재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구

이 절차의 전반적인 목표는 비병원성 박테리아로부터 재조합 단백질을 조제하여 단백질 X선 결정학 또는 효소 반응 속도론과 같은 생물물리학적 화학 연구를 용이하게 하는 것입니다. 이 방법은 예비 생물물리학적 특성 분석을 위해 비병원성 박테리아를 사용하여 목적 재조합 단백질을 조제하는 방법에 대한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 배양 인큐베이터 및 분광광도계와 같은 일반적인 장비를 갖춘 모든 실험실에서 목적 단백질에 대한 생물물리학적 특성 분석을 수행할 수 있다는 점입니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라이게이션 반응물을 준비하십시오. 준비된 라이게이션 반응물 3 µL를 50 µL의 화학적 컴피턴트 E.coli DH5 alpha 세포가 들어 있는 튜브에 피펫으로 넣습니다. 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 혼합하십시오.

용액을 얼음에 30분 동안 둡니다. 다음으로 42 °C에서 45초 동안 열 충격을 줍니다. 이후 LB 배지 1 mL를 첨가하고, 37 °C에서 250 rpm으로 강하게 흔들어 주며 45분 동안 세포를 배양합니다.

형질전환된 세포 100 µL를 100 µg/mL kanamycin이 첨가된 LB agar 플레이트에 도말합니다. 37 °C에서 18시간 동안 배양합니다. 멸균된 팁을 사용하여 플레이트에서 콜로니를 채취합니다.

보충제가 첨가된 LB 배지 3 mL에서 18 °C의 온도로 분당 250회의 강한 진탕 조건으로 18시간 동안 세포를 배양합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 플라스미드 DNA를 준비하고 뉴클레오타이드 서열을 확인합니다. E.coli BL21 균주에 다시 형질전환시킨 후, 멸균 팁을 사용하여 콜로니를 선택하고 150 µg/mL의 kanamycin이 포함된 LB 배지 10 mL에 접종합니다.

250 rpm으로 강하게 흔들어주며 37 °C에서 18시간 동안 배양합니다. 그다음, 10 mL의 밤새 배양한 배양액을 1 L의 LB 및 kanamycin 배지로 옮깁니다. 600 nm에서의 광학 밀도가 0.7에 도달할 때까지 37 °C에서 배양합니다.

그 다음 배양액을 얼음물에 15분 동안 담급니다. 최종 농도가 1 mM이 되도록 배양액에 IPTG를 첨가합니다. 18 °C에서 16~18시간 동안 추가로 배양합니다.

그 후, 4°C에서 5,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 10 mM imidazole이 포함된 PBS 50 µL에 세포를 재부유시킵니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 얼음 위에서 세포를 두 번 용해합니다. 세포 용해물을 정제하기 위해 4°C에서 25,000 ×g로 30분 동안 원심분리합니다. 그런 다음, 50 mL 코니컬 튜브에 10 mM imidazole이 포함된 PBS 47 mL와 니켈 비드 3 mL를 혼합합니다.

추가 완충액을 중력 흐름 방식으로 흘려보내 2.5 by 10 centimeter 유리 크로마토그래피 컬럼 내의 평형화된 비드를 가라앉힙니다. 피펫을 사용하여 상층액을 컬럼으로 옮깁니다. 분당 20회 회전하는 스피닝 휠에서 4 °C로 2시간 동안 배양합니다.

그 후, 상층액이 중력에 의해 빠져나가도록 둡니다. 매 세척 시 10 millimolar imidazole이 포함된 100 milliliters PBS를 사용하여 니켈 비즈를 3회 세척합니다. 그런 다음, RBC 1531 단백질을 용출시키기 위해 250 millimolar imidazole이 포함된 5 milliliters PBS를 처리합니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 SDS Page를 통해 용출액 15 µL를 분석하십시오. 수집한 분획물을 투석 튜브에 피펫팅하십시오. 해당 튜브를 4 °C에서 thrombin 절단 호환 버퍼 4 L가 담긴 비커에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오.

다음 날, 피펫을 사용하여 분획물을 15 milliliter 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 280 nanometers에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 추정합니다. 그다음, RBC 1531 단백질 50 microliters를 여러 개의 튜브에 분주합니다.

각 튜브에 서로 다른 양의 thrombin을 첨가하고 20 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 필요한 thrombin의 최소량을 결정한 후, 15 mL 튜브에 단백질 10 mg과 thrombin 60 units를 첨가합니다. 20 °C에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, thrombin으로 소화시킨 단백질을 원심분리 필터 튜브로 옮깁니다. 4 °C에서 3,000 ×g로 원심분리하여 부피를 5 mL 미만으로 줄입니다. 그 후, 농축된 단백질을 준비된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 적용합니다.

튜브당 0.5 milliliters로 60개의 용리 분획을 수집하십시오. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 각 분획의 15 microliters를 15%SDS Page 젤에서 전기영동하십시오. 그 다음 RBC 1531 단백질이 포함된 분획들을 합치십시오.

먼저 혼합된 분획물을 원심분리 필터 튜브로 옮깁니다. 4°C에서 3,000 ×g로 원심분리하여 단백질 농도를 약 18.5 mg/mL로 농축합니다. 그다음 96-웰 sitting drop 결정화 플레이트의 웰에 각 결정화 스크리닝 용액 50 µL를 첨가합니다.

농축 단백질 용액 0.5 µL를 시팅 베드 위에 첨가합니다. 단백질 용액을 웰 용액 0.5 µL와 별도로 혼합합니다. 플레이트를 투명 접착 필름으로 덮습니다.

18 °C에서 배양하며 증기 확산이 일어나도록 합니다. 광학 현미경을 사용하여 20~40배 배율로 드롭을 스캔하며 2~3주 동안 매일 결정 형성 여부를 모니터링합니다. NTP 기질을 준비한 후, 각각을 96-웰 플레이트에 추가합니다.

피펫을 사용하여 각 웰에 20 µg의 RBC 1531 단백질을 넣고 혼합합니다. 플레이트의 뚜껑을 덮고 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, RBC 1531 매개 촉매 반응을 중단시키기 위해 플레이트를 70 °C 항온수조로 옮겨 15분 동안 유지합니다.

다음으로, 각 웰에 S.cerevisiae 무기 피로인산분해효소 1 µL를 첨가합니다. 20 °C에서 30분 동안 배양합니다. 그 후, 발색을 위해 반응 플레이트에 몰리브데이트산 용액 16 µL를 첨가합니다.

15분 후, 690 nanometers에서 광학 밀도를 측정합니다. 본 연구에서는 B series BC1531 유전자의 단백질 산물을 분자 수준에서 분석합니다. 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제한 후, 트롬빈 소화 실험을 수행합니다.

RBC 1531에서 어피니티 태그를 완전히 제거하는 데 필요한 최소량은 thrombin 0.3 units인 것으로 확인되었습니다. 소화 과정 후, 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 태그가 제거된 단백질을 약 99% 순도로 정제합니다. 그 다음, 크기 배제 크로마토그래피를 통해 올리고머 상태를 추정합니다.

RBC 1531은 약 84 milliliters에서 용출되므로 분자량은 55 kilodaltons로 추정됩니다. 단량체의 계산된 분자량은 약 13 kilodaltons입니다. 따라서 RBC 1531은 4량체로 조립됩니다.

그다음 sitting drop 증기 확산법을 이용하여 결정화 스크리닝을 수행합니다. 1 M sodium citrate 및 20% polyethylene glycol 3,000 조건과 0.1 M sodium cacodylate 및 1 M sodium citrate 조건에서 2일 후에 결정이 관찰됩니다. 이후 NTPase 활성을 측정합니다.

RBC 1531 매개 가수분해 반응에 몰리브데이트를 첨가한 후에는 가시적인 색 변화가 나타나지 않습니다. 그러나 피로인산분해효소를 첨가하면 색상이 진한 파란색으로 변하는 것을 확인할 수 있습니다. 이후 690 nm에서의 광학 밀도와 NTP 농도를 비선형 회귀 분석으로 분석합니다.

RBC 1531 효소의 최대 속도는 0.75이며, 미카엘리스 상수(Michaelis constant)는 10 µM으로 결정되었습니다. 본 절차를 수행할 때는 지체 없이 단백질 샘플을 준비하는 것이 중요하며, 단백질 결정화를 방해하거나 효소 분석에 오차를 유발할 수 있는 불순물이 포함된 분획은 폐기해야 합니다. 이 기술의 개발 이후, 효소학 및 기타 단백질 과학 분야의 연구자들은 대부분의 실험실에 구비된 분광광도계를 사용하여 관심 단백질의 특성을 분석할 수 있게 되었습니다.

이 방법은 재조합 단백질 조제, 결정화 스크리닝 및 효소 반응 속도론에 관한 일반적인 개념에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 우리가 관심을 갖는 다른 단백질의 생물물리화학적 분석에도 적용될 수 있습니다. 단백질은 매우 불안정할 수 있으므로 취급 시 주의하십시오. 샘플을 얼음 위에 보관하고 장기 보관 시 -80°C에서 냉동 보관하는 등의 예방 조치가 권장됩니다.

이 영상을 시청한 후, 여러분은 X선 결정학을 통한 구조 분석을 위해 비병원성 박테리아로부터 재조합 단백질을 제조하여 단백질 결정을 얻는 방법과, 비색법을 이용하여 효소 활성을 특성화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.