신경 성장 인자 인 캡슐 레이션을위한 새로운 HDL 모방 나노 입자의 제조 및 특성 규명

이 논문의 전반적인 목적은 신경성장인자(nerve growth factor)가 탑재된 고밀도 지질단백질 모방 나노입자의 제조 및 특성 분석 방법을 소개하는 것입니다. 일반적인 고밀도 지질단백질 모방 나노입자를 제조하기 위해 단순 균질화법이 사용되었습니다. 이 절차는 간단하며 확장 가능합니다.

또한, 나노입자는 포집 효율을 크게 향상시켰으며, 나노입자 내의 NGF와 APOA1 역시 개선되었습니다. 적재되지 않은 NGF를 NGF 나노입자로부터 분리하고, 신뢰할 수 있는 인비트로(in vitro) 반경 연구를 수행하며, NGF 나노입자의 생체이용률을 확인하는 등 나노입자 특성 분석의 다양한 난제들이 해결되었습니다. 우선, 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 10 µL의 NGF와 10 µL의 protamine USP를 혼합하고, 복합체가 형성되도록 실온에서 10분 동안 방치합니다.

다음으로, 유리 바이알에 phosphatidylcholine 59 µL와 sphingomyelin 11 µL를 넣습니다. 또한 phosphatidylserine 4 µL, cholesteryl oleate 15 µL, 그리고 tocopheryl polyethylene glycol succinate 45 µL를 추가합니다. 혼합 후 완만한 질소 기류 하에서 약 5분 동안 에탄올을 증발시킵니다.

모든 부형제는 유리 바이알 바닥에 얇은 오일 막을 형성해야 합니다. 바이알에 초순수 1 mL를 넣고 실온에서 9,500 rpm으로 5분 동안 균질화하여 프로토타입 나노입자(NPs)를 형성합니다. 그다음, 준비된 복합체를 프로토타입 NPs에 첨가합니다.

유리 바이알에 작은 교반 바를 넣고 37 °C에서 30분 동안 교반하며 현탁액을 배양합니다. 실온에서 30분 더 교반하여 NP를 냉각합니다. 냉각 후, apolipoprotein A-1 106 µL를 첨가하고 실온에서 밤새 교반하여 최종 NGF HDL-모사 NP를 형성합니다.

제조사의 지침에 따라 입자 분석기를 사용하여 입자 크기와 제타 전위를 측정합니다. 가교 젤 여과 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 로딩되지 않은 NGF를 NGF HDL-모방 나노입자로부터 분리하고 NGF의 포집 효율을 결정합니다. 컬럼 준비를 위해 15 mL의 sepharose 4B CL 현탁액을 50 mL 비커로 옮깁니다.

비드 현탁액을 저어준 후 일부를 컬럼에 붓습니다. 컬럼을 가볍게 두드려 기포를 제거합니다. 용매가 빠져나가고 비드가 가라앉을 때까지 몇 분간 기다립니다.

남은 현탁액을 계속해서 추가합니다. 컬럼의 내벽을 헹구어 비드들을 세척합니다. 용매의 높이가 고정상 상단보다 약간 높을 때까지 용매를 배출합니다.

그 다음, 20 milliliters의 1X phosphate-buffered saline으로 컬럼을 세척하고 컨디셔닝합니다. NGF의 포집 효율을 측정하기 위해, 200 microliters의 NGF HDL-mimicking NPs를 컬럼에 로딩하고 1X PBS로 용리합니다. 이전과 마찬가지로, 총 12개의 1 milliliters 분획을 수집합니다.

제조사의 지침에 따라 8개의 투석 튜브를 전처리합니다. 50 mL 원심분리 튜브에 30 mL의 방출 배지를 첨가합니다. 그다음, 135 rpm의 진탕 속도로 설정된 쉐이커에서 37 °C로 가온합니다.

투석 튜브를 닫고 방출 매질에 넣습니다. 시간 0의 샘플로서 투석 튜브 외부에서 방출 매질 100 µL를 빠르게 취합니다. 이후 분석을 위해 해당 샘플을 즉시 -20 °C에 보관합니다.

채취한 샘플을 대체하기 위해 원심분리 튜브에 신선한 방출 배지 100 microliters를 추가합니다. 그런 다음, 타이머를 시작합니다. 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72시간마다 방출 배지 100 microliters를 채취하고, 이를 신선한 배지 100 microliters로 교체합니다.

채취한 샘플을 즉시 -20 °C에 보관하여 추후 분석에 사용하십시오. 3분간의 균질화 후, 프로토타입 나노입자에서 일관된 입자 크기가 얻어졌습니다. 최종 NGF 나노입자는 170 nm의 입자 크기와 좁고 단분산된 크기 분포를 나타냈습니다.

NGF가 탑재되지 않은 상태와 나노입자는 겔 여과 컬럼에서 완전히 분리되었습니다. 나노입자는 2번부터 4번 분획에서 용출되었습니다. ELISA 측정 결과, 유리 NGF는 7번 분획에서 10번 분획에서 용출된 것으로 나타났습니다.

계산된 NGF의 포집 효율은 약 66%였습니다. NGF 나노입자의 인비트로(in vitro) 방출 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 방출 배지에 PBS와 BSA를 첨가함으로써, 유리 NGF는 85% 이상의 회수율로 투석막을 통과했습니다. 반대로, NGF 나노입자는 느린 방출 프로파일을 보였으며 72시간 동안 나노입자로부터 약 10%의 NGF가 방출되었습니다. NGF 나노입자는 유리 NGF와 유사한 정도로 PC12 세포의 신경돌기 성장을 촉진했습니다.

50 ng/mL의 용량으로 투여했을 때, 두 그룹 모두에서 신경 돌기 성장이 현미경 하에서 명확하게 관찰되었습니다. NGF 나노입자는 마우스의 간, 신장 및 비장에서 NGF의 혈장 농도를 상당히 높이고 섭취를 감소시켰습니다. HDL 모방 나노입자는 NGF를 보조하여 체내 안정성에서 긴 반감기를 유지할 수 있도록 하였습니다.

균질화 방법을 적절히 수행한다면, 숙련된 경우 단분산 나노입자를 3분 만에 제조할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 부드러운 질소 흐름을 사용하여 용매를 증발시키고 균질화 후 용기 벽에 지질 잔여물이 남아 있지 않도록 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 균질화 방법을 사용하여 HDL 모방 나노입자를 만드는 방법과 NGF가 탑재된 나노입자를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.