전압 클램프 형광 측정법 Xenopus 형광성 비 자연 아미노산을 이용한 난 모세포

이 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난모세포에서 발현된 막 단백질에 형광 비천연 아미노산을 도입하고 전압 클램프 형광 측정을 사용하여 단백질의 기능과 구조적 재배열을 동시에 결정하는 것입니다. 이 기술은 막 단백질의 구조 기능 관계 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 전압 클램프 형광 측정법을 사용하여 구조적 재배열과 단백질 기능을 직접 연관시킬 수 있습니다.

여기에 형광 비천연 아미노산 표지를 추가하면 표지에 대한 이전의 한계를 극복하는 데 도움이 됩니다. 이것은 한때 라벨링 부위의 접근성뿐만 아니라 내인성 결합 부위로 인한 배경 라벨링이었습니다. 이 기술의 의미는 이전에 기존의 전압 클램프 형광 측정법으로 접근할 수 없었던 도메인을 이제 프로브할 수 있기 때문에 막 단백질에 대한 더 나은 생물물리학적 이해로 확장됩니다.

제노푸스 난모세포를 외과적으로 제거한 후 SOS 용액으로 난모세포를 세 번 세척합니다. 크고 건강한 난모세포를 개별적으로 선택하여 주사 전에 항생제와 5% 호스 혈청이 보충된 Barth의 용액에서 섭씨 18도에서 최소 4시간 동안 배양합니다. DNA의 핵 주입을 위해서는 난모세포를 손상시키지 않고 핵에 도달할 수 있도록 길고 얇은 주입 팁을 준비합니다.

그런 다음 주입 팁에 오일을 채우고 주입 팁을 나노 주입기 장치에 장착합니다. 그런 다음 실체 현미경 아래에 나노 인젝터를 설치하고 집게로 팁 끝을 부러뜨립니다. 그런 다음 팁 끝 부분에 기포가 갇히지 않을 때까지 오일을 배출합니다.

그런 다음 마이크로리터 pAnap당 0.1마이크로그램의 1마이크로리터를 스테레오스코프 아래의 파라필름 조각에 뉴클레아제가 없는 물에 넣고 주입 팁에 DNA를 채웁니다. 그런 다음 난모세포를 항생제가 보충된 Barth's solution이 들어 있는 그물망이 들어있는 주사 접시로 옮깁니다. 난모세포핵은 동물극에 위치하므로 주입 팁을 동물극의 중심에 조준하고 팁이 동물 반구의 중심 근처에 도달하도록 꿰뚫습니다.

다음으로, 9.2나노리터의 pAnap 용액을 각 난모세포의 핵에 주입합니다. 그 후, 항생제와 5% 호스 혈청이 보충된 Barth's 용액 2ml에 난모세포를 섭씨 18도에서 6-24시간 동안 배양하여 Anap-특이적 tRNA 및 tRNA 합성효소의 강력한 발현을 허용합니다. 이제 나노 인젝터를 다시 준비하되 이번에는 주입 팁이 DNA 주입 용만큼 얇을 필요가 없습니다.

Anap의 광표백을 방지하기 위해 이 시점부터 적색광에서만 작업하십시오. 1마이크로리터의 1밀리몰 Anap과 마이크로리터 mRNA당 1-2마이크로그램의 1마이크로리터를 파라필름 조각에 직접 혼합하고 주입 팁에 혼합 용액을 채웁니다. 멤브레인 바로 아래의 식물 기둥에 팁을 찔러넣고 각 pAnap이 주입된 난모세포에 46나노리터의 혼합 용액을 주입합니다.

그런 다음 난모세포를 빛이 새지 않는 상자에 넣거나 플라스크를 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오. 항생제와 5% 호스 세럼이 보충된 Barth의 용액에서 섭씨 18도에서 2-3일 동안 배양합니다. 매일 새로운 Barth's 용액으로 교체하고 오염을 방지하기 위해 죽은 난모세포를 제거하십시오.

이 설정에서는 cut-open 전압 클램프 장비가 형광 현미경 설정에 통합됩니다. 기록 챔버는 슬라이더에 설치되어 난모세포를 배치하기 위한 표준 입체경과 형광 측정을 수행하기 위한 현미경 사이를 이동할 수 있습니다. 포토다이오드 검출 시스템은 형광 현미경의 C-마운트 출구 포트에 연결되고 광전류 판독은 디지털 신호 프로세서의 두 번째 입력 채널에 연결됩니다.

100와트, 12볼트 할로겐 램프는 형광 여기를 위한 광원으로 사용됩니다. 여기(excitation)는 여기 광원(excitation light source)과 현미경 사이의 기계식 셔터(mechanical shutter)에 의해 제어됩니다. 활성화는 레코딩 소프트웨어에서 시간이 지정된 디지털 신호 프로세서에서 나오는 TTL 펄스를 통해 트리거되어 레코딩 시작 약 100밀리초 전에 셔터가 열리고 필터 큐브 터렛에 적절한 필터 큐브가 필요합니다.

2색 VCF의 경우, 준비된 난모세포를 5마이크로몰 TMR 말레이미드에 넣어 기록 직전 15분 동안 라벨링 용액에 배양합니다. 그런 다음 라벨링 용액으로 난모세포를 세 번 세척하여 기록하기 전에 과도한 염료를 제거합니다. 이 시점에서 단백질은 두 개의 서로 다른 형광단으로 특이적으로 표지됩니다.

난모세포 장착 후 동물 기둥이 위쪽을 향하고 투과화된 상태에서 챔버를 현미경으로 밀고 4X 대물렌즈를 사용하여 난모세포에 초점을 맞춥니다. 다음으로, 전압 감지 V1 전극으로 난모세포를 찔러넣습니다. 그런 다음 40X 침수 목표로 전환합니다.

위쪽을 향하고 있는 동물 기둥에 초점을 맞춥니다. 그런 다음 빨간불을 끕니다. 필터 큐브 터렛과 포토다이오드에 연결된 광학 출력 포트를 돌려 Anap 필터 큐브를 선택합니다.

그런 다음 할로겐 램프를 가장 높은 강도로 켜고 셔터를 2-5초 동안 열어 난모세포에서 발생하는 배경 형광 강도를 읽습니다. 그 후, cl을 켜십시오.amp, 수조/가드 스위치를 활성으로 전환하고 헤드의 손잡이를 돌려 멤브레인 전위를 명령 전위로 조정합니다.tage. 그런 다음 기록 소프트웨어에서 유지 전위, 단계 프로토콜, 수 및 펄스 길이를 선택합니다.

그런 다음 전압 종속 전류와 Anap 형광 강도를 기록합니다. 2색 VCF의 경우 큐브 터렛을 돌려 TMR 필터 큐브를 선택합니다. Anap에 대해 설명된 대로 TMR에 대한 배경 형광을 읽고 전압 종속 전류와 TMR 형광 강도를 동시에 기록합니다.

이 그림은 Shaker 돌연변이를 발현하는 동일한 난모세포에서 얻은 단계 프로토콜을 사용하여 Anap 및 TMR 형광 신호를 표시합니다. 외부 용액에서 액세스할 수 있는 시스테인을 L382 stop W434F 백그라운드에 추가하고 TMR maleimide로 표시하면 동일한 단백질의 다른 영역에서 실시간 움직임을 동시에 조사할 수 있습니다. 형광 전압 관계는 전압에 대한 정상 상태 형광 강도를 플로팅하여 얻습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 형광 비천연 아미노산을 Xenopus 난모세포로 표현하는 방법과 1색 또는 2색 전압 클램프 형광 측정을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 기존의 전기생리학 실험과 거의 같은 시간이 소요되며, 난모세포의 핵에 DNA를 주입하는 추가 단계만 거치면 됩니다. 이 절차를 시도할 때 부자연스러운 아미노산이 없는 경우 누출 발현을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이것은 모든 돌연변이에 대해 수행되어야 하는데, 누출 발현의 양은 단백질 내 정지 코돈의 삽입 부위에 따라 달라지기 때문입니다. 이 기술을 통해 연구자들은 많은 조절 메커니즘이 발생하는 단백질의 세포질 부위에서 구조적 변화를 연구할 수 있습니다.