안구 조직에서 이펙터 기억 T 세포의 증가를 동반 한 만성자가 면역 건식 ​​쥐 모델

이 절차의 전반적인 목표는 자가면역 안구건조증의 치료법 평가를 위해 눈물샘 추출물의 피하 면역 및 결막하 및 눈물샘 내 주사를 사용하여 쥐에서 눈물샘 염증의 임상적 특징을 유도하는 것입니다. 이 방법은 자가면역 질환에서 T 세포를 억제하는 약물이 효과적인지 여부와 같은 안구 건조증의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 인간의 안구 건조증과 유사한 안구 질환의 징후를 생성하고 눈물샘과 눈에 침투하는 T 세포를 정량화한다는 것입니다.

이 동물 모델의 함의는 비장과 림프절을 연구할 수 있기 때문에 림프구 이동을 이해하는 데까지 확장됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 작은 쥐 눈의 변화를 문서화하기 위한 적절한 기기가 없기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 쥐의 눈이 빠르게 건조되고 마취 후 깜박임이 없기 때문에 특정 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 암컷 Sprague Dawley 쥐를 안락사시킨 후, 한쪽 귀는 테이블에 대고 다른 쪽 귀는 위를 향하도록 동물을 평평하게 놓습니다. 가위를 사용하여 노출된 귀 아래 상하로 10mm 절개를 만듭니다. 그런 다음 주변 결합 조직과 배액관에서 눈물샘을 절개하여 제거합니다.

그런 다음 가위를 사용하여 얼음 위에서 조직을 가능한 한 곱게 다집니다. 그런 다음 눈물샘당 1X 프로테아제 억제제가 포함된 PBS 150마이크로리터를 추가합니다. 초음파 처리기를 10초 켜짐, 10초 꺼짐, 30% 진폭으로 설정하고 20킬로헤르츠의 얼음 위에서 5분 동안 샘플을 초음파 처리합니다.

그런 다음, 초음파 처리 된 샘플을 13, 000 회 g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심 분리하십시오. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 상등액을 1.5 밀리리터 튜브로 분취하고 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

Mycobacterium tuberculosis H37Ra 1ml당 5mg이 함유된 완전한 Freund's adjuvant 또는 incomplete Freund's adjuvant를 50ml 튜브로 옮겨 항원 혼합물에 대한 보조제의 부피가 1:1 비율이 되도록 합니다. 밀리리터 오브알부민 2밀리그램과 눈물샘 추출물 밀리리터당 10밀리그램을 함유한 항원 혼합물을 보조 용액에 한 방울 한 방울 첨가하면서 유출을 일으키지 않는 최고 속도로 와류를 일으킵니다. 모든 항원이 추가된 후 5분 동안 계속 소용돌이합니다.

에멀젼을 5ml 주사기로 옮기고 주사기 커넥터를 사용하여 다른 5ml 주사기와 연결합니다. 그런 다음 한 주사기에서 다른 주사기로 에멀젼을 밀어 혼합합니다. 0일차에 완전한 Freund's adjuvant에 1mg의 눈물샘 추출물과 200μg의 오브알부민이 포함된 200마이크로리터의 에멀젼을 1mL Luer Lock 주사기에 분배하고 주사기에 27게이지 바늘을 장착합니다.

마취제를 사용하지 않고 쥐 꼬리 바닥에 에멀젼을 피하로 주입합니다. 그런 다음 14일째에 유사한 방식으로 동일한 항원 200마이크로리터를 불완전한 프로인트 보조제에 주입합니다. 같은 날, PBS 100마이크로리터에 300나노그램의 백일해 독소를 복강주사합니다.

48일째에 필요한 양의 오브알부민의 무게를 측정하고 PBS에 용해시킵니다. 그런 다음 오브알부민과 이 비디오의 앞부분에서 준비한 해동된 눈물샘 추출물을 결합하여 오브알부민 1밀리리터당 1밀리그램과 눈물샘 추출물 1밀리리터를 포함하는 항원 용액을 만듭니다. 쥐를 마취시킨 후 눈의 결막하부에 5마이크로리터의 항원을 주입합니다.

그런 다음 20마이크로리터의 항원을 눈물샘에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마취된 쥐를 안고 있는 동안 페놀 레드 실로 눈물 볼륨을 측정하려면 한 쌍의 집게를 사용하여 실을 잡고 다른 한 쌍을 사용하여 쥐의 아래쪽 눈꺼풀을 당깁니다. 실을 아래쪽 fornix의 근위 모서리에 1분 동안 놓고 실을 제거합니다.

그런 다음 밀리미터 표시가 있는 눈금자 옆에 실을 놓고 실의 젖은 부분의 길이를 이미지로 촬영합니다. 각막의 부드러움을 측정하려면 링 조명기와 카메라가 장착된 실체 현미경 아래에 쥐를 놓습니다. 그런 다음 5마이크로리터의 식염수를 쥐의 각막에 바른다.

장갑을 낀 손가락으로 위 눈꺼풀과 아래 눈꺼풀을 약 5회 움직여 식염수를 펴 바르면서 수동적으로 깜박입니다. 1.6배 배율 이하에서는 링 조명기를 각막 표면의 중앙에 집중시킵니다. 그런 다음 10초 후에 사진 이미지를 획득합니다.

플루오레세인 스캔을 사용하여 쥐 각막에 0.2%플루오레세인 2마이크로리터를 첨가하여 각막 손상을 측정합니다. 장갑을 낀 손가락으로 쥐의 눈꺼풀을 수동적으로 세 번 열고 닫아 플루오레세인 염료를 눈 표면에 펴 바릅니다. 1분 후 3ml 주사기를 사용하여 1ml의 식염수를 추출합니다.

그런 다음 주사기를 각막에서 약 2-3mm 앞에 놓고 식염수를 눈에 부드럽게 바릅니다. 배경 조명을 끈 상태에서 안구 이미징 현미경의 코발트 블루 필터 아래에서 이미지를 획득합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 쥐를 안락사 한 후 가위를 사용하여 위 눈꺼풀과 아래 눈꺼풀을 제거하십시오.

안구 외 근육, 시신경 및 결막을 절단하여 지구를 자유롭게 하십시오. 안구를 펴기 위해 절개합니다. 유리체에서 렌즈를 제거합니다.

그런 다음 절개된 안구를 얼음 위의 1.5ml 튜브에 넣습니다. 마지막으로, 이 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 눈물샘을 수집합니다. 이 그림은 대조군과 DED 쥐의 페놀 레드 실의 대표적인 이미지를 보여줍니다.

DED 그룹의 페놀 레드 스레드 길이는 대조군보다 짧아 인열 부피가 적음을 나타냅니다. 플루오레세인은 손상된 각막 상피에 결합하므로 손상 정도를 측정하는 데 사용됩니다. 이 실험에서는 DED 쥐의 각막 표면에 있는 플루오레세인 반점을 0에서 2까지 등급이 매겨져 대조군 쥐와 비교했습니다.

안구건조증이 있는 쥐는 대조군 쥐보다 플루오레세인 염색이 더 많은데, 이는 각막 손상을 시사합니다. 여기에서 볼 수 있듯이 각막 표면이 매끄럽고 인열 안정성이 높으면 안구 표면의 조명 링 이미지가 둥글고 완벽합니다. 이미지의 왜곡은 각막의 평활도가 감소하고 눈물막이 불안정함을 나타내며, DED 그룹에서 더 높은 왜곡 정도가 관찰되었습니다.

이 유세포 분석 분석은 정상 쥐 안구 조직에서 우세한 T 세포 하위 집합이 effector memory T 세포임을 보여줍니다. DED 쥐의 안구에서는 CD3 양성 T 세포의 약 70%가 효과기 기억 T 세포인 반면, 대조군 쥐의 안구에서는 이 수치가 약 50%입니다. 이 절차에 따라 다른 종류의 면역 세포에 대한 염색을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

예를 들어, 선천성 면역 세포나 B 림프구를 염색할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 안구 표면 면역학을 이해하고 더 나아가 인간의 안구 건조증과 쇼그렌 증후군을 연구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐에서 자가면역 안구 건조증을 유발하는 방법과 결과에 대한 강력한 문서화를 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.