재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구 바실러스 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

이 절차의 전반적인 목표는 단백질 X선 결정학 또는 효소 역학과 같은 생물물리학적 화학 연구를 용이하게 하기 위해 비병원성 박테리아로부터 재조합 단백질을 준비하는 것입니다. 이 방법은 예비 생물물리학적 특성 분석을 위해 비병원성 박테리아를 사용하여 관심 있는 재조합 단백질을 준비하는 방법에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 배양 인큐베이터 및 분광 광도계와 같은 일반적인 기기가 장착된 모든 실험실에서 관심 단백질에 대한 생물물리학적 특성 분석을 수행할 수 있다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 ligation 반응을 준비합니다. 준비된 결찰 반응 3마이크로리터를 화학적으로 적극적인 E.coli DH5 알파 세포 50마이크로리터가 들어 있는 튜브에 피펫팅합니다. 피펫을 사용하여 용액을 부드럽게 섞습니다.

용액을 30분 동안 얼음으로 만듭니다. 다음으로 섭씨 42도에서 45초 동안 열 충격을 가합니다. 그 후, 1ml의 LB 배지를 넣고 섭씨 37도에서 45분 동안 분당 250회 회전으로 격렬하게 흔들면서 세포를 성장시킵니다.

100마이크로리터의 형질전환된 세포를 밀리리터당 100마이크로그램의 카나마이신이 보충된 LB 오거 플레이트에 펴 넣습니다. 섭씨 37도에서 18시간 동안 배양합니다. 멸균 팁을 사용하여 플레이트에서 콜로니를 선택합니다.

3ml의 보충된 LB 배지에서 18시간 동안 섭씨 18도에서 분당 250회 회전하면서 격렬하게 흔들어 세포를 성장시킵니다. 그런 다음 혈장 DNA를 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 뉴클레오티드 염기서열을 확인합니다. E.coli BL21 균주를 재형전환한 후 멸균 팁을 사용하여 콜로니를 선택하고 밀리리터당 150마이크로그램의 카나마이신을 함유한 LB 배지 10ml를 접종합니다.

섭씨 37도에서 18시간 동안 배양하고 분당 250회 회전하면서 격렬하게 흔듭니다. 다음으로, 10 밀리리터의 하룻밤 배양을 1 리터의 LB 및 카나마이신 배지로 옮깁니다. 600나노미터의 광학 밀도가 0.7에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 성장합니다.

그런 다음 배양물을 얼음처럼 차가운 물에 15분 동안 담급니다. 최종 농도가 1밀리몰이 되도록 IPTG를 배양액에 추가합니다. 섭씨 18도에서 추가로 16-18시간 동안 배양합니다.

그 후, 5, 000 번 G에서 섭씨 4도에서 30 분 동안 원심 분리기. 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 10 밀리몰 이미다졸을 함유한 50마이크로리터의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

다음으로, 텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 얼음 위에서 세포를 두 번 용해합니다. 25, 세포 용해물을 맑게 하기 위하여 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 시간 G에 분리기. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 3ml의 니켈 비드와 10밀리몰의 이미다졸이 함유된 47ml의 PBS를 혼합합니다.

중력은 여분의 완충액을 2.5 x 10cm 유리 크로마토그래피 컬럼에 평형을 이룬 비드를 침전시킵니다. 피펫을 사용하여 상등액을 컬럼으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 분당 20회 회전하는 물레에서 2시간 동안 배양합니다.

그런 다음 상등액이 중력에 의해 배출되도록 합니다. 니켈 비드를 100밀리리터 PBS를 사용하여 세 번 세척할 때마다 10밀리몰 이미다졸이 함유되어 있습니다. 그런 다음 250밀리몰의 이미다졸이 함유된 PBS 5ml를 적용하여 RBC 1531 단백질을 용리시킵니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 SDS Page를 통해 15마이크로리터의 용리액을 분석합니다. 수집된 분획을 투석 튜브에 피펫으로 넣습니다. 튜브를 4리터의 트롬빈 절단 호환 완충액이 들어 있는 비커에 넣고 밤새 섭씨 4도에서 엽니다.

다음 날, 피펫을 사용하여 분획을 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 280나노미터에서 흡광도를 측정하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 농도를 추정합니다. 다음으로 50마이크로리터의 RBC 1531 단백질을 여러 튜브로 옮깁니다.

각 튜브에 다른 양의 트롬빈을 넣고 섭씨 20도에서 3시간 동안 배양합니다. 필요한 트롬빈의 최소 양을 결정한 후 15ml 튜브에 단백질 10mg과 트롬빈 60단위를 추가합니다. 섭씨 20도에서 3시간 동안 배양합니다.

다음으로, 트롬빈으로 분해된 단백질을 원심 필터 튜브로 옮깁니다. 3, 000 시간 G에 양이 5 밀리리터 미만으로 감소시키기 위하여 4 섭씨 온도에 분리기. 그런 다음 농축된 단백질을 준비된 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 적용합니다.

튜브당 0.5ml로 60개의 용리 분획을 수집합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 15%SDS 페이지 겔에서 각 분획 15마이크로리터를 실행합니다. 그런 다음 RBC 1531 단백질을 포함하는 분획을 결합합니다.

시작하려면 결합된 분획을 원심 필터 튜브로 옮기십시오. 3, 000 번 섭씨 4도에서 G를 원심분리기하여 단백질을 밀리리터 당 약 18.5밀리그램으로 집중시킵니다. 다음으로, 각 결정화 스크리닝 용액 50마이크로리터를 96웰 sitting drop 결정화 플레이트의 웰에 추가합니다.

0.5마이크로리터의 농축 단백질 용액을 좌식 침대에 추가합니다. 단백질 용액을 0.5 마이크로 리터의 우물 용액과 별도로 혼합합니다. 투명 접착 필름으로 플레이트를 덮습니다.

섭씨 18도에서 배양하고 증기 확산을 허용합니다. 광학 현미경을 사용하여 20-40배 배율로 방울을 스캔하여 2-3주 동안 매일 결정 형성을 모니터링합니다. NTP 기판을 준비한 후 각각을 96웰 플레이트에 추가합니다.

피펫을 사용하여 각 웰에 RBC 1531 단백질 20마이크로그램을 첨가하여 혼합합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 70도의 수조로 15분 동안 옮겨 RBC 1531 매개 촉매 반응을 중지합니다.

다음으로, 각 웰에 1마이크로리터의 S.cerevisiae 무기 피로포스파타아제를 첨가합니다. 섭씨 20도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 16 마이크로 리터의 몰리브덴 산염 용액을 반응 플레이트에 첨가하여 색상을 개발합니다.

15분 후 690나노미터에서 광학 밀도를 읽습니다. 이 연구에서는 B 심각한 BC1531 유전자의 단백질 생성물이 분자 수준에서 특성화됩니다. 니켈 친화성 크로마토그래피에 의한 정제 후 트롬빈 분해 흔적이 수행됩니다.

0.3 단위의 트롬빈은 RBC 1531에서 친화성 태그를 완전히 제거하는 데 필요한 가장 낮은 양으로 보입니다. 분해 후 태그가 없는 단백질은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 약 99% 순도로 정제됩니다. 그런 다음 크기 배제 크로마토그래피로 올리고머 상태를 추정합니다.

RBC 1531은 약 84 밀리리터에서 용리되기 때문에 분자량은 55 킬로달톤으로 추정됩니다. 단량체의 계산된 분자량은 약 13킬로달톤입니다. 따라서, RBC(1531)는 사량체로서 조립된다.

그런 다음 결정화 스크리닝은 sitting drop vapor diffusion 방법을 사용하여 수행됩니다. 결정은 1 몰 구연산 나트륨과 20 % 폴리에틸렌 글리콜 3, 000, 0.1 어금니 카코 딜 산 나트륨과 1 몰 구연산 나트륨으로 2 일 후에 보입니다. 이 NTPase 활동이 결정된 후.

RBC 1531 매개 가수분해 반응에 몰리브덴산염을 첨가한 후 눈에 띄는 색상 변화가 보이지 않습니다. 그러나 피로포스파타아제를 첨가하면 색이 짙은 파란색으로 변하는 것을 볼 수 있습니다. 그런 다음 690나노미터의 광학 밀도와 NTP 농도를 비선형 회귀를 사용하여 분석합니다.

RBC 1531 효소는 0.75에서 최대 속도를 가지며 10마이크로몰의 미카엘리스 상수를 갖는 것으로 결정되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 지체 없이 단백질 샘플을 준비하고 단백질 결정화를 방해하거나 효소 분석에서 오류를 일으키는 불순물이 포함된 분획을 폐기하는 것이 중요합니다. 그것의 발달 후에 이 기술은 효소학 및 다른 단백질 과학의 분야에 있는 연구원을 위한 길을 닦았습니다, 대부분의 실험실에서 장식되는 분광 광도계를 가진 관심사의 단백질을 성격을 나타내기 위하여.

이 방법은 재조합 단백질 준비, 결정화 스크리닝 및 효소 동역학에 대한 일반적인 아이디어에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 관심 있는 다른 단백질에 대한 생물물리학적 화학 분석에도 적용할 수 있습니다. 단백질은 매우 불안정할 수 있으므로 단백질로 작업할 때 주의하는 것을 잊지 마십시오. 예를 들어 샘플을 얼음 위에 두고 장기 보관을 위해 80도에서 냉장

이 비디오를 시청한 후에는 X선 결정학에 의한 구조 결정을 위한 단백질 결정을 얻기 위해 비병원성 박테리아에서 재조합 단백질을 준비하는 방법과 비색법을 사용하여 효소 활성을 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.