양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

정량적 질량 분석법을 위해 지질 방울(lipid droplets)을 분리하는 전체적인 목표는 예를 들어 C형 간염 바이러스와 같은 병원체의 복제 과정에서 이러한 소기관의 기능을 이해하는 것입니다. 이 방법은 병원체가 복제를 위해 왜 지질 방울에 결합하는지와 같은 감염성 질환 분야의 핵심 질문들에 답할 수 있습니다. 지질 방울의 분리는 6~7시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 과정 중에는 케라틴 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 먼저, DMEM 배지 각 병에서 50 milliliters를 제거하고 50 milliliters의 투석된 fetal calf serum을 첨가합니다. 다음으로, 1 milliliter의 배지에 carbon 13 표지 lysine 50 milligrams와 carbon 13 표지 arginine 50 milligrams를 녹입니다.

철저히 혼합한 후, DMEM 및 FCS 배지에 아미노산을 첨가합니다. 그 다음 PenStrep과 글루타민 대체제를 추가합니다. 0.45 micron 필터를 사용하여 배지를 멸균 여과하고, 병에 heavy SILAC 배지로 라벨을 부착합니다.

경배지를 준비하려면 arginine 50 milligrams와 lysine 50 milligrams를 사용하여 이 단계들을 반복하십시오. 병에 light SILAC 배지로 라벨을 붙입니다. 세포를 trypsin 처리한 후, 6웰 배양 플레이트의 두 웰에 나누어 접종하십시오.

한 웰에는 2 mL의 heavy SILAC 배지를, 다른 웰에는 2 mL의 light SILAC 배지를 넣어야 합니다. 세포를 최소 6회 계대 배양하십시오. 6회 계대 후에는 heavy 아미노산의 통합률이 95% 이상이어야 합니다. 통합 효율을 분석하기 위해 heavy 및 light 표지 세포 집단에서 각각 100만 개의 세포를 수확하십시오.

1X PBS로 세포를 세척한 후, 160 ×g, 4 °C 조건에서 5분간 원심분리하여 펠렛을 형성합니다. 세포 펠렛을 150 µL의 MS-buffer에 재현탁합니다. 그다음, 세포를 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.

그 다음, 4 °C에서 초음파 분쇄를 통해 세포를 용해합니다. 11,000 ×g, 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다. 상층액을 새 튜브로 옮기고, 계면활성제 호환 단백질 분석법을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.

그런 다음, 75 µg의 단백질을 6x 샘플 버퍼와 혼합합니다. 95 °C에서 5분 동안 가열한 후, SDS 러닝 버퍼를 사용하여 180 V에서 약 1시간 동안 SDS-PAGE로 단백질을 분리합니다. Coomassie 염색 후 동일한 단백질 밴드를 절제하고 MS 분석을 통해 결합 효율을 분석합니다.

37°C에서 4시간 동안 섬유성 스톡(fibrous stocks)과 함께 배양하여 light 세포군에 C형 간염 리포터 바이러스를 감염시킵니다. 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 HCV 감염 light 세포와 비감염 heavy 세포를 증식시킵니다. 블라스티시딘(blasticidin) 내성 유전자를 보유한 HCV 균주를 사용하는 경우, HCV 양성 세포를 선택하기 위해 light 배지에 10 µg/mL의 blasticidin S를 첨가하십시오.

지질 방울 분리 하루 전, PBS로 세포를 세척하고 트립신 처리한 후, 이에 해당하는 경량 또는 중량 배지에 다시 현탁합니다. Neubauer 계수기를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 그런 다음, 각 세포군에서 700만 개의 세포를 150 square centimeter 세포 배양 접시에 분주합니다.

light 및 heavy 세포군당 최소 5개의 디쉬를 준비합니다. 각 디쉬에 30 milliliters의 배지를 넣어 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 배지를 제거하고 1X PBS로 세포를 세척합니다.

셀 스크레이퍼를 사용하여 1X PBS 내의 세포를 떼어냅니다. 이전과 동일하게 두 세포 집단의 수를 센 후, 50 milliliter 원심분리 튜브에 동일한 수의 세포를 취합니다. 160 times g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 형성합니다.

PBS를 제거하고, 세포 펠렛을 1 mL의 수크로스 완충액에 다시 현탁합니다. 세포 현탁액을 밀폐형 Ounce 균질기에 옮긴 후, 얼음 위에서 200회 스트로크하여 세포를 용해합니다. 그 다음, 용해물을 1.5 mL 마이크로 퓨지 튜브에 옮기고, 4°C에서 1,000 ×g로 10분 동안 원심 분리하여 핵과 세포 잔해를 가라앉힙니다.

원심분리 후, 투입 대조군(input control)으로 사용하기 위해 포스트-뉴클리어 분획(post-nuclear fraction, PNS) 25 µL를 분취하여 -20 °C에 보관하십시오. 나머지 PNS 분획을 원심분리 튜브 바닥에 두고, 그 위에 지질 방울 세척 완충액(lipid droplet wash buffer) 약 3 mL를 층으로 쌓으십시오. 4 °C에서 100,000 ×g로 2시간 동안 원심분리하십시오.

원심분리 후, 굽은 뭉툭한 캐뉼라(bent blunt cannula)를 사용하여 튜브 상단에서 부유하는 지질 방울 분획을 수집합니다. 그다음, 지질 방울 분획을 원심분리 튜브에 넣고 지질 방울 세척 완충액을 층을 이루게 덮은 후, 원심분리 단계를 반복합니다. 농도 기울기 상단에서 지질 방울을 수집하는 과정에는 숙련도가 필요합니다.

분획이 클수록 작업이 더 쉽습니다. 연습을 위해 지방 세포를 사용할 수 있습니다. 또는 세포에 oleate를 공급하여 지질 방울의 양을 증가시킬 수 있습니다.

다시 한번 굽은 blunt cannula를 사용하여 튜브 상단에서 부유하는 지질 방울 분획을 수집하십시오. 수집한 지질 방울을 새로운 1.5 milliliter 마이크로 튜브로 옮기고, 500 microliters의 지질 방울 세척 완충액을 추가하십시오. 그 후, 샘플을 21,000 times g, 4 °C에서 20분 동안 원심 분리하십시오.

겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 하단의 세척 버퍼를 제거하고, 세척 단계를 3회 반복합니다. 마지막으로 세척 버퍼를 제거한 후, 단백질 함량 측정을 위해 5 µL의 지질 방울 분획물을 10 µL의 NP 40 용해 버퍼와 혼합합니다. 감염성 물질을 다루는 경우, 바이러스를 불활성화하기 위해 샘플을 얼음에 1시간 동안 보관합니다.

이 단계에서 지질 방울 분획물은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 다음으로, 최소 35 µg의 단백질에 해당하는 부피를 4x loading dye와 혼합합니다. 감염성 물질을 다루는 경우, 바이러스를 불활성화하기 위해 혼합물을 얼음 위에서 1시간 동안 배양하십시오.

샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열하십시오. 그 다음, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 위한 샘플 준비를 위해 SDS-PAGE를 수행하고 Coomassie 염색을 실시하십시오. 지질 방울의 순도를 분석하려면, 지질 방울 분획물의 1~2배 희석액을 NP 40 용해 버퍼로 희석하십시오.

입력 대조군 분획을 동일한 버퍼를 사용하여 10배 희석합니다. 감염성 물질을 사용하는 경우, 바이러스를 불활성화하기 위해 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 그 다음, 계면활성제 호환성 단백질 분석법으로 단백질 농도를 측정합니다.

그다음, 단백질과 6x 샘플 버퍼를 동일한 양으로 혼합하고, 감염성 물질을 다루는 경우 바이러스를 불활성화하기 위해 샘플을 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로 SDS-PAGE를 진행하고, 80V에서 90분 동안 탱크 블로팅을 통해 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 전이시킵니다. 여기에 핵 제거 상층액 및 지질 방울 분획의 대표적인 웨스턴 블롯 분석 결과가 제시되어 있습니다.

웨스턴 블롯 결과, 지질 방울 분획에서 지질 방울 마커 단백질인 perilipin two와 perilipin three가 농축되었으며, 다른 세포 소기관의 마커들은 고갈되었음을 명확히 보여줍니다. 핵 제거 후 분획과 지질 방울 분획은 Coomassie blue 및 silver 염색을 통해 추가로 분석할 수 있습니다. 이 히트맵은 분석된 세포의 지질 방울 분획에서 확인된 단백질의 펩타이드 수와 단백질 커버리지 백분율을 나타냅니다.

최종 히트맵은 HCV 감염이 지질 방울의 일일 변화에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 농축된 지질 방울 관련 단백질은 빨간색으로, 결핍된 지질 방울 관련 단백질은 파란색으로 표시되었습니다. 이 방법의 주요 장점은 세포 분리 전과 지질 방울 분리 전에 세포를 혼합함으로써 세포 용해 및 분리 단계에서 발생할 수 있는 오차를 최소화할 수 있다는 점입니다.