Name: 결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 배우세요 안구 표면 질환 연구를 위한 비침습적 인상 세포학 기법으로 결막 세포를 분리하고 면역표현형 분석하는 방법입니다. 이 기술은 임상 및 실험실에서 간단하게 적용할 수 있습니다.

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저자는 기술 단계를 돕는 Nandini Nallappan 및 Sharon Yeo에게 감사드립니다. 이 연구는 이공천 (Lee Kong Chian) 의대, 남양 공대 (Nanyang Technological University)의 KGC 창업 보조금 및 싱가포르 보건 성 국립 의료 연구위원회 (National Medical Research Council, NMRC)의 고위 임상 의학자 상 (Northern Clinician Scientist Award)의 LT (NMRC / CSA / 045 / 2012), NMRC의 보조금으로 KGC와 LT (NHIC-12D-1409007)에 국가 보건 혁신 센터 (National Health Innovation Center)가 관리한다.

이 연구에 사용 된 모든 안구 샘플은 SingHealth Centralized Institutional Review Board와 싱가포르 남양 기술 대학교 제도 심사위원회의 승인을받은 싱가포르 국립 안과 센터의 Dry Eye Clinic에서 수집했습니다. 참고 : 피험자는 IC를 실시하기 전에 염증 정도와 눈물 기능 장애의 중증도를 평가하기 위해 임상 검사를 받았다. 임상 시험은 진단 장비, Schirmer &#39;s test 17 , SPEED (Standard Patient Evaluation of Eye Dryness) 18 설문지, 각막 절개술 (SPEED) 설문 18을 사용하여 비 침습적 눈물 방울 차단 시간 (NI-TBUT) 14 및 결막 충혈 염색 19 . 1. IC에 의한 안구 샘플 채취 <ol><li> 임상 상태의 결정 후, 마취참가자의 눈은 상지 구 및 결막에 1 ~ 2 방울의 국소 마취제 인 염산 프로 팔라 카인 (proparacaine hydrochloride)을 적용하여 관찰 하였다. 마취의 쑤시는 감각이 지치기까지 4 ~ 5 분 동안 기다리십시오. </li><li> 두 가지 인상 세포학 장치로 비강 결막 결막에서 샘플을 수집합니다. 참고 : 두 개의 노출 샘플을 수집하는 데 하나의 장치가 사용됩니다. 여기서는 두 개의 장치를 사용하여 4 개의 임프레션 멤브레인을 수집했습니다. <ol><li> 결막에 인상 세포학 장치를 접선 방향으로 위치시킵니다. 누름 단추를 부드럽게 누르고 2 - 3 초 동안 누릅니다. 참고 : 장치는 멤브레인과 함께 제공됩니다. 버튼을 누르면 압력이 자동으로 해제됩니다. 압력을 해제하고 장치를 제거하는 데 단지 몇 초가 걸립니다. </li></ol></li><li> 막 1 ML 문화 미디어 (로스웰 파크 기념 연구소 매체 (RPMI) + 10 % 태아 소 혈청이 들어있는 microcentrifuge 튜브로 막을 출시(FBS) + 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (펜 스트렙토 마이신) </li><li> 10 μL 피펫 팁으로 약 1 분 동안 지속적으로 긁어 냄으로써 장치의 막에서 세포를 분리합니다. 참고 : 멤브레인 표면이 고르지 않으면 긁힘이 완료됩니다. 각 막으로부터의 세포 수는 가변적이다 (100 - 500 세포 / 막). 수집 2 ~ 3 시간 이내에 샘플을 처리하십시오. </li></ol> 2. 유동 세포 계측법에 의한 세포의 면역 표현형 측정 <ol><li> 매체를 제거 실온에서 5 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 유동 세포 계측법 완충액 (인산 완충 식염수 (PBS) + 0.05 % 소 혈청 알부민 (BSA)) 50 μL로 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 항체 ( 예 : CD3 브릴리언트 바이올렛 (BV) 510 (UCHT1), CD4 알로 피코시 아닌 -H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 피코 에리 트린 (PE) -A, CD45RO PE 시아닌 7 Cy7) -A, live / dead cell mark 7-ADD)를 실온에서 20-30 분 동안어두운. 제조업체의 프로토콜에 따라 항체를 직접 사용하십시오. 참고 : 항체 농도는 CD3-BV510 2.5 μL, CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD 1.25 μL 및 CCR7-PE 10 μL를 사용하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)를 사용하여 다양한 농도의 항체를 적정합니다. 적정을 위해 제조자의 프로토콜에 언급 된 항체 농도를 취하고 권장 농도의 1/2을 사용하십시오. 다른 형광 색 채널로 넘치지 않도록 항체의 최소 농도를 사용하십시오. 언급 된 항체 농도에서 명확한 신호가 관찰되었습니다. 보정은 초기에 Williams et al .에서 언급 된 프로토콜에 따라 PBMC를 시험함으로써 수행되었다. 시험을 위해 PBMC를 여기에 사용 된 동일한 항체 세트와 함께 배양하고 단일 및 다중 항체 얼룩을 비교하여 보상했습니다. </li><li> 부화 후od, 튜브에 얼룩 버퍼 1 ML을 추가 잘 혼합하고 실온에서 5 분 450 XG에서 원심 분리기. 얼룩 버퍼 200 μL에 Resuspend 세포. </li><li> 플로우 cytometry 기계에서 샘플을 실행합니다. <ol><li> 데이터를 수집하기 전에 제조 업체의 지침에 따라 다른 일에 데이터 수집을 정상화하기 위해 cytometer 설정 및 추적 (CS &amp; T) 비즈와 함께 흐름 cytometer의 채널 전압을 보정. <ol><li> 유동 세포 계측법 데이터 수집 소프트웨어를 열고 &quot;Set up &amp; QC&quot;버튼을 클릭하고 올바른 CS &amp; T 비드 로트 번호를 선택하고 비즈를로드 한 다음 &quot;시작&quot;버튼을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 기계에 샘플을로드하기 전에 부드럽게 튜브를 두드려 세포를 Resuspend. 데이터 수집 소프트웨어를 열고 &quot;미리보기&quot;를 클릭하십시오. 임계 값 속도가 안정되면 &quot;획득&quot;을 클릭하십시오. 샘플 레벨을 모니터하고 샘플이 부족하면 &quot;중지&quot;를 클릭하십시오. 참고 : 샘플 당 10,000 개의 이벤트를 확보하십시오. </li&gt; <li> 10,000 이벤트를 획득 한 후, 워크 시트에 SSC-A 및 FSC-A 도트 플롯을 생성하십시오. <ol><li> &quot;Polygon Gate&quot;버튼을 클릭하고 파편을 제외하기 위해 FSC-A 값&gt; 5 x 10 4 인 모든 이벤트에 게이트 (P1 임)를 그립니다. &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 연 다음 &quot;P1&quot;을 선택하십시오. P1 도트 플롯의 X 축에서 FSC-A를 클릭하고 CD3-BV510으로 변경하십시오. &#39;다각형 게이트&#39;를 그려 CD3 + 인구를 선택하고 이름을 &#39;P2&#39;로 지정하십시오. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. P2 도트 플롯의 x 축에있는 FSC-A를 클릭하고 7-AAD로 변경하십시오. 7-AAD 인구를위한 &#39;다각형 게이트&#39;를 그리고 &#39;P3&#39;을 선택하십시오. 여기서 P3은 CD3 +살아있는 세포. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. X 축에서 CD3-BV510을 클릭하고 P3 도트 플롯의 y 축에서 CD4-APCH7을 클릭합니다. 직사각형 그리기 사분면의 위쪽과 아래쪽에 각각 &#39;P4&#39;와 &#39;P5&#39;를 선택하십시오. P4는 라이브 CD3 + CD4 + 이고 P5는 라이브 CD3 + CD4 - T 세포입니다. </li><li> &quot;도트 플롯 만들기&quot;버튼을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 만들고 도트 블롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 한 다음 &quot;속성&quot;을 선택하여 &quot;플롯 편집기&quot;창을 엽니 다. X 축에서 CD45RO PE-Cy7을 클릭하고 P4 및 P5 플롯의 y 축에서 CCR7-PE를 클릭합니다. 이 점 그림에 &#39;쿼드 게이트&#39;를 그립니다. 참고 : 여기 왼쪽 위, 오른쪽 위, 오른쪽 아래 및 오른쪽 아래 사분면은 순진한 중앙 메모리 (T CM ), 전자(T EM ), 최종 분화 된 이펙터 메모리 (T EMRA ) T 세포를 포함한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jamaophthalmology/article-abstract/632182">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li>
<li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+conjunctival+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li>
<li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, Suppl 2. S211-S220 (2001).</li>
<li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li>
<li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li>
<li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li>
<li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li>
<li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2150378">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li>
<li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors%3A+review+article%5BTitle%5D)+AND+%22Arq+Bras+Oftalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li>
<li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li>
<li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+%28IC+score%29+in+patients+with+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li>
<li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impression+cytology+of+the+ocular+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li>
<li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph%5BTitle%5D)+AND+%22Cont+Lens+Anterior+Eye%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li>
<li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+ocular+bulbar+redness%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Physiol+Opt%22%5BJournal%5D)">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li>
<li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ocular+Redness+Index%3A+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li>
<li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li>
<li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li>
<li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+tear+syndrome%3A+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li>
<li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Opthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li>
<li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312(2017).</li>
<li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta%2B+T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4%2B+T+cells+increases%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%29%22%5BJournal%5D)">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li>
<li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금융 이익을 선언하지 않습니다.

이는 스크래핑, 스왑 핑, 피펫 팅 또는 흡착 여과지 1 , 2 와 같은 기존 기술과 비교하여 비교적 빠른 면역 프로파일 링을 위해 외래 진료소에서 사용할 수있는 쉽고 빠르며 덜 침습적 인 기술입니다. 이 기법의 변형은 연구 설정에서 이미 사용되고 있습니다 22 . 향후 제안 된 방법론의 적용은 안구 질환, 특히 면역 표현형을 필요로하는 임상 시험에서 환자 층화에 적용됩니다. 이 기술의 주요 문제점은 인상 채취 및 스크래핑 후에 회수되는 비교적 적은 면역 세포입니다. 개체 당 4 번의 노출에서 회복 된 CD3 + T 세포의 총 수는 ~ 500 ~ 1,000 개의 세포에서 다양합니다. 안구 샘플은 세포의 추가 손실을 피하기 위해 최소 횟수 동안 유세포 분석을하기 전에 세척 하였다에스. 프로토콜 내에 남아있는 중요한 단계와 과제는 높은 세포 수를 달성하기 위해 눈 샘플을 효율적으로 수집하고 멤브레인을 적절히 스크래핑하는 것입니다. 그럼에도 불구하고이 제한은 특정 면역 표현형에 편향되지는 않을 것입니다. 세포 수율을 극대화하기 위해 여기에서 수행 된 문제 해결은 항체 배양 후 및 배양 전 세척 단계 수를 줄이는 것이 었습니다. IC 사용에는 다른 제한 사항이 있습니다. 스티븐 존슨 (Steven Johnson) 증후군과 같이 심하게 각화되거나 섬유화 된 안구 표면을 가진 환자에서 세포 수율은 본 연구에서보다 낮을 수 있습니다. 같은 날 분석하지 않고 샘플을 보관하면 면역 세포의 비율이 달라질 수 있습니다. 특정 세포 유형이 다른 세포 유형보다 저장에 내성이 있는지를 예측하는 것은 어렵습니다. 이전 연구에서 결막 상피 세포의 HLA-DR 발현이 증가한 것으로보고되었으므로HLA-DR과 특정 면역 세포의 수준 사이의 상관 관계를 평가하기 위해 esting. 면역 세포는 또한 케모카인의 발현 수준과 관련 될 수있다. 이러한 문제는 향후 연구에서 다루어 져야한다.

Impression cytology (IC)는 Thatcher et al .에 의해 1977 년에 처음 수행되었다 . 그들은 스크래핑, 스왑 또는 피펫 팅과 같은 그 당시 사용 가능한 다른 기술 대신 환자로부터 결막 세포를 수집하기 위해 플라스틱 인상 디스크를 사용했습니다 1 . IC의 현재 기술은 구와 눈의 결막을 각인시키고 결막 세포의 가장 표면층을 모으기 위해 흡수성 여과지 2 를 사용합니다. 분화의 최종 단계에 도달 한이 세포들은 계속 눈물을 흘립니다 3 . 상피 세포 4 , 상 세포 3 , 5 및 점막 관련 림프 조직 - 상피 - 관련 이펙터 T 세포 또는 수지상 세포 6의 세 가지 주요 개체군이 IC 표본에서 발견됩니다. IC 칩 표면의 안구 세포ples은 현미경 검사, 면역 블 랏팅 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 분석 할 수 있습니다 7 . 유동 세포 계측법은 최근에 IC 멤브레인을 긁어서 수집 한 면역 세포를 분석하는데 사용되었습니다 8 . 흥미롭게도 IC6,9는 점막 각 결막염, 비타민 A 결핍, 간질 성 천포창, 아토피 성 질환, 상연 성 각 결막염, 춘추 각 결막염 및 상피 편평 상피화를 포함한 많은 안구 질환을 평가하는데 사용되어왔다. IC는 또한 콘택트 렌즈 착용, 안구 표면 미생물 검출, 종단 연구 10 , 11 , 12의 치료 효과 및 내성 시험에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었습니다. 의료 기기 (EyePrim)는 일종의 폴리이전에 유동 세포 계측법 (OSIC-flow)으로 안과 인상 세포학 기술에 대해 검증 된 종전 샘플링을 사용하여 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 모니터 할 수있는 기회를 열어주는 PES 0.2 μm 멤브레인 점막 유 천포창에서 진행성 결막 섬유증의 추정 질환 마커로 정의 된 상피 세포 백혈구 분석 13) . 초기 연구자들은 수동 인상이 필요한 고압 증기 멸균 된 PES 필터를 사용했습니다. 결과적으로 생산량은 가변적이었고 사용자에 따라 결정되었습니다. 이 의료 기기의 장점은 사용 편의성, 표준화 된 압력 (Pa 또는 N / m 2 )이며 반복성, 재현성 및 일관된 세포 재생을 가능하게합니다. 이 기술은 비 외과 수술이며, 수행하기 쉽고 빠르기 때문에 외래 환자 클리닉에서 유용합니다. 이 지침은 지침 93 / 42 / CEE, CE 0499 (SNCH)에 따라 Class I (무균) 의료 장비입니다. 필요한 것만이는 안구 표면의 무결성 유지를 보장하는 시술 중의 국소 마취이다. IC 이후에, 세포는 유동 세포 계측법을 위해 즉시 처리 될 수 있습니다. 또한, 비 안과 기술자 및 간호사가 안구 표면을 샘플링하도록 훈련받을 수 있습니다. 다른 기술에 비해 IC의 향상에도 불구하고 몇 가지 과제가 남아 있습니다. 예를 들어, IC의 위치에 따라 샘플링 영역 및 구 결막에서 지역적 차이로 인해 변동이있을 수 있습니다. 변동의 또 다른 원인은 IC 동안 다양한 양의 압력을 가하기 때문입니다. 다른 방법 론적 쟁점은 세포 처리 표준화와 관련이있다. 여기에는 지속 기간과 고정 방법, 시료 채취 된 물질의 안정성에 영향을 줄 수있는 저장 조건이 포함된다. 이 기술의 전반적인 목표는 안구 인상 샘플을 고립시키는 방법을 개발하는 것입니다.t는 사용하기 쉽고 비 침습적이며 임상 샘플의 면역 학적 특성 분석에 적용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences 337168 BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>국소 마취제</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 나트륨 용액</td><td>Bausch & Lomb UK Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name<</td><td>strong>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>슬릿 램프 BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>프리즘</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS서버 분석 소프트웨어</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

전통적으로 안구 표면 세포학은 주걱 기술 및 브러시 기술과 같은 기술로 연구됩니다. 이 기술의 문제점은 눈의 표면에 외상성 병변을 유발할 수 있다는 것입니다. 외상성 병변은 흉터, 눈꺼풀의 기형, 윤부 줄기 세포 결핍으로 진행될 수 있으며 경우에 따라 피험자에게 커다란 불편 함을 유발할 수 있습니다. 이러한 임상 적 문제를 피하기 위해 안구 건조증과 신 생물, 아토피 성 질환, 춘추 각 결막염 및 각 결막염을 진단하기위한 인상 세포학 (IC)이 개발되었습니다. 전형적으로, 임상의는 수작업으로 여과지를 필요한 모양으로 자르고이를 안구 표면에 적용합니다. 여기서는 시중에서 판매되는 의료 기기를 사용하여 IC를 수행하는 방법을 설명합니다. 이 기법은 유동 세포 계측법에 의한 면역 표현형 분석이 뒤 따릅니다. 이 기술은 수동 조작을 덜 필요로하고 안구 표면 손상을 줄입니다.

이 임상 장치에 의한 IC를 사용하여 안구 표면을 손상시키지 않으면 서 안구 표면 면역 세포를 분리 할 수있었습니다. 그림 1 은 IC가 수행 된 방법을 설명합니다. 샘플이 수집 된 곳과 다른 눈의 부위가 표시됩니다. 그림 2 는 10 건강한 컨트롤에서 수집 한 유동 세포 계측법의 대표 결과를 보여줍니다. 게이팅을 위해서는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 SSC와 7-AAD를 사용하십시오. 7-AAD - 세포는 살아있는 세포로 확인됩니다. 이 생균은 CD3 + 및 CD4 + 마커에 의해 특성화됩니다. 또한 CD4 + 및 CD4 - 개체군은 각각 CCR7 및 CD45RO 마커가있는 Naive, T EM , T CM 및 T EMRA 로 특징 지어졌습니다. CD3 + T 세포 중에는 인간의 안구 표면에서 이펙터 기억 T 세포가 우세합니다. 이전 e에서또한, CD8 + 기억 세포가 건강한 개체 중 결막 상피 세포의 주요 개체군임을 보여 주었다. 그림 3 은 CD4 + 및 CD8 + 이펙터 메모리 T 세포 (T EM 및 T EMRA )가 연구 된 건강한 대조군 10 명에서 인간 안구 표면의 주요 하위 집합임을 보여줍니다. 그림에 언급 된 각 집단은 그들의 마커 표현형 및 이름 (Naïve, T CM , T EM , T EMRA )으로 통보됩니다. 빨간색 숫자는 인구의 비율을 나타냅니다. 이 도면의 데이터는 평균 ± SEM <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> 그림 1 : 인상 세포학 장치에 의한 안구 표면에서 IC 샘플 수집. 샘플은 측두엽으로부터 수집되었다ar 영역을 갖는다. <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> 그림 2 : 유동 세포 계측법을 이용한 도트 플롯 그래프. 라이브 7-AAD - 세포가 선택되었습니다. CD3 + 세포는 먼저 문이 열리고,이 집단은 CD4 + 및 CD4 - 서브 세트로 게이팅되었다. 순진 (CCR7 + CD45RO - ), 중앙 기억 (CCR7 + CD45RO + ) 및 이펙터 메모리 (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) 부분의 비율은 CCR7 및 CD45RO 마커의 도움을 받아 결정되었습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> 에프그림 3 : 건강한 인간 안구 표면의 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 면역 세포 하위 유형. 건강한 사람 대조군에서 결막 내 CD4 + 및 CD8 + naive, central memory (T CM ) 및 effector memory (T EM 및 T EMRA ) 하위 집합의 분포 ; 각 데이터 포인트는 별도의 개별 평균 ± SEM을 나타냅니다. 인구의 비율은 각 인구의 이름 아래에 빨간색으로 표시됩니다. CD4 + T EMRA 인구가 언급 된 산점도에 포함되지 않았기 때문에 전체 인구 비율은 98 %이다 (Bose 등 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

노출 된 정상적인 안구 표면은 각막과 결막으로 이루어져 있습니다. 상피 세포, 배 세포 및 면역 세포가 결막에 존재한다. 여기, 노출 세포학의 비 침습적 기술은 인상 세포학 장치 및 결막의 면역 세포를 분석하는 유동 세포 계측법을 사용하여 설명합니다.

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

이 각막 인상 세포학 기법의 전반적인 목표는 안구 표면 질환에 관여하는 세포들의 면역 표현형을 분석하기에 충분한 세포를 얻는 것입니다. 이 방법은 안구 표면 염증에 어떤 면역 세포가 중요한지와 같이 안구 표면 분야의 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 상대적으로 비침습적이며 병원 및 실험실에서 수행하기 간단하다는 점입니다.이 기술은 특정 면역 세포 집단을 식별할 수 있게 해주므로, 안구 표면 염증성 질환의 치료에까지 그 영향이 확대됩니다. 이 방법은 안구 표면 면역 세포 집단에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 안구 독성학 및 안구 섬유화 연구에도 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 안구에서 수집되는 적은 수의 세포를 다루는 경험이 부족하여 어려움을 겪을 수 있습니다. 피험자의 임상 상태를 확인한 후, 피험자 안구의 상구결막과 하안검결막낭에 국소 마취제를 1~2방울 점안하십시오. 마취제의 작열감이 사라질 때까지 4~5분 동안 기다립니다.그런 다음 인상 세포학 장치를 측두부 결막 부위에 접선 방향으로 배치하고, 푸시 버튼을 2~3초 동안 부드럽게 누르며 유지합니다. 핀셋을 사용하여 수집된 안구 막 덩어리를 1 mL의 배지가 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 넣은 후, 10 µL 피펫 팁으로 막을 1분 동안 계속 긁어 장치에 남은 나머지 세포들을 회수합니다. 막을 긁을 때 주의하십시오. 너무 많이 긁으면 파편이 섞일 수 있으며, 너무 적게 긁으면 세포 회수율이 낮아질 수 있습니다.막의 표면이 고르지 않게 되면, 방금 시연한 것과 같이 동일한 눈의 비측(nasal side)에서 두 번째 수집을 반복하십시오. 첫 번째 안구 시료 현탁액으로 세포를 끌어당기고, 대상자의 반대편 눈에서 두 개의 시료를 수집하십시오. 수집 후 2~3시간 이내에 안구 세포를 원심 분리하고, 0.05% bovine serum albumin이 첨가된 phosphate buffered saline을 포함하는 50 µL의 Flow Cytometry Staining Buffer에 펠렛을 재현탁하십시오.다음으로, 빛을 차단한 상태에서 실온의 관심 항체 패널로 세포를 20~30분 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 1 mL의 염색 버퍼로 세포를 세척하고, 펠렛을 200 µL의 신선한 염색 버퍼에 다시 현탁합니다. 유세포 분석기 설정 패널에서 채널 전압을 보정하고, 제조사의 지침에 따라 데이터 획득을 정규화하기 위해 트래킹 비드 튜브를 설정합니다.그런 다음, 유세포 분석 데이터 수집 소프트웨어에서 Setup QC를 클릭하고 정확한 Cytometer 설정과 트래킹 비드 로트 번호를 선택하십시오. 비드를 로딩하고 Start 버튼을 클릭합니다. 이제 가볍게 두드려 세포 현탁액을 다시 부유시킨 후 튜브를 기기에 로딩하십시오.데이터 수집 소프트웨어를 실행하고 Preview를 클릭하십시오. Threshold Rate가 안정되면 Acquire를 클릭하십시오. 샘플의 양을 모니터링하며, 샘플이 모두 소모되면 Stop을 클릭하십시오.10,000개의 이벤트를 획득한 후, 전방 산란광(forward scatter)과 측방 산란광(side scatter) 면적 도트 플롯을 생성하고 폴리곤 게이트 도구를 사용하여 전방 산란광 면적 값이 5 × 10⁴보다 큰 모든 이벤트에 대해 population one 게이트를 그려 데브리스(debris)를 제외합니다. 'Create Dot Plot'을 클릭하여 새로운 도트 플롯을 생성합니다. 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 'Properties'를 선택하여 플롯 에디터 창을 엽니다.P1을 선택하고 x축의 전방 산란(forward scatter) 영역을 클릭하여 표시되는 축을 CD3로 변경하십시오. P2 모집단에 대한 새로운 도트 플롯(dot plot)을 열고 x축을 7-AAD로 변경하십시오. 생존 가능한 CD3 양성 세포를 선택하기 위해 7-AAD 음성 모집단 주변에 게이트를 그리십시오.이 게이트의 이름을 P3로 지정하고 새로운 도트 플롯을 엽니다. Plot Editor 창에서 x축으로 CD3를, y축으로 CD4를 선택합니다. 이제 P4 및 P5 모집단을 사용하여 두 개의 새로운 도트 플롯을 열고, 각 플롯의 x축에는 CD45RO 양성 세포가, y축에는 CCR7 양성 세포가 표시되도록 설정합니다.그 다음 CD3 양성, CD4 양성, CCR7 양성, CD45RO 양성 세포 주변에 P6 게이트를 생성하고, CD3 양성, CD4 음성, CCR7 양성, CD45RO 양성 세포, CD45RO 음성, CCR7 음성, CD4 음성, CD3 양성 세포, 그리고 CD45RO 양성, CCR7 음성, CD4 음성, CD3 양성 세포 주변에 각각 P7, P8, P9 게이트를 생성합니다. CD4 양성 및 CD4 음성 군집은 각각 CD45RO 양성, CCR7 양성인 중앙 기억 T 세포와 CD45RO 양성, CCR7 음성인 작동 기억 T 세포로 특징지을 수 있습니다.CCR7 및 CD45RO 마커 발현에 따라 CD45RO 음성, CCR7 음성인 말단 분화 작동 기억 T 세포입니다. 이러한 서브셋 중 CD4 양성 및 CD8 양성 작동 기억 T 세포는 건강한 사람의 안구 표면에서 일반적으로 관찰되는 T 세포의 주요 하위 집단입니다. 이 기술을 숙달하면, 적절히 수행했을 때 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.이를 시도하는 동안, 사이토카인 및 신호 전달 경로에 관여하는 유전자에 대한 추가적인 의문에 답하기 위해 ELISA, Western blot 및 기타 연구와 같은 다른 절차를 수행할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 안구 표면 연구 분야의 연구자들은 관심 있는 특정 환자 집단 내의 다양한 면역 세포 유형을 평가할 수 있는 길이 열렸습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 각막 세포진(impression cytology)을 수행하는 방법과 안구 표면에서 면역 세포를 분리하고 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 안구 결막에서 생존 가능한 공생 박테리아를 분리하는 면봉 기반 기술에 대해 설명합니다. 이 기술은 병원체에 대한 방어 역할을 하는 결막의 공생 박테리아 마이크로바이옴을 프로파일링하는 데 사용할 수 있습니다.

면봉 기반 결막 공생 박테리아 분리: 쥐 모델의 결막에서 공생 박테리아를 분리하는 기술

이 비디오에서는 토끼 모델에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 절차를 보여줍니다. 이 세포는 망막 퇴행성 질환에 대한 치료 전략을 개발하는 데 도움이 됩니다.

IPE 및 RPE 세포 분리: 토끼 눈에서 안구 색소 상피 세포를 얻는 기술

우리는 인간 피험자의 눈꺼풀 안쪽 가장자리의 결막에서 세포를 수집, 염색 및 이미지화했습니다. 세포 형태와 대사 활동을 특성화함으로써 이 방법은 안구 건조증에 대한 이해와 안구 표면 간의 마찰이 안구의 불편함을 인식하는 데 어떤 역할을 할 수 있는지에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

뚜껑 와이퍼 지역의 인상 세포학

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

이 프로토콜은 상대적으로 손상되지 않은 위치에서 눈꺼풀, 안구 표면, 전방 및 후방 세그먼트로 마우스 안구를 분리하는 방법을 설명합니다.

조직학적 검사 및 면역 조직화학을 위한 통합 안구 표면 조직을 얻기 위한 손상되지 않은 안구의 분리

여기에 제시 라이브 마우스 안구 표면 이미징을위한 다광 현미경 플랫폼입니다. 형광 형질 전환 마우스는 안구 표면 내의 세포 핵, 세포 막, 신경 섬유 및 모세 혈관의 시각화를 가능하게합니다. 콜라주 구조에서 파생된 비선형 제2 고조파 생성 신호는 기질 아키텍처에 대한 라벨없는 이미징을 제공합니다.

마우스 각막과 결막의 라이브 이미징을 위한 맞춤형 다광현미경 플랫폼

여기에 제시된 것은 미생물 기반 방법 및 MALDI-TOF 질량 분석법에 의한 후속 식별을 통해 독특한 눈 면봉 및 배양 기반 농축 단계를 사용하여 호기성 및 학부성 혐기성 마우스 결막 성 세균의 격리 및 증폭을 위한 프로토콜이다.

마우스의 결막 장금 격리 및 식별

여기서, 다양한 포유류(마우스, 쥐, 토끼, 돼지 및 소)로부터 일차 홍채 및 망막 색소 상피 세포를 분리하고 변형시키는 프로토콜이 제시된다. 이 방법은 전 생체 분석 및 인간에게 양도 할 수있는 생체 내 연구를위한 다양한 셋업에서 안구 유전자 치료 접근 방식을 연구하는 데 이상적입니다.

비 바이러스 유전자 치료를 위한 포유류 1차 안료 상피 세포의 격리, 배양 및 유전 공학

페놀 레드-프리/태아 무혈청 배지는 성별에 따른 차이 연구에서 결막 잔 세포의 정상적인 기능을 변경하지 않고 외인성 호르몬을 제거하기 위해 고급 RPMI보다 더 나은 옵션입니다.

In Vitro (시험관 ) 결막 잔 세포의 성별 기반 차이를 연구하는 방법

여기에서는 인간 limbal niche 세포를 분리하고 식별하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

이 기사에서는 안구건조증의 진단 및 치료에서 생체 내 공초점 현미경의 작동 및 효과를 보여주고 향후 연구의 기초를 제공하기 위해 생체 내 공초점 현미경의 적용 및 결과를 조사합니다.

생체 내 안구건조증의 진단 및 관리에서 공초점 현미경: 이미징 프로토콜 및 해석에 중점을 둡니다.

배우세요 안구 표면 질환 연구를 위한 비침습적 인상 세포학 기법으로 결막 세포를 분리하고 면역표현형 분석하는 방법입니다. 이 기술은 임상 및 실험실에서 간단하게 적용할 수 있습니다.

결막에서 세포를 분리하고 표현하기위한 비 침습적 방법

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