Name: 안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 쥐 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 쥐에서 자가면역 건성안을 유도하는 방법으로 눈물샘 추출물과 ovalbumin을 이용한 피하 면역화 및 결막하 주사를 통해 안구 질환의 임상적 특징을 재현하고 T세포 침윤을 정량화하여 치료제 효능을 평가하는 연구 모델을 탐색하세요.

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저자는 Tin Min Qi 박사와 Veluchamy Amutha Barathi 박사 팀에게 동물 치료에 대한 도움을 주신 것에 감사드립니다. 이 작품은 NHIC-I2D-1409007, SingHealth Foundation SHF / FG586P / 2014 및 NMRC / CSA / 045 / 2012에서 지원되었습니다.

동물은 기관 지침 및 안과 및 시력 연구 동물 사용을위한 ARVO 선언에 따라 처리되었습니다. 연구 프로토콜은 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 누액 샘 추출물의 제조 참고 : 쥐를 케타민 (75mg / kg)과 자일 라진 (10mg / kg)의 복강 내 주사로 마취시켰다. 적절한 마취는 발가락 협착 및 꼬리 협착에 의해 확인되었다. 안과 용 젤을 각 시술 후에 건조를 방지하기 위해 쥐의 눈에 적용 하였다. 마취 된 쥐를 원적외선 빛 아래에 두어 완전히 회복 될 때까지 동물을 따뜻하게 유지했습니다. 절차 및 회복 시간 동안, 동물들은 연구자들에 의해 면밀히 관찰되었다. 모든 재료와 수술 도구는 사용하기 전에 살균되었습니다. 실험 종료시, 쥐를 pentobarbital (80 mg / kg)의 복강 내 주사로 안락사시켰다.완전한 안락사는 안구를 만져서 심장 맥박이없고 깜박 거림이없는 것으로 확인되었습니다. 쥐를 표준 조건으로 보관 하였다 : 실온, 21-23 ℃; 상대 습도, 30-70 %; 12 시간 (오전 7시에서 오후 7 시까 지) 번갈아 가며 밝고 어두운 사이클이 반복됩니다. <ol><li> 안락사를 마친 여성 Sprague-Dawley 쥐 (8 주에서 16 주까지의 연령대)를 편평하게 놓고, 한쪽 귀는 테이블에, 다른 쪽 귀는 위로 향하게 놓습니다. 한 쌍의 스프링 가위로 노출 된 귀 밑으로 10 mm 절개를 최상으로 열도록하십시오. 주변 결합 조직과 배수관에서 그것을 분리하여 누선을 제거합니다. <ol><li> 필요할 때까지 땀샘을 -80 ° C에 보관하십시오. 얼음 위에서 땀샘을 해동하십시오. 가위로 얼음 위에서 가능한 한 가볍게 말하십시오. lacrimal 글 랜드 당 1x 프로 테아 제 억제제와 PBS 150 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 30 분 진폭으로 10 초 동안 10 초로 설정 한 초음파 분쇄기를 사용하여 20 kHz에서 5 분간 얼음 샘플을 초음파 처리합니다. 아들을 원심 분리하다.13,000 xg 및 4 ° C에서 20 분간 시료를 채취합니다. </li><li> 상층 액을 피펫으로 옮겨서 새 튜브로 옮긴다. 나누어서 1.5 ML 튜브에 뜨는 및 -80 ° C에서 그들을 저장하십시오. 제조 업체의 지침에 따라 bicinchoninic 산성 분석 22로 단백질 농도를 측정합니다. </li></ol> 2. 에멀젼 및 백일해 독소의 제조 <ol><li> 유제 <ol><li> Mycobacterium tuberculosis H37Ra 1mg / mL를 함유하는 완전 프로 인트 보조제 10mL에 열 살생 Mycobacterium tuberculosis H37Ra 40mg 을 넣고 잘 섞는다. 참고 : 최종 완전 프로 인트 보조제에는 5 mg / mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra가 포함되어 있습니다. </li><li> 오발 부민의 무게를 달아 PBS에 녹이고 2mg / mL의 오발 부민과 10mg / mL의 눈물샘 추출물이 포함 된 항원 혼합물을 준비합니다. 각 동물 당 200 μL의 주사 용량을 목표로 마스터 혼합물 b동물 번호로 ased. </li><li> 불완전 프로 인트 애쥬 번트 또는 완전 프로 인트 애쥬 번트를 50 mL 튜브에 옮겨 항원 혼합물에 대한 보조제의 양이 1 : 1 비율이되도록하십시오. 항원 혼합물을 애주 번트에 떨어 뜨려 떨어 뜨리면서 흘러 넘치지 않는 최고 속도로 vortexing하십시오. 모든 항원이 추가 된 후 5 분 동안 계속해서 볼 텍싱하십시오. </li><li> 유액을 5 mL 주사기에 옮기고 주사기 커넥터를 통해 다른 5 mL 주사기와 연결하십시오. 한 주사기에서 다른 주사기로 유제를 밀어 넣어 혼합하십시오. 참고 : 물에 넣을 때 단일 액 적이 구체로 남아 있으면 유제가 준비됩니다. 4 ° C에서 밤새 새롭게 준비된 에멀젼 또는 에멀젼 만 사용해야합니다. </li></ol></li><li> 백일해 독소 <ol><li> 100 μg / μL의 최종 농도를 만들기 위해 500 μL의 물에서 백일해 독소 50 μg을 재구성합니다. 30 초 동안 컨테이너에 Votex를 놓고 확인하십시오.옥신은 완전히 녹습니다. 참고 : 여과로 멸균하지 마십시오. 재료가 손실됩니다. 얼지 마라. 이 용액은 4 ℃에서 최소 6 개월 동안 활성 상태를 유지합니다. </li><li> PBS를 사용하여 100 ng / μL의 백일해 독소를 3 ng / μL로 희석하십시오. 희석 된 백일해 독소 100 μL를 27 G 주사 바늘이 달린 1 mL Luer-lock 주사 주사기에 옮기십시오. </li></ol></li></ol> 3. 루이스 래트의 예방 접종 <ol><li> 0 일째에, 유제를 몇 번 섞는다. 27g 주사 바늘이 달린 1mL Luer-lock 주사기에 완전 프로 인트 보조제에 1mg의 눈물샘 추출물과 200ug의 오발 부민이 들어있는 200μL의 유제를 배분합니다. 마취없이 쥐 꼬리의 기초에 피하에 유제를 주입하십시오. 참고 : 주입 전에 테일을 예열하지 않아도됩니다. 각 쥐에게 완전 프로 인트 보조제에 1mg의 눈물샘 추출물과 200μg의 오발 부민을 넣어 면역시킨다.h 500 μg의 Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> 14 일째, 0 일과 동일한 방식으로, 불완전 프로 인트 보조제에 눈꺼풀 땀샘 추출물 1mg과 오발 부민 200μg이 들어있는 200μL의 에멀젼을 주사하십시오. 100μL의 PBS에 300 ng의 복막 독소를 복강 내 주사하십시오 같은 날 래트 당. </li></ol> 4. 항원 특이 적 면역 세포를 모집하고 국소 염증을 유발하기 위해 포낭 결막과 눈물샘에 항원 혼합물을 주입 <ol><li> 실험에서 쥐의 수를 기준으로 ovalbumin과 lacrimal gland extract의 양을 계산하십시오. 필요한 양의 오발 부민을 달아 1 단계에서 준비한 해동 된 누액 샘 추출물과 혼합하여 1mg / mL의 오발 부민과 1mg / mL의 눈물샘 추출물을 함유 한 항원 용액을 만든다. </li><li> 복강 내 주사로 ketamine (75 mg / kg)과 xylazine (10 mg / kg)으로 쥐를 마취. 꼬집어 라.적절한 마취가 달성되었는지 확인하기 위해 ( 즉, 핀치 이후에 반응하는 움직임이 관찰되지 않음) 랫트를 검사한다. 눈의 forniceal 결막에 항원 5 μL를 주사. 눈물샘에 항원 20 μL를 주입하십시오. </li></ol> 5. 건성 안구 특징의 평가 주 : 5.1-5.3 단계에서 마취 된 쥐는 장갑을 낀 손으로 움직이지 않도록 평평한 표면에 똑바로 세워야합니다. <ol><li> 페놀 레드 실로 눈물량을 측정하십시오. <ol><li> 한 쌍의 포셉을 사용하여 실을 잡고 다른 한 쌍의 쥐의 아래 눈꺼풀을 당깁니다. 나사를 아래쪽 fornix의 근위 모서리에 1 분 동안 놓고 나사를 제거합니다. 참고 : 눈물은 스레드의 젖은 부분을 빨간색으로 만듭니다. </li><li> 나사 부분의 젖은 부분의 길이를 밀리미터 표시가있는 눈금자 옆에 찍습니다. 젖은 길이를 10 분의 1 o까지 측정하십시오.이미지 밀리미터 (ImageJ)와 같은 이미지 소프트웨어를 사용합니다. </li></ol></li><li> 각막 / 눈물 평활도를 측정하십시오. <ol><li> 링 조명 장치와 카메라가 장착 된 실체 현미경 아래에 쥐를 놓습니다. 쥐의 각막에 식염수 5 μL를 적용합니다. 눈꺼풀에 손가락을 대고 위와 아래 눈꺼풀을 5 번 정도 움직여 식염수를 퍼지면서 수동적으로 깜박입니다. </li><li> 반지 조명기를 각막 표면의 중간에 1.6 배 확대하여 초점을 맞 춥니 다. 10 초 후에 사진 이미지를 획득하십시오. 참고 : 링 조명기는 동물의 각막에 두 개의 원형 행의 도트 이미지를 투사합니다. 왜곡되지 않은 점들의 규칙적인 간격은 부드러운 각막 / 눈물 층을 의미합니다. </li></ol></li><li> 플루 오레 신 염색으로 각막 손상을 측정하십시오. <ol><li> 쥐의 각막에 0.2 %의 fluorescein 2 μL를 첨가하십시오. 눈가에 플루 오레 신 염료가 퍼지게하려면 장갑을 낀 손가락으로 쥐 눈꺼풀을 수동으로 3 번 열고 닫으십시오. </li><li&gt; 1 분 후 3mL 주사기 (1 회 주사 바늘을 사용하지 않음)로 1mL의 염수를 끌어 와서 주사기를 각막 앞쪽에 2-3mm 정도 위치시키고 부드럽게 눈에 식염수를 분사하십시오. </li><li> 배경 조명이 꺼진 상태에서 안구 이미징 현미경의 코발트 블루 필터 ( 즉, ~ 400 nm) 아래에서 이미지를 수집합니다. 참고 : 이미지는 이후 이전 발행물 23 에서 수정 된 채점 시스템에 의해 분석되었습니다. 0에서 2까지 녹색 점의 수, 면적 및 강도를 주관적으로 채점하여 이미지를 분석했다. 0은 결석을 나타내고 1은 50 개 미만의 점에 대한 얼룩을 나타내고 2는 50 개 이상의 얼룩점을 나타낸다. </li></ol></li><li> pentobarbital (80 MG / kg)의 intraperitoneal 주사를 통해 쥐를 안락사. 가위로 위, 아래 눈꺼풀을 제거합니다. 고정시키고, 포 셉으로 눈 주위 조직을 밀어내어 안구를 제거하십시오. 지구를 자유롭게해라.그는 외안근, 시신경 및 forniceal 결막. </li><li> 포셉과 쥐 안구의 위치를 ​​고정하고 적도를 따라 원주 절개와 함께 열어. 렌즈와 유리를 제거하십시오. 해부 된 안구를 얼음에 1.5 ML 튜브에 넣어. </li><li> 단계 1.1에서 설명한대로 눈물샘을 수집합니다. 즉시 유선 cytometry 분석을 준비하기 위해 해부 된 안구 조직과 눈물샘을 실험실로 옮기십시오. </li><li> 콜라게나 제 및 Disase II 소화 방법으로 면역 세포를 분리 24 , 25 . 안구 조직 26 에서 T 세포 subpopulation 프로 파일링 유동 세포 계측법을 사용하는 진행합니다. 참고 : 항체 패널은 항 CD45APC-Cyanine7 (OX-1), 항 CD3 BV421 (1F4), 항 CD4 PE- 시아닌 7 (OX-35), 항 CD45RC Alexa647 (OX-22) CD62 PE (HRL1), 항 CD44 FITC (OX-50) 및 생존 세포 염료 7-AAD. CD45 + CD3 <supCD3 + CD45RC + ), T 세포 (TEM , CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) 및 중앙 기억 (T CM, CD3 + CD45RC - . </li></ol>

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</ol>

저자는 아무런 이해 상충이 없다. LT는 Alcon, Allergan, Santen, Bausch and Lomb, Eyelens 및 Eyedetec으로부터 이전 자금 및 / 또는 선물을 받았습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 유제의 균질성을 확보하는 것입니다. 잘 준비된 유제에서 항원은 완전히 오일로 코팅되어 주입 된 항원의 느린 방출과 지속적인 면역 자극을 보장합니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 특징은 루이스 쥐의 사용이다. 루이스 쥐는 다른 계통보다자가 면역 질환 발병에 더 민감합니다 27 . 이 프로토콜은 눈물샘 추출물 만 사용하거나 재조합 Klk1b22 20 , 21 두 이전에 게시 된 프로토콜에서 수정되었습니다. 현재의 프로토콜에서, ovalbumin과 lacrimal gland 추출물이 항원으로 사용되며 항원 특이 적 면역 세포가 눈 표면과 눈물샘에 끌어 당겨 국소 조직 손상을 유도합니다. 건조한 눈은 초기 면역 후 48 일에 ~ 85 %까지 천천히 발달합니다. 항원에 대한 도전눈과 눈물샘은 48 일째 건조한 눈을 악화시키고 70 일까지 만성을 보장합니다. Klk 유도 DED 모델의 재조합 Klk1b22와 비교할 때, 현 모델에서 사용 된 눈물샘 추출물과 오발 부민은 저렴하고 얻기 쉽다. 눈물샘 추출물에는자가 면역을 유도 할 수있는 Klk 이외의 다른 단백질도 포함되어 있으므로 이론적으로 DEL 유도시 Klk 방법보다 더 효과적입니다. 우리는 눈물샘 추출물만을 사용하여 쥐에게 면역 접종을 시도했다. 이들 면역화 된 래트가 DED를 생성 하였지만, 대조군에 비해 안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 유의 한 증가는 없었다. 이 기술의 한계는 모델을 완성하는 데 70 일이 걸린다는 것입니다. 이펙터 메모리 T 세포는 정상 쥐의 눈에서 주요 T 세포 서브 세트입니다. 이 모델에서자가 면역 DED는 안구 내 CD3 + effector memory T 세포를 증가시킵니다. 그 마약따라서 Kv1.3 칼륨 채널의 선택적 억제제와 같이 효과가있는 기억 세포 T 세포는자가 면역 DED 28 에 치료 효과가있을 수 있습니다.

안구 건조증 (DED)은 안구 표면에 손상을 줄 수있는 불쾌감, 시각 장애 및 눈물 막 불안정성 증상을 유발하는 눈물과 안구 표면의 다원적 인 질병입니다. 그것은 눈물 막의 증가 된 삼투압과 안구 표면의 염증을 동반합니다. DED와 관련된 증상은 타는듯한 느낌, 쑤시는 느낌, 거친 느낌, 이물감, 눈물, 안구 피로 및 건조 함입니다 2 , 3 . DED의 두 가지 주요 원인은 눈물 분비 동맥에 의한 눈물 생성 감소와 눈물 막 4 의 과도한 증발입니다. Sjogren 증후군, 전신성 홍 반성 루푸스 및 류마티스 관절염과 같은자가 면역 질환 환자는 마이 보미 닉 (meibomian) 땀샘에 대한 면역 손상으로 눈물의 안정성에 필수적인 지질의 발현을 감소시킵니다. 또한, 안구 표면에 대한 면역 손상은 제품을 감소시킨다표면 습윤성에 중요한 점액의 존재. 함께이 과정들은 만성적으로 만성적 인 안구 건조증을 유발합니다 5 , 6 , 7 . 눈물 보충 및 항 염증 요법이 치료의 요점입니다. 그러나 DED ( 즉, 코르티코 스테로이드와 사이클로스포린)에 대한 현재의 항 염증 요법은 대체로 면역 억제제이며 심각한 부작용을 유발합니다 8 , 9 , 10 . 자가 면역 건조한 눈을 치료하기위한 새로운 면역 조절제를 시험하기에 적합한 동물 모델이 필요합니다. 특정 유전자 결함이있는 마우스 11 , 12 , 13 , 특정 유전자가 결핍 된 마우스 14 , 15 및 면역 반응을 과다 발현하는 형질 전환 마우스ory 유전자는자가 면역 건조한 안구 16,17의 모델로 사용되었습니다. 항원 - 유도자가 면역 동물 모델은 마우스 18 , 토끼 19 , 및 랫드 20 , 21 에서도보고되었다. 여기서는 만성자가 면역성 안구의 항원 유도 모델을 설명합니다. 이 모델은 두 개의 이전 모델을 수정 한 것입니다. 하나는 눈물샘 추출물을 사용했고 두 번째는 눈물샘 20 , 21 에서자가 항원 ( 즉, klk1b22)을 사용했습니다. 이 질병은 오발 부민, 완전 프로 인트 보조제 및 스프 라그 - 돌리 (Sprague-Dawley) 래트에서 눈물샘 추출물을 함유 한 유제 ( 그림 1 )를 가진 6 ~ 8 주령의 암컷 루이스 (Lewis) 쥐의 피하 면역화에 의해 유발되었습니다. 불완전 프로 인트 보조제에서 동일한 항원으로 두 번째 면역화2 주 후에 투여했다. 눈물샘과 안구 표면에 항원 특이 적 면역 세포를 모집하기 위해 눈샘 결막과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민 (1mg / mL)을 6 주 -7 주에 주사했다 ( 그림 1 ). 85 % 이상의 쥐가 첫 번째 예방 접종 후 70 일째에 마른 눈의 특징을 나타 냈습니다. 이러한 특징으로는 눈물 생성 감소 ( 그림 2 ), 각막의 형광 염색 증가 ( 그림 3 ), 눈물의 안정성 저하 ( 그림 4 )가 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 정상 쥐의 안구에서 T 세포의 면역 프로파일 링은 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 우세를 나타낸다 ( 도 5 및 도 6 ). 자가 면역 DED를 가진 래트는 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 증가와 순진 및 중추 성 기억 T 세포의 감소를 보여준다 ( 그림 6 </strong&gt;).

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermal Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson 및 회사는</td><td></td> Freund의 보조제 Becton, Dickinson 및 회사 231131 ovalbumin Sigma-Aldrich A5503-10G 불완전한 Freund의 보조제를 완성231141<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5506-6X10ML</td><td></td></tr><tr><td>백일해 독소&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7208-50UG</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 나트륨 용액</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics&nbsp;</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 스레드</td><td>Tianjin Jingming New Technological Development Co., LTD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>링 라이트 조명기 및 카메라가 있는 NA 스테레오 현미경</td><td>Carl Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Micro IV 현미경&nbsp;</td><td>피닉스 리서치 랩스</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

안구 조직에서 이펙터 기억 t 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

안구 건조증은 이환율과 건강 관리 부담을 초래하고 삶의 질을 저하시키는 매우 흔한 상태입니다. 자가 면역 건조한 눈 상태를 치료하기위한 신규 한 치료제를 시험하기위한 적합한 건조한 눈 동물 모델이 필요하다. 이 프로토콜은 만성자가 면역성 안구 건조 쥐 모델을 설명합니다. 루이스 래트는 눈물샘 추출물, 오발 부민 및 완전 프로 인트 보조제를 함유 한 유제로 면역화시켰다. 불완전 프로 인트 애쥬 번트에서 동일한 항원으로 2 차 면역화를 2 주 후에 실시 하였다. 이러한 면역화는 꼬리 기저부에서 피하 투여 하였다. 안구 표면과 눈물샘에서 면역 반응을 증가시키기 위해 눈물샘 밑 샘과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민을 1 차 면역 접종 6 주 후에 주입 하였다. 쥐들은 눈물 감소 생산 감소, 눈물의 안정성 감소, 각막 손상 증가와 같은 안구 건조 기능을 개발했습니다. 면역 전문가유세포 분석법에 의한 파일링은 안구 내에서 CD3 + 효과기 기억 T 세포의 우세를 보였다.

그림 1 은 실험 설계를 보여줍니다. 48 일째와 70 일째에, 건성안 임상 특징을 면역화 된 래트에서 평가한다. 눈물 부피는 페놀 레드 실의 젖은 부분의 길이로 표시됩니다. 그림 2 는 대조군과 DED 쥐의 페놀 레드 스레드의 대표 이미지를 보여줍니다. DED 그룹의 페놀 레드 스레드의 길이는 대조 그룹보다 짧아서 눈물의 양이 적음을 나타냅니다. 플루 오레 신은 손상된 각막 상피에 결합합니다. 따라서, 각막 손상은 각막의 형광 염색으로 측정됩니다. DED 쥐의 각막 표면에있는 Fluorescein spot을 0에서 2로 등급을 매기고 대조군과 비교 하였다. DED가있는 래트는 대조 쥐보다 더 많은 형광 염색을 보였으며 ( 그림 3 ), 각막 손상을 시사합니다. 각막 평활도DED 및 대조군 쥐의 경우 링 일루미네이터에 의해 평가되었다. 각막 표면이 부드럽고 눈물의 안정성이 높으면 안구 표면의 일루미네이터 링 이미지가 둥글고 완벽합니다. 이미지의 왜곡은 각막의 평활도가 낮고 불안정한 눈물 막을 나타냅니다. 링의 왜곡 정도는 0에서 2로 등급이 매겨졌다. DED 그룹에서 높은 링 왜곡 수준이 나타 났으며 ( 그림 4 ), 눈물의 안정성이 낮음을 나타냅니다. 쥐는 안구 건조증이 두 가지 이상일 때 안구 건조증으로 정의됩니다. 24 마리의 면역화 된 래트 중에서 21 마리의 래트가 48 일째에 DED를 나타내었다. 결과는 70 일째에 평가할 때 일관되었다. 유동 세포 계측법 분석은 정상 쥐의 안구 조직에서 우세한 T 세포 하위 집합이 이펙터 메모리 T 세포임을 보여줍니다 ( 그림 5 ). DED 쥐의 안구에서 CD3의 ~ 70 %+ T 세포는 이펙터 메모리 T 세포이며, 대조 쥐에서는이 수치가 ~ 50 %입니다. DED 쥐의 안구는 대조 쥐보다 현저히 높은 이펙터 기억 T 세포를 가지고있다 ( 그림 6 ). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> 그림 1 : 실험 설계도. LG : 눈물샘; DED : 안구 건조증; CFA : 완벽한 프로 인트 보조제; IFA : 불완전 프로 인트 보조제. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> 그림 2 : 페놀 레드 실은 눈물 볼륨을 측정합니다. 페놀 붉은 실을 양쪽 쥐눈의 근위 모서리에 1 분 동안 놓고 제거합니다. Representativ컨트롤과 DED 그룹 모두에서 페놀 레드 스레드의 자국 이미지가 표시됩니다. ImageJ는 페놀 레드 실의 젖은 부분의 길이를 측정하는 데 사용되었습니다. 눈금 막대 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> 그림 3 : Fluorescein 염색법으로 측정 한 각막 상피 ​​손상의 대표 이미지. 각 쥐의 각막은 1 분 동안 0.2 %의 fluorescein으로 염색되었고 최소한 1 mL의 식염수로 세척되었다. 이미지는 코발트 파란 빛을 가진 안구 이미징 현미경으로 촬영했습니다. 첫 번째 열은 각막의 대표적인 이미지를 보여줍니다. 두 번째 열은 DED 기능을 가진 쥐의 각막 염색의 대표적인 이미지를 포함합니다. 녹색 형광 반점은 각막 상피를 나타냅니다<html> l 손상. 모든 이미지는 동일한 색상으로 제작되었습니다. 형광 염색의 정량은 녹색 반점의 면적과 밀도에 따라 수행되었다. 눈금 막대 = 1mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> 그림 4 : 링 일루미네이터의 반사를 보여주는 대표적인 각막 이미지. 쥐 각막 / 눈물 평활도는 링 조명기로 측정 하였다. 캡처 된 이미지에서 링의 왜곡 정도는 상대적인 눈물의 안정성을 측정 한 것입니다. 왼쪽 열은 대조군 동물의 대표 이미지를 표시하고 오른쪽 열은 건성 안구 유도 후 대표 이미지를 보여줍니다. 눈금 막대 = 1mm.ank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> 그림 5 : 유동 세포 계측법 분석에서 도트 플롯. 안구 조직으로부터 분리 된 T 세포를 항체 패널로 염색 하였다. CD45 + CD3 + 7AAD - 개체군에서는 CD3 + 7-AAD - T 세포가 문을 열었다. CD3 + 7-AAD - T 세포 중 naive, central memory, effector memory T 세포 집단이 결정되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> 그림 6 : 안구 내 T 세포 서브 집단 프로파일. CD3 + CD45RCCD3 + CD45LC - CD44 + CD62L - 효과기 기억 T (T EM ) 세포 및 CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + 중앙 기억 T (T CM ) 세포는 CD3 + T 세포의 백분율로 표시됩니다. 결과는 3 마리의 대조군 쥐와 6 마리의 DED 랫트에서 나온 것입니다. 격리 된 눈물샘에서 T 세포를 분석 한 결과도 비슷한 결과를 얻었다 (데이터는 표시되지 않음). unpaired Student의 t-test를 통계 비교에 사용했다. 오류 막대는 SD를 나타냅니다. * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 보고서는 쥐 눈물샘 추출물, 오발 부민 및 완전 프로 인트 보조제의 유액으로 면역화하여 루이스 쥐의 만성 실험자가 면역안을 유도 한 다음, 눈물 결말과 눈물샘에 눈물샘 추출물과 오발 부민을 주사하는 방법에 대해 설명합니다 6 주 후에.

안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

이 절차의 전반적인 목표는 피하 면역화와 함께 눈물샘 추출물을 결막하 및 눈물샘 내로 주입하여 쥐에서 눈물 기능 장애와 눈물샘 염증의 임상적 특징을 유도함으로써, 자가면역성 안구 건조증 치료법을 평가하는 것입니다. 이 방법은 자가면역 질환에서 T 세포를 억제하는 약물이 효능이 있는지와 같은 안구 건조증의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 인간의 안구 건조증과 유사한 안구 질환 징후를 생성하며, 눈물샘과 눈으로 침투하는 T 세포를 정량화할 수 있다는 것입니다.이 동물 모델의 함의는 비장과 림프절을 연구할 수 있기 때문에 림프구 이동을 이해하는 방향으로 확장됩니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 작은 쥐의 눈에서 일어나는 변화를 기록하기 위한 적절한 장비가 부족하여 어려움을 겪을 수 있습니다. 마취 후 쥐의 눈이 빠르게 건조되고 깜박임이 없기 때문에 특정 단계들을 학습하기 어렵으므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.텍스트 프로토콜에 따라 암컷 Sprague Dawley 랫드를 안락사시킨 후, 한쪽 귀가 테이블에 닿고 다른 쪽 귀가 위를 향하도록 동물을 평평하게 놓습니다. 가위를 사용하여 노출된 귀 아래쪽으로 상하 10 millimeter 절개를 가합니다. 그런 다음, 주변 결합 조직 및 배출관으로부터 눈물샘을 박리하여 제거합니다.다음으로, 가위를 사용하여 얼음 위에서 조직을 가능한 한 미세하게 다집니다. 그런 다음, 눈물샘 하나당 1X protease inhibitor가 포함된 PBS 150 µL를 첨가합니다. 초음파 파쇄기를 10초 작동, 10초 정지, 진폭 30%로 설정하고, 얼음 위에서 20 kHz로 5분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.그런 다음, 초음파 처리된 시료를 13,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다. 이어서 상층액을 1.5 mL 튜브에 소분하여 -80 °C에서 보관합니다.5 mg/mL의 Mycobacterium tuberculosis H37Ra가 함유된 완전 프로인트 보조제(complete Freund's adjuvant) 또는 불완전 프로인트 보조제를 50 mL 튜브로 옮기고, 보조제와 항원 혼합물의 부피가 1:1 비율이 되도록 합니다. 2 mg/mL의 ovalbumin과 10 mg/mL의 누선 추출물이 포함된 항원 혼합물을, 용액이 튀지 않는 최대 속도로 볼텍싱하면서 보조제 용액에 한 방울씩 첨가합니다. 모든 항원을 첨가한 후 5분 동안 계속해서 볼텍싱합니다.에멀젼을 5 mL 주사기에 옮기고, 주사기 커넥터를 사용하여 다른 5 mL 주사기와 연결합니다. 그런 다음, 에멀젼을 한 주사기에서 다른 주사기로 밀어내며 혼합합니다. 0일 차에, complete Freund's adjuvant 내에 1 mg의 누선 추출물과 200 µg의 ovalbumin이 포함된 에멀젼 200 µL를 1 mL Luer lock 주사기에 분주하고, 주사기에 27 gauge 바늘을 장착합니다.마취 없이 쥐의 꼬리 기저부에 에멀젼을 피하 주사합니다. 그 후 14일째에 동일한 방식으로 불완전 프런드 보조제(incomplete Freund's adjuvant)에 희석한 동일 항원 200 microliters를 주사합니다. 같은 날, 100 microliters의 PBS에 희석한 백일해 독소(pertussis toxin) 300 nanograms를 복강 내 주사합니다.48일째에, 필요한 양의 ovalbumin을 측정하여 PBS에 녹입니다. 그런 다음, ovalbumin과 본 영상에서 앞서 준비한 해동된 누선 추출물을 혼합하여, ovalbumin 1 mg/mL 및 누선 추출물 1 mg/mL를 함유하는 항원 용액을 만듭니다. 쥐를 마취시킨 후, 항원 5 µL를 안구의 결막하궁에 주입합니다.그 다음, 20 µL의 항원을 누루샘(lacrimal gland)에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마취된 쥐를 고정한 상태에서, 페놀 레드 실(phenol red thread)을 사용하여 눈물량을 측정하기 위해 한 쌍의 핀셋으로는 실을 잡고 다른 한 쌍으로는 쥐의 하안검을 당깁니다. 실을 하안검 결막낭(lower fornix)의 내측 구석에 1분 동안 둔 후, 실을 제거합니다.그런 다음, 실을 밀리미터 표시가 있는 자 옆에 놓고, 실의 젖은 부분 길이를 촬영합니다. 각막 눈물 매끄러움을 측정하려면, 링 조명과 카메라가 장착된 실체 현미경 아래에 쥐를 배치합니다. 그런 다음, 쥐의 각막에 5 µL의 식염수를 처리합니다.장갑을 낀 손가락으로 상하 눈꺼풀을 약 5회 정도 가볍게 깜빡여 식염수를 도포합니다. 1.6배 배율에서 링 조명(ring illuminator)의 초점을 각막 표면 중앙에 맞춥니다. 그 후 10초 뒤에 사진 영상을 획득합니다.0.2% fluorescein 2 µL를 쥐의 각막에 첨가하여 형광 스캐닝으로 각막 손상 정도를 측정합니다. 장갑을 낀 손가락으로 쥐의 눈꺼풀을 세 번 부드럽게 열고 닫아 형광 염색액이 안구 표면에 고르게 퍼지도록 합니다. 1분 후, 3 mL 주입기를 사용하여 생리식염수 1 mL를 흡입합니다.그 다음, 주사기를 각막 앞쪽으로 약 2~3mm 지점에 위치시키고 눈에 식염수를 부드럽게 도포합니다. 배경 조명을 끈 상태에서, 안구 이미징 현미경의 코발트 블루 필터를 사용하여 이미지를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킨 후, 가위를 사용하여 상하 눈꺼풀을 제거합니다.외안근, 시신경 및 봉소결막을 절단하여 안구를 분리합니다. 안구를 절개하여 개방합니다. 수정체와 유리체를 제거합니다.그 후, 적출한 안구를 얼음 위에 놓인 1.5 milliliter 튜브에 넣습니다. 마지막으로, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 누선을 수집합니다. 이 그림은 대조군과 DED 쥐의 페놀 레드 스레드의 대표 이미지를 보여줍니다.DED 군의 페놀 레드 스트립 길이는 대조군보다 짧으며, 이는 눈물 양이 더 적음을 나타냅니다. 플루오레세인은 손상된 각막 상피에 결합하므로 손상 정도를 측정하는 데 사용됩니다. 본 실험에서는 DED 쥐의 각막 표면에 나타난 플루오레세인 반점을 0에서 2단계까지 등급으로 매겨 대조군 쥐와 비교하였습니다.DED가 있는 쥐는 대조군 쥐보다 플루오레신 염색 정도가 더 높으며, 이는 각막 손상을 시사합니다. 여기에서 보는 것처럼, 각막 표면이 매끄럽고 눈물 안정성이 높으면 안구 표면에 비치는 조명 링의 이미지가 둥글고 완벽합니다. 이미지의 왜곡은 각막의 매끄러움 감소와 불안정한 눈물막을 나타내며, 이는 DED 군에서 더 높은 왜곡 정도로 관찰되었습니다.이 유세포 분석 결과는 정상 쥐 안구 조직에서 주요 T 세포 하위 집단이 작동 기억 T 세포임을 보여줍니다. DED 쥐의 안구에서는 CD3 양성 T 세포의 약 70%가 작동 기억 T 세포인 반면, 대조군 쥐에서는 이 수치가 약 50%입니다. DED 쥐의 안구는 대조군 쥐보다 작동 기억 T 세포가 유의하게 더 많습니다. 이 절차 이후에 다른 종류의 면역 세포에 대한 염색을 수행하여 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.예를 들어, 선천 면역 세포나 B 림프구를 염색할 수 있습니다. 이 기술은 개발 이후 연구자들이 안구 표면 면역학을 이해하고, 나아가 인간의 안구건조증과 쇼그렌 증후군을 연구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 쥐에서 자가면역성 안구건조증을 유도하고 그 결과를 견고하게 문서화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 쥐에서 만성 실험용 자가면역 안구건조증을 유발하는 기술을 보여줍니다. 자가항원과 외부 항원을 함유한 항원 보조 에멀젼을 미리 정의된 간격으로 쥐에게 주입하면 면역된 쥐에서 동일한 항원을 안구 표면 조직에 주입하여 만성 안구 염증을 유발합니다.

쥐에서 만성 실험용 자가면역 안구 건조증을 유발하는 기술

마취제를 사용하지 않고 쥐 꼬리 바닥에 에멀젼을 피하로 주입합니다. 그런 다음 14일째에 유사한 방식으로 동일한 항원과 불완전한 Freund's Adjuvant를 200마이크로리터 주입합니다. 같은 날, PBS 100마이크로리터에 300나노그램의 백일해 독소를 복강주사합니다.

이 비디오는 자가면역 안구건조증 쥐 모델에서 눈물량을 결정하기 위한 페놀 레드 스레드 테스트를 보여줍니다. pH에 민감한 산성 페놀 레드 실은 알칼리성 눈물과 접촉하면 색이 변합니다. 페놀 레드 실의 색상 변화 길이가 짧다는 것은 눈물 부피가 감소한 것에 해당합니다.

Phenol Red Thread를 사용한 자가면역 안구건조증 쥐 모델의 눈물 부피 정량화

이 비디오는 자가면역 쥐 모델에서 각막의 평활도와 눈물막 안정성을 평가하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 안구건조증을 이해하는 데 중요한 눈물막 안정성에 대한 분비샘 기능 장애의 영향을 강조합니다.

자가면역 안구건조증 쥐 모델의 각막 및 눈물 부드러움 평가

이 비디오는 쥐 모델에서 자가면역 안구건조증의 정도를 평가하기 위해 플루오레세인 염료를 사용하여 손상된 각막을 염색하는 방법을 보여줍니다. 염색된 콜라겐 섬유의 녹색 형광 반점은 각막 상피 손상 세포를 나타냅니다.

각막 손상을 검사하기 위한 자가면역 안구건조증 쥐 모델의 플루오레세인 염색

이 기사에서는 궤도 해구 시스템의 모든 부분에 concanavalin A를 주입하여 토끼에서 급성 또는 만성 안구 건조 증을 유도하는 방법의 개발을 설명합니다. 이미 보고된 방법보다 우수한 이 방법은 약리학 적 제제의 연구에 적합한 안구 건조증의 재현 가능하고 안정적인 모델을 생성합니다.

코카나발린A에 의해 유도된 수성 결핍 안구 건조증의 토끼 모델: 약물 효능 연구에 적용

이 보고서에서 우리는 조사자가 안내 포도막염의 마우스 모델을 생성 할 수있는 프로토콜을 제시합니다. 더 일반적으로 실험적 자가면역 포도막염(EAU)이라고 하는 이 확립된 모델은 인간 질병의 여러 측면을 포착합니다. 여기에서는 여러 판독값을 사용하여 질병 진행을 유도하고 모니터링하는 방법을 설명합니다.

실험적 자가면역 포도막염: 안구내 염증성 마우스 모델

여기에서는 눈물샘 기능 장애의 쥐 모델을 확립하여 수성 결핍성 안구건조증 연구의 기초를 제공합니다.

스코폴라민에 의해 유도된 눈물샘 기능 장애가 있는 쥐 안구건조증 모델

여기에서는 안와외 및 안와하부눈물샘을 절제하여 수성 결핍성 안구건조증의 마우스 모델을 확립하고 수성 결핍성 안구건조증에서 안구 표면의 변화를 평가하는 방법을 제시합니다.

수성 결핍성 안구건조증 Mouse Model 구축

배우세요 쥐에서 자가면역 건성안을 유도하는 방법으로 눈물샘 추출물과 ovalbumin을 이용한 피하 면역화 및 결막하 주사를 통해 안구 질환의 임상적 특징을 재현하고 T세포 침윤을 정량화하여 치료제 효능을 평가하는 연구 모델을 탐색하세요.

안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

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