Name: CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 형광 PCR과 모세관 젤 전기 영동을 결합한 고처리량 CRISPR/Cas9 유전자형 분석 기술을. 이 방법은 유전학 및 암 생물학 연구에서 유전자 녹아웃 효과를 효율적으로 확인하는 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 모세관 전기 영동 실험을 도와 양 탄시 민, 미스 헬렌 옹, 박사 자오 이순신에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 / 2,011분의 1,314 NMRC 및 환경부 AcRF 계층이 기금 보조금 MOE2011-T2-1-051을 부여 NMRC / IRG에 의해 지원되었다.

<ol><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2Fcas9%2C+a+novel+genomic+tool+to+knock+down+microRNA+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR/cas9, a novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.</a> Sci. Rep. 6, 22312(2016).</li>
<li>O'Connell, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+RNA+recognition+and+cleavage+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9.</a> Nature. 516, 263-266 (2014).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154, 1380-1389 (2013).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24157548">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Perez, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+HIV-1+resistance+in+CD4%2B+T+cells+by+genome+editing+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases.</a> Nat. Biotechnol. 26, 808-816 (2008).</li>
<li>Santiago, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+knockout+in+mammalian+cells+by+using+engineered+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases.</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).</li>
<li>Sung, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat. Biotechnol. 31, 23-24 (2013).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343, 84-87 (2014).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+a+CRISPR%2FCas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509, 487-491 (2014).</li>
<li>Guschin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+general+assay+for+monitoring+endogenous+gene+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification.</a> Methods Mol. Biol. 649, 247-256 (2010).</li>
<li>Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+in+human+cells+with+zinc+finger+nucleases+constructed+via+modular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly.</a> Genome Res. 19, 1279-1288 (2009).</li>
<li>Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+CRISPR%2FCas9-mediated+mutants+using+fluorescent+PCR-capillary+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis.</a> Sci. Rep. 5, 15587(2015).</li>
<li>Liu, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Responses+of+Stem+Cells+to+Telomere+Uncapping-A+Potential+Strategy+to+Improve+the+Safety+of+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Distinct Responses of Stem Cells to Telomere Uncapping-A Potential Strategy to Improve the Safety of Cell Therapy.</a> Stem cells. 34, 2471-2484 (2016).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+highly+active+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9-mediated+gene+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation.</a> Nat. Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350, 1096-1101 (2015).</li>
<li>Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+and+genome-wide+libraries+for+CRISPR+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening.</a> Nat. Methods. 11, 783-784 (2014).</li>
<li>Urnov, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+endogenous+human+gene+correction+using+designed+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases.</a> Nature. 435, 646-651 (2005).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15, 321-334 (2014).</li>
<li>Dahlem, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+methods+for+generating+and+detecting+locus-specific+mutations+induced+with+TALENs+in+the+zebrafish+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Simple methods for generating and detecting locus-specific mutations induced with TALENs in the zebrafish genome.</a> PLoS Genet. 8, e1002861(2012).</li>
<li>Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genome+editing+and+phenotyping+facilitated+by+high+resolution+melting+curve+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis.</a> PLoS One. 9, 114632(2014).</li>
<li>Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+with+CRISPR-Cas-derived+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases.</a> Nat. Commun. 5, 3157(2014).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

선택의 모델 세포주에서 특정 유전자에서 노크는 유전자가 특정 세포 맥락에서하는 역할을 해명하기위한 일상이되었다. 사실, 여러 게놈 넓은 화면은 게놈 14, 15, 16에 거의 알려진 모든 인간의 유전자를 대상으로 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하는 현재 사용할 수 있습니다. 이러한 대규모의 화면 (또는 관심의 개별 유전자의 대상도 소규모)로, 설계와 같은 유전자의 다른 궤적을 대상으로 sgRNAs을 활용하는 것이 중요하다. 명백하게 유전자의 고갈의 실제 효과 항복 것이 사용되는 다른 sgRNAs 일관된 결과. 이와 같이, 하나 개의 유전자 타겟팅을 정확하게 사용 개별 sgRNA 각각으로부터 다수의 클론 유전자형 고용량 유전자형 단계를 필요로한다. 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술은 그 설명정확하게이 작업을 수행 할 수 있습니다 다시. <p cla...

역방향 유전 방식은 과학자들이 셀 또는 전체 유기체의 게놈의 특정 변경의 효과를 규명 할 수있다. 예를 들어, 특정 유전자의 발현이 세포의 또는의 기능을 갖는다는 효과를 확인하기 위해 유전자 녹다운 (1, 2) (부분 감소) 또는 유전자 녹아웃 (3), 4 (완전 제거)에 의해 감쇠 될 수있다 유기체의 개발. 유전자 녹아웃 (knockout) 실험은 징크 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성화 제와 같은 이펙터 클레아 (TALENs)와 같은 특정 프로그램 시퀀스 클레아의 도입 이후 쉽게되고있다. 그러나 정기적으로 짧은 회문 반복 (CRISPR)을 산재 클러스터 된의 상대적으로 최근의 특성화 / Cas9 시스템은 세대를 수행 할 수있는 전 세계 모든 실험실은 매우 간단했다전자 녹아웃 실험. 본질적으로, CRISPR / Cas9 시스템은 두 개의 필수 성분-A 인식 및 게놈의 특정 염기 서열에 상보성 단일 결합을 통해 가이드 RNA (sgRNA) 및 Cas9라고하는 효소로 구성된다. 게놈 DNA의 sgRNA-Cas9 복합체의 특이 적 결합 및 동작의 여파는 DNA의 이중 가닥을 절단한다. 이는 다시, 계속해서 비 - 상동 최종 접합 (NHEJ) 또는 동종 재조합 (HR) 경로를 통해 복구 된 세포에서 DNA 손상 반응 메커니즘을 트리거한다. NHEJ 수리 메커니즘 (그러나 HR 메커니즘이) 자주 삽입 / 삭제 (INDEL) 돌연변이의 결과로, 수리의 사이트에서 무작위로 삽입 또는 뉴클레오티드의 삭제를 초래하기 때문에, 엑손의 독서 프레임이 이동 될 수 있습니다. 이 다음에 의한 번역 및 넌센스 매개 붕괴 5, 6의 조기 종료에 유전자의 녹아웃 될 수 있습니다7. 유전자를 노크의 CRISPR / Cas9 시스템의 도입에 의해 제공되는 편리함에도 불구하고, 표적 세포의 클론의 유전자형은 특히 8, 9를 설정하는 높은 처리량, 병목 남아있다. 주요 본질적인 한계로 고통 또는 재정적 비용이 많이 드는 중 기존 기술. 예를 들어, 10 이중 가닥 DNA에서 불일치를 검출하는 효소 분석이다 검사원 또는 T7E1 분석은 야생형 클론 및 동형 접합성 돌연변이를 구별 할 수없는 이들 클론은 동일한 대립 유전자를 가지고 있고, 따라서 이후 (그 대립 동일 돌연변이 클론) 이들 DNA 서열 11 불일치를 표시하지 않는다. 또한, 높은 처리량 설정에서, 돌연변이 클론 유전형의 황금 표준으로 간주됩니다 생거 시퀀싱의 사용으로 인해 높은 비용 바람직하지 않다. 여기, 우리는 DET을 제시다른 유전자형 기존 기술의 한계를 회피하고 클레아 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 스크린을 수행하는데 특히 유용 할 수있는 형광 PCR 모세관 전기 영동 기술의 ailed 프로토콜. 이 방법을 수행 할 기술적으로 간단하고 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>HEPG2 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP plasmid</td><td>Addgene</td><td>PX458</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11668027</tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.5%), 페놀 레드 없음</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Water, 분자생물학 등급</td><td>GE 헬스케어</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>CRISPR sgRNA 삽입 올리고뉴클레오티드(감지)</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>서열: 5'-CACCGCTAACCTTTCAGCCTGCCTA-3'CRISPR</td></tr> <tr><td>sgRNA 삽입 올리고뉴클레오티드(안티센스)</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>서열: 5'-AAACTAGGCAGGCTGAAAGGTTAGC-3'</td></tr><tr><td>표지되지 않은 PCR 증폭 포워드 프라이머</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>서열: 5'-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'; 이 프라이머는 PCR 증폭 대립유전자</td></tr><tr><td>6-FAM 표지 형광 PCR 전방 프라이머</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>염기서열: 5'-6-FAM-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'HEX</td></tr><tr><td>-표지 형광 PCR 전방 프라이머</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>염기서열: 5'-HEX-CACTAACTCCAATGCTTCAGTTTC-3'</td></tr><tr><td>라벨링되지 않은 PCR 역방향 프라이머</td><td>AITbiotech</td><td>없음</td><td>서열: 5'-CCTCTTCCAAGTCTGCTTATGT-3'Taq</td></tr> <tr><td>PCR 코어 키트</td><td>QIAGEN</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Di 포름아미드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311320</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ 염료 크기 표준</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4322682</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well 반응 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306737</td><td></td></tr><tr><td>3500xL Genetic 분석기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4405633</td><td></td></tr><tr><td>3500 Series 2 program</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4476988</td><td></td></tr><tr><td>Gene Mapper 5 program</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4475073</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Cell Kit</td><td>QIAGEN</td><td>1045696</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>NAP1L1 항체 ( N-term)</td><td>Abgent</td><td>AP1920b</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Matrix Protein p84 항체 [5E10]</td><td>GeneTex</td><td>GTX70220</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr을 유전자형하기 위해 형광 pcr-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 cas9 매개

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

프로그램 게놈 편집 도구의 개발은 특정 게놈 서열이 세포 전체 유기체의 기능에서하는 역할을 이해하는 역 유전학의 사용을 촉진했다. 이 원인은 엄청나게 CRISPR의 최근 도입 연구자하기 위해, 다른 것들 중, 게놈과 전 사체를 조작 노크, 노크, 또는 표적 유전자에 노크 할 수 있습니다 / Cas9 시스템 - 다용도 도구의 도움되었습니다 방법. 유전자를 녹아웃의 목적을 위해, CRISPR / 이중 가닥 나누기 휴식 사이트에서 뉴클레오티드의 틀 이동을 유발하는 삽입 또는 삭제를 소개하는 비 동종 최종 합류 DNA 수리 경로를 모집 Cas9는 매개. 그러나, 개별 가이드 RNA가 바람직하지 않은 오프 대상 영향을 일으킬 수 있으며, 이들을 배제하기 위해, 여러 가이드의 RNA의 사용이 필요하다. 대상이 또한 다수의 클론 대량 선별이 교대 EF에서의 사용을 돌려서, 이는 요구되는 것을 의미녹아웃 클론 유전자형 높은 처리량 기술을 ficient. 현재 유전자형 기술 중 하나는 따라서 높은 처리량을 위해 적합하지 않다 렌더링, 본질적인 한계로 고통 또는 높은 비용이 발생. 여기서, 주형으로 조 세포 용 해물로부터 게놈 DNA를 사용하여 형광 PCR을 사용하고, 모세관 젤 전기 영동을 통해 PCR 단편을 해결하기위한 우리 상세히 프로토콜. 이 기법은 하나의 단편 간의 염기쌍의 차이를 구별하기에 충분히 정확하고, 따라서 표적 유전자의 코딩 서열의 프레임 이동의 유무를 나타내는에 적합하다. 이 정확한 지식을 효과적으로 확증 시퀀싱 단계의 필요성을 배제하고 사용자가 그 과정에서 시간과 비용을 절약 할 수 있습니다. 여기에 다른 곳에서와 같이 또한,이 기술은 다수의 유전자에 대한 가이드 RNA를 표적 다양한 조직 기원의 다양한 포유 동물 세포 유전형에 다양한 것으로 입증되었습니다.

여기에 설명 된 PCR 형광 모세관 전기 영동 기술은 외래 DNA 전달하는 의무가 거의 모든 세포주에서 유전자 타겟팅 임의 영역에 적용될 것으로 기대된다. 우리는 이전에 대장 암 세포주 12 세 유전자를 대상으로 자사의 응용 프로그램을 증명하고있다. 여기서, 우리는 CRISPR와 대상으로 간암 세포주 인 HepG2를 유전형에서의 효능 / Cas9 1 (NAP1L1) 유전자와 마찬가지로 뉴 클레오 단백질 조립 한 구성에 대해 도시한다. 사실, 우리는 성공적 수많은 다른 유전자 (12)를 대상으로 인간을 제외한 포유 동물 세포주, (13)를 포함하여 다양한 세포 유전형하는 형광 PCR 모세관 전기 영동 방법을 이용했다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

이 기술의 전반적인 목적은 CRISPR/Cas9으로 유도된 삽입 및 결실 돌연변이 클론의 유전형을 고처리량 방식으로 분석하는 것입니다. 이 방법은 선택한 SAIL 모델에서 특정 유전자를 녹아웃했을 때의 표현형 효과와 같은 유전학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 소량부터 고처리량 스크리닝까지 다각적으로 유연하게 적용 가능하다는 점입니다.이 방법은 인간 암 유전학에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 세포, 줄기세포, 일차 세포 또는 비인간 유래 세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 우리는 처음 단쇄 반복 서열(short tandem repeats) 또는 STR 타이핑 분석을 수행했을 때 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 절차를 시작하려면, 형광 표지 Cas9과 단일 가이드 RNA를 공동 발현하는 플라스미드를 선택한 세포에 형질전환시키십시오.세포를 트립신 처리하고 형광 표지된 클론 약 3,500개를 선택합니다. 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 성장 배지 8mL가 담긴 10cm 디쉬에 클론을 500개, 1,000개, 2,000개씩 나누어 플레이팅합니다. 5% CO2 분위기의 37°C에서 세포를 배양하며, 단일 세포 콜로니가 육안으로 보일 때까지 5일마다 배지를 교체합니다.그다음 약 5 µL의 성장 배지가 담긴 200 µL 피펫으로 개별 콜로니를 흡입합니다. 각 콜로니를 200 µL의 성장 배지가 들어 있는 별도의 웰로 옮깁니다. 세포를 재현탁하기 위해 각 혼합물을 반복적으로 피펫팅합니다.세포가 50에서 90% 합류도(confluence)에 도달할 때까지 앞서 설명한 조건에서 배양합니다. 웰에서 과잉 배양액을 제거하고, 각 웰에 페놀 레드 없는 0.05% trypsin EDTA 25 µL를 첨가합니다. 세포를 37 °C에서 7분 동안 배양합니다.그런 다음 혼합물을 반복적으로 피펫팅하여 트립신 처리된 세포를 재현탁합니다. 현미경으로 웰을 관찰하여 세포가 웰 벽에서 완전히 분리되었는지 확인합니다. 개별 클론의 반복 시료를 준비하려면, 각 세포 현탁액 5 µL를 빈 96-웰 배양 플레이트로 옮깁니다.각 웰에 200 µL의 성장 배지를 추가합니다. 그런 다음 빈 96-웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 µL의 용해 버퍼를 넣습니다. 각 세포 현탁액 5 µL를 이 96-웰 플레이트로 옮깁니다.액체가 웰 바닥에 가라앉을 때까지 플레이트를 짧게 원심분리합니다. 각 세포 현탁액의 남은 15 µL에 200 µL의 성장 배지를 추가합니다. 클론의 녹아웃 상태를 나중에 확인하기 위해 원래의 현탁액과 복제본을 배양 조건 하에 보관합니다.그 후 열 사이클링을 사용하여 용해 버퍼 내의 세포를 완전히 용해시킵니다. 용해물을 짧게 원심 분리합니다. 용해물을 40 µL의 nuclease free water로 희석합니다.희석된 용해물을 볼텍싱하고 짧게 원심 분리합니다. 형광 PCR을 수행하기 전에, 용해된 야생형 세포를 대상으로 표지되지 않은 여러 쌍의 프라이머의 특이성을 설계하고 테스트하십시오. 최적의 프라이머 쌍을 확인한 후, 형광체가 표지된 정방향 프라이머와 표지되지 않은 역방향 프라이머를 준비하십시오.정제된 genomic DNA를 사용할 때와는 결과가 다를 수 있으므로, vortex cells를 사용하여 프라이머의 특이성을 테스트하고 자제 제작한 lysis buffer를 사용하여 용해하십시오. 라벨링된 프라이머를 사용하여, 희석된 용해물 3 µL를 넣고 20 µL로 형광 PCR 반응을 수행하여 표적 영역을 증폭합니다. 증폭 산물 5 µL를 1% agarose gel에서 전개하여 PCR 증폭 산물의 크기와 상대적 양을 평가하십시오.시료 준비를 시작하려면, nuclease free water를 사용하여 야생형 및 CRISPR/Cas9 표적 DNA의 증폭 산물을 약 2.5 nanograms per microliter 농도로 희석하십시오. 희석된 야생형 및 표적 DNA 시료를 동일한 부피로 함께 혼합합니다. 96 well PCR plate의 웰에 탈이온 formamide와 염료 표지 크기 표준물질의 29:1 혼합물 9 microliters와 혼합된 증폭 산물 1 microliter를 로딩하십시오.플레이트를 단단히 밀봉하고 PCR thermocycler를 사용하여 시료를 95 °C에서 3분 동안 가열합니다. 가열 직후, 플레이트를 얼음 위에서 3분 동안 냉각합니다. 유전자 분석기를 사용하여 모세관 겔 전기영동을 수행합니다.전기영동이 완료되면, 데이터를 분석 소프트웨어로 가져와 플롯을 그립니다. 적절한 염료 채널에서 데이터를 검토하여 사이즈 표준의 품질을 확인합니다. 그런 다음, 비표적 야생형 대조군과 표적 클론의 염료 채널 값을 txt 형식으로 내보냅니다.이 파일에서 염료 식별 정보, 샘플 파일 이름, 단편 크기 및 피크 높이 값을 스프레드시트 소프트웨어로 가져옵니다. 각 샘플에서 표적 클론과 표적되지 않은 야생형 대조군 사이의 단편 크기 차이를 계산합니다. 3 염기쌍의 배수가 아닌 인델(indel) 돌연변이가 있는 클론을 식별합니다.보관된 복제본으로부터 선택된 클론을 연속적으로 확장합니다. Sanger 시퀀싱과 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 클론의 유전자형을 결정하고 클론의 녹아웃 상태를 확인합니다. 간세포암 세포주 HEPG2를 대상으로 Nap1L1 유전자에 대한 CRISPR/Cas9 컨스트럭트를 적용하였습니다.표적되지 않은 야생형 대립유전자와 CRISPR/Cas9 표적 대립유전자를 각각 녹색 및 청색 형광체로 표지된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였습니다. 특수하게 최적화된 형광 PCR 프로토콜을 사용하여 표적 클론의 증폭 산물을 높은 수율로 얻었습니다. 개별 클론 샘플 내에서 녹색 및 청색 형광 염료 간의 간섭은 관찰되지 않았습니다.모세관 겔 전기영동으로 결정한 단편 크기를 분석한 결과, 여기에 제시된 두 클론에서 각각 1bp 및 10bp의 결실이 확인되었습니다. 생거 시퀀싱 결과는 모세관 겔 전기영동 분석 결과와 일치하였습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 선택된 클론들이 NAP1L1을 발현하지 않음을 확인하였습니다.이 절차를 수행할 때 많은 수의 샘플이 포함되어 있으므로 각 샘플에 신중하게 라벨을 부착하는 것이 중요하며, 형광 표지 증폭산물은 빛에 민감하므로 노출 시간을 최소화해야 함을 기억하십시오. 이 절차 이후에는 관심 유전자가 무엇인지, 완전히 넉아웃되었는지와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 정량적 RT-PCR, 웨스턴 블롯 분석, 생거 시퀀싱(Sanger sequencing)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 모세관 겔 전기영동과 결합된 형광 PCR을 이용하여 CRISPR/Cas9으로 유도된 돌연변이 클론을 고처리량 방식으로 유전형 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

using-fluorescent-pcr-capillary-gel-electrophoresis-technique-to

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

CRISPR/Cas9는 유전자와 유전적 요소를 파괴하는 강력한 시스템입니다. 여기에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 포유류 세포주에서 게놈 결실을 효율적으로 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

CRISPR / Cas9를 통해 포유 동물 세포주의 게놈에 삭제 세대

체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

CRISPR-Cas 기술은 게놈 편집 분야에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 원하는 생식계열 편집을 찾고 분리하는 것은 여전히 주요 병목 현상으로 남아 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 표준 PCR, 제한 분해 및 겔 전기영동 기술을 사용하여 생식계열 편집을 위해 F0 CRISPR 주입 제브라피쉬 정자를 신속하게 스크리닝하는 강력한 방법을 설명합니다.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

여기에서는 안정적인 zpc:cas9 knock-in line과 sgRNA 발현 카세트의 Tol2 매개 전달을 결합하는 모계 돌연변이를 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

zpc:cas9 Knock-in 제브라피시를 사용한 모계 돌연변이 생성

배우세요 형광 PCR과 모세관 젤 전기 영동을 결합한 고처리량 CRISPR/Cas9 유전자형 분석 기술을. 이 방법은 유전학 및 암 생물학 연구에서 유전자 녹아웃 효과를 효율적으로 확인하는 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

더 많은 동영상 탐색