡니다.다음으로, 순수 iliac acid를 에탄올에 희석하여 0.1 molar 농도로 만듭니다. 여기서는 31.7 µL의 iliac acid를 968.3 µL의 에탄올에 녹입니다. 이 용액을 미리 데워둔 신선한 RPMI 배지에 희석하여 10 millimolar 농도로 만듭니다.37°C로 미리 데워둔 RPMI 배지에서 iliac acid 현탁액을 최종 작동 농도 0.4 millimolar가 되도록 희석합니다. 지방산을 수용액에 충분히 용해시키기 위해서는 미리 데워진 RPMI 배지에서 iliac acid를 희석하는 과정이 매우 중요합니다. 피펫을 사용하여 THP-1 대식세포가 포함된 세포 배양 플레이트에서 기존 배지와 비부착 세포를 제거하고, 0.1 millimolar iliac acid 40 mL를 조심스럽게 첨가합니다.인큐베이터에서 37°C로 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 40배율의 광학 현미경을 사용하여 THP 대식세포 내에 다수의 지질 소체 봉입체가 존재하는지 육안으로 확인합니다. 지질 소체는 세포질 내에서 작고 투명한 구형 구조로 나타납니다.세포 배양 플레이트에서 모든 RPMI 배지를 제거하고, 50 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 부착 세포를 PBS로 두 번 가볍게 세척합니다. 플레이트에 5 millimolar EDTA와 PBS 40 mL를 첨가합니다. 37°C에서 15분 동안 배양합니다.다음으로, 거품형 대식세포(foamy macrophages)를 분리하기 위해 10 mL 세롤로지컬 피펫을 사용하여 플레이트 전체 표면에서 반복적으로 피펫팅합니다. 세포 현탁액을 50 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그리고 150 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 세포 펠렛을 10 mL의 PBS에 재현탁하여 미리 무게를 측정한 15 mL 코니컬 튜브로 옮깁니다. 150 ×g에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 그런 다음 세롤로지컬 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.거품 형태의 대식세포 펠렛을 세 차례의 프리즈-쏘(freeze-thaw) 사이클에 노출시킵니다. 세포를 용해하기 위해 드라이아이스와 써멀 블록을 이용한 37 °C 배양을 교대로 반복합니다. 그 후, 매트릭스 내의 단백질을 변성시키기 위해 75 °C에서 20분에서 30분 동안 배양합니다.필요할 때까지 팔레트를 -20 °C에서 보관하십시오. 이 비디오 섹션에서 보여주는 급속 평형 장치, 즉 RED 분석은 방금 제작한 대리 매트릭스 또는 TB 감염 토끼 병변의 외피를 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기서는 대리 매트릭스에서 수행하는 분석 과정을 보여드리겠습니다.모든 테스트 화합물을 10 millimolar 농도의 스톡 용액으로 준비합니다. 여기서 moxyfloxacin은 DMSO로 준비합니다. 각 분석 전, DMSO를 사용하여 500 micromolar 농도의 작동 용액으로 희석합니다.절제된 카세움(caseum) 또는 대용 팔레트가 들어 있는 튜브의 무게를 잽니다. 빈 튜브의 무게를 빼서 카세움 또는 대용 팔레트만의 무게를 구합니다. 튜브당 2~3개의 금속 비즈를 넣고, W/V 비율 1:9로 PBS를 추가합니다. 볼텍스(vortex)를 사용하여 카세움 또는 대용 매트릭스를 1분 동안 파쇄합니다.준비된 시험 화합물 6.5 microliters를 균질액 643.5 microliters에 추가합니다. 최종 농도가 5 micromolar가 되도록 하고 볼텍싱합니다. 다음으로, 베이스 플레이트에 빨간색 인서트를 배치합니다.각 테스트를 위해 인서트를 준비하며, 각 화합물은 3회 반복 실험합니다. 각 적색 인서트의 적색 공여실(donor chamber)에 약물이 첨가된 매질 200 microliters를 넣습니다. 그런 다음 각 수용실(receiver chamber)에 PBS 350 microliters를 넣습니다.플레이트에 접착성 씰을 붙이고, 써멀 믹서에서 37 °C, 200 rpm으로 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 피펫팅을 2~3회 반복하여 공여물 및 수용물 챔버의 내용물을 부드럽게 섞어줍니다. 각 공여물 챔버에서 20 µL의 균질물을 취해 1.5 mL 튜브에 담긴 20 µL의 깨끗한 PBS로 옮깁니다.마찬가지로, 수신 챔버에서 PBS 샘플 20 µL 분주량을 깨끗한 균질액 20 µL로 옮깁니다. 매트릭스 매칭을 통해 정량 분석을 위해 균질액과 PBS에서 두 개의 별도 색상 시각 곡선을 작성할 필요가 없어집니다. 공여 챔버의 내용은 시간이 지나면서 침전물을 형성합니다.분주액을 취하기 전에 피펫팅을 통해 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 내부 표준물질로서 diclofenac 500 ng/mL 또는 verapamil 10 ng/mL이 포함된 메탄올과 아세토니트릴의 1:1 혼합액 160 µL를 각 튜브에 첨가합니다. 볼텍싱하여 단백질을 침전시킵니다.침전물을 가라앉히기 위해 10000 x g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 96-well deep well plate로 옮겨 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LCMS)으로 분석합니다. 샘플과 동일한 매트릭스 조성을 유지하면서 화합물 스톡 솔루션을 희석하여, 각 테스트 화합물에 대해 1에서 1000 nanomolars 범위의 검량선을 작성합니다. LCMS 방법을 사용하여 공여실(donor chamber)과 수신실(receiver chamber) 샘플 내 테스트 화합물의 농도를 정량합니다.여기에 제시된 식 1을 사용하여 약물 및 희석된 매질의 비결합 분율(fu)을 계산하십시오. 그런 다음, D를 10의 희석 배수로 하여 식 2를 사용하여 희석되지 않은 매질에서의 fu를 계산하십시오. 마지막으로, 여기에 제시된 식 3을 사용하여 각 화합물의 회수율 또는 질량 균형을 확인하십시오.안정성, 대사 또는 비특이적 결합 문제가 있는 화합물을 식별하기 위함입니다. 회수율은 일반적으로 70%에서 130% 사이로 나타납니다. 이 비디오에서 설명하는 프로토콜은 수백 가지의 결핵 치료제 개발 화합물을 대상으로 치즈물질(caseum) 투과 예상 효율을 테스트하는 데 사용되었습니다.빨간색 인서트의 투석막은 결합되지 않은 작은 분자들이 공여 우물(donor well)에서 수용 우물(receiver well)로 확산될 수 있게 하여, 결과적으로 두 구획 간의 평형을 이루게 합니다. 단백질이나 지질과 같은 거대 분자에 결합된 작은 분자들은 공여 우물에 갇히게 됩니다. 두 구획에서 채취한 샘플을 정량 분석하면 여기에서 보여주는 것처럼 치즈물질(caseum) 또는 대용 매질 내의 각 작은 분자에 대한 비결합 분율(unbound fraction, fu)을 계산할 수 있습니다.fu 값이 높을수록 약물이 치즈양 괴사 조직(caseum)으로 더 광범위하게 확산됩니다. 6가지 약물에 대해 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화, 즉 MALDI 질량 분석 이미징을 수행하였습니다. 대표적인 폐 병변의 이온 맵이 여기에 표시되어 있으며, 신호 강도는 왼쪽의 스케일 바로 나타내었습니다.Hematoxylin 및 ESN 또는 HNE 염색을 거친 인접 절편들이 아래에 제시되어 있습니다. 흑백의 윤곽선은 각 병변의 치즈양 괴사 중심부를 강조합니다. 이러한 데이터는 약물 분자가 병변의 세포층과 접하는 계면으로부터 치즈양 괴사의 외부 영역으로 확산된다는 가설과 일치합니다.치즈양 거대분자에 결합하면 약물이 격리되어 치즈양 핵으로 더 이상 확산되는 것이 방지됩니다. 여기에서 보는 바와 같이, THP-1 유래 포옴 거품세포(foamy macrophages)로 준비된 매트릭스는 실제 치즈양 물질(caseum)의 효과적인 대용물입니다. 두 매트릭스에서의 결합력은 서로 강한 상관관계를 보입니다.이 절차를 따르면 여러 화합물을 동시에 테스트하여 시간과 자원을 절약할 수 있습니다. 이를 카세트 테스트(cassette testing)라고 합니다. 개발 이후, 이 분석법은 결핵 치료제 발굴을 위한 다수의 리드 최적화 프로그램에서 사용되어 왔습니다.미생물 및 결핵 감염 조직 표본을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, BSL2 실험실에서 감염된 외피 샘플을 취급하기 전에 감마선을 이용한 검증된 조직 멸균 프로토콜을 반드시 사용해야 함을 잊지 마십시오. 시청해 주셔서 감사드리며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Sarathy, JP et al. 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 시험관 내 카제움 결합 분석. J. Vis. 경험. (2017년)이 비디오는 급속 평형 투석을 사용하여 결핵 병변에서 카세움에 대한 약물 결합을 측정하기 위한 시험관 내 분석을 보여줍니다. 카세움 현탁액을 준비하고, 투석을 수행하고, 카세움으로의 약물 침투를 예측하기 위해 결합되지 않은 약물 분획을 계산하는 단계를 간략하게 설명합니다.

급속 평형 투석법을 통한 결핵 병변으로부터 카제움에 대한 약물 결합 측정

이 동영상은 결핵균(Mtb) 감염에 대한 약물의 효능을 평가하기 위한 분석을 보여줍니다. 생체 내 감염을 모방하는 Mtb/대식세포 응집체를 포함하는 체외 감염 모델이 생성됩니다. 적절한 항생제를 도입하면 약물 농도가 증가하는 박테리아의 생존을 모니터링하기 위해 레수자린 분석을 통해 그 효능을 테스트합니다.

Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

여기서는 작은 간섭 합성 RNA(siRNA), 화학 화합물 및 진균 결핵 돌연변이 라이브러리의 고처리량/고함량 스크린에 적용되는 표현성 분석을 설명합니다. 이 방법은 자동 공초점 현미경 검사를 사용하여 형광으로 표지된 숙주 세포 내의 형광표지 진균 결핵의 검출에 의존합니다.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

c harcoal agar resazurin assay(CARA)는 복제, 비복제 또는 둘 다인 마이코박테리아에 대한 테스트 에이전트의 활성을 평가하기 위한 반정량, 중간 처리량 방법입니다.  CARA를 사용하면 시간 및 농도에 따른 활성을 신속하게 평가할 수 있으며 CFU(Colony Forming Unit) 분석을 통해 추적할 매개변수를 식별할 수 있습니다.

마이코 박테리아의 세미 양적, 중간 처리량 열거의 숯 한천 레사 주린 분석의 시각화

우리는 세포를, 결핵균에 대해 신규 한 화합물을 발견 타겟팅 및 인스 국물 포유 동물 숙주 세포에 대해 박테리아뿐만 아니라 세포 독성이 증가하는 모듈 높은 처리량 스크리닝 시스템을 개발 하였다.

세포 내 타겟팅 억제제의 효능 및 세포 독성 검사를위한 시스템<em&gt; 결핵균</em

차세대 항결핵 약물을 위한 초기 약물 개발 과정을 개선할 수 있는 새로운 모델과 분석이 매우 바람직합니다. 여기에서는 고처리량 스크리닝에 쉽게 적용할 수 있는 결핵균에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 빠르고 저렴한 BSL-2 호환 분석에 대해 설명합니다.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

이 연구는 박테리아 생존력을 신속하게 평가하기 위해 형광 및 발광을 사용하여 최근에 생성된 이중 리포터 균주를 사용하여 Mycobacterium abscessus 에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 분석을 개발했습니다. 이 프로토콜은 이 약물 내성 박테리아에 대한 신약을 스크리닝하려는 연구자들과 관련이 있습니다.

Mycobacteria에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 분석 개발

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

이 문서는 8 자 챔버 슬라이드 내에서 성장 세균 biofilm의 형성과 시각화를위한 절차를...

8 잘 회의소 슬라이드에서 체외의 Biofilm 형성에

학습하세요 결핵 병변에서 약물 침투를 예측하는 신속 평형 투석법을 사용하는 방법을. 거품 대식세포 유래 매트릭스를 활용하여 비용 효율적인 약물 결합 분석이 가능합니다.

안

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