CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

이 기술의 전반적인 목적은 CRISPR/Cas9으로 유도된 삽입 및 결실 돌연변이 클론의 유전형을 고처리량 방식으로 분석하는 것입니다. 이 방법은 선택한 SAIL 모델에서 특정 유전자를 녹아웃했을 때의 표현형 효과와 같은 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량부터 고처리량 스크리닝까지 다각적으로 유연하게 적용 가능하다는 점입니다.

이 방법은 인간 암 유전학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 세포, 줄기세포, 일차 세포 또는 비인간 유래 세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 우리는 처음 단쇄 반복 서열(short tandem repeats) 또는 STR 타이핑 분석을 수행했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 절차를 시작하려면, 형광 표지 Cas9과 단일 가이드 RNA를 공동 발현하는 플라스미드를 선택한 세포에 형질전환시키십시오.

세포를 트립신 처리하고 형광 표지된 클론 약 3,500개를 선택합니다. 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 성장 배지 8mL가 담긴 10cm 디쉬에 클론을 500개, 1,000개, 2,000개씩 나누어 플레이팅합니다. 5% CO2 분위기의 37°C에서 세포를 배양하며, 단일 세포 콜로니가 육안으로 보일 때까지 5일마다 배지를 교체합니다.

그다음 약 5 µL의 성장 배지가 담긴 200 µL 피펫으로 개별 콜로니를 흡입합니다. 각 콜로니를 200 µL의 성장 배지가 들어 있는 별도의 웰로 옮깁니다. 세포를 재현탁하기 위해 각 혼합물을 반복적으로 피펫팅합니다.

세포가 50에서 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 앞서 설명한 조건에서 배양합니다. 웰에서 과잉 배양액을 제거하고, 각 웰에 페놀 레드 없는 0.05% trypsin EDTA 25 µL를 첨가합니다. 세포를 37 °C에서 7분 동안 배양합니다.

그런 다음 혼합물을 반복적으로 피펫팅하여 트립신 처리된 세포를 재현탁합니다. 현미경으로 웰을 관찰하여 세포가 웰 벽에서 완전히 분리되었는지 확인합니다. 개별 클론의 반복 시료를 준비하려면, 각 세포 현탁액 5 µL를 빈 96-웰 배양 플레이트로 옮깁니다.

각 웰에 200 µL의 성장 배지를 추가합니다. 그런 다음 빈 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 µL의 용해 버퍼를 넣습니다. 각 세포 현탁액 5 µL를 이 96-웰 플레이트로 옮깁니다.

액체가 웰 바닥에 가라앉을 때까지 플레이트를 짧게 원심분리합니다. 각 세포 현탁액의 남은 15 µL에 200 µL의 성장 배지를 추가합니다. 클론의 녹아웃 상태를 나중에 확인하기 위해 원래의 현탁액과 복제본을 배양 조건 하에 보관합니다.

그 후 열 사이클링을 사용하여 용해 버퍼 내의 세포를 완전히 용해시킵니다. 용해물을 짧게 원심 분리합니다. 용해물을 40 µL의 nuclease free water로 희석합니다.

희석된 용해물을 볼텍싱하고 짧게 원심 분리합니다. 형광 PCR을 수행하기 전에, 용해된 야생형 세포를 대상으로 표지되지 않은 여러 쌍의 프라이머의 특이성을 설계하고 테스트하십시오. 최적의 프라이머 쌍을 확인한 후, 형광체가 표지된 정방향 프라이머와 표지되지 않은 역방향 프라이머를 준비하십시오.

정제된 genomic DNA를 사용할 때와는 결과가 다를 수 있으므로, vortex cells를 사용하여 프라이머의 특이성을 테스트하고 자제 제작한 lysis buffer를 사용하여 용해하십시오. 라벨링된 프라이머를 사용하여, 희석된 용해물 3 µL를 넣고 20 µL로 형광 PCR 반응을 수행하여 표적 영역을 증폭합니다. 증폭 산물 5 µL를 1% agarose gel에서 전개하여 PCR 증폭 산물의 크기와 상대적 양을 평가하십시오.

시료 준비를 시작하려면, nuclease free water를 사용하여 야생형 및 CRISPR/Cas9 표적 DNA의 증폭 산물을 약 2.5 nanograms per microliter 농도로 희석하십시오. 희석된 야생형 및 표적 DNA 시료를 동일한 부피로 함께 혼합합니다. 96 well PCR plate의 웰에 탈이온 formamide와 염료 표지 크기 표준물질의 29:1 혼합물 9 microliters와 혼합된 증폭 산물 1 microliter를 로딩하십시오.

플레이트를 단단히 밀봉하고 PCR thermocycler를 사용하여 시료를 95 °C에서 3분 동안 가열합니다. 가열 직후, 플레이트를 얼음 위에서 3분 동안 냉각합니다. 유전자 분석기를 사용하여 모세관 겔 전기영동을 수행합니다.

전기영동이 완료되면, 데이터를 분석 소프트웨어로 가져와 플롯을 그립니다. 적절한 염료 채널에서 데이터를 검토하여 사이즈 표준의 품질을 확인합니다. 그런 다음, 비표적 야생형 대조군과 표적 클론의 염료 채널 값을 txt 형식으로 내보냅니다.

이 파일에서 염료 식별 정보, 샘플 파일 이름, 단편 크기 및 피크 높이 값을 스프레드시트 소프트웨어로 가져옵니다. 각 샘플에서 표적 클론과 표적되지 않은 야생형 대조군 사이의 단편 크기 차이를 계산합니다. 3 염기쌍의 배수가 아닌 인델(indel) 돌연변이가 있는 클론을 식별합니다.

보관된 복제본으로부터 선택된 클론을 연속적으로 확장합니다. Sanger 시퀀싱과 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 클론의 유전자형을 결정하고 클론의 녹아웃 상태를 확인합니다. 간세포암 세포주 HEPG2를 대상으로 Nap1L1 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 컨스트럭트를 적용하였습니다.

표적되지 않은 야생형 대립유전자와 CRISPR/Cas9 표적 대립유전자를 각각 녹색 및 청색 형광체로 표지된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였습니다. 특수하게 최적화된 형광 PCR 프로토콜을 사용하여 표적 클론의 증폭 산물을 높은 수율로 얻었습니다. 개별 클론 샘플 내에서 녹색 및 청색 형광 염료 간의 간섭은 관찰되지 않았습니다.

모세관 겔 전기영동으로 결정한 단편 크기를 분석한 결과, 여기에 제시된 두 클론에서 각각 1bp 및 10bp의 결실이 확인되었습니다. 생거 시퀀싱 결과는 모세관 겔 전기영동 분석 결과와 일치하였습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 선택된 클론들이 NAP1L1을 발현하지 않음을 확인하였습니다.

이 절차를 수행할 때 많은 수의 샘플이 포함되어 있으므로 각 샘플에 신중하게 라벨을 부착하는 것이 중요하며, 형광 표지 증폭산물은 빛에 민감하므로 노출 시간을 최소화해야 함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 관심 유전자가 무엇인지, 완전히 넉아웃되었는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석, 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 모세관 겔 전기영동과 결합된 형광 PCR을 이용하여 CRISPR/Cas9으로 유도된 돌연변이 클론을 고처리량 방식으로 유전형 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.