전압 클램프 형광 측정법

본 절차의 전반적인 목표는 Xenopus 난모세포에서 발현된 막 단백질에 형광 비천연 아미노산을 도입하고, 전압 클램프 형광 측정법(voltage-clamp fluorometry)을 사용하여 단백질의 기능과 구조적 재배열을 동시에 결정하는 것입니다. 이 기술은 막 단백질의 구조-기능 관계 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 것입니다. 전압 클램프 형광 측정법을 통해 구조적 재배열과 단백질 기능 사이의 직접적인 상관관계를 분석할 수 있습니다.

여기에 형광 비천연 아미노산 표지를 추가하면 기존 표지법의 한계를 극복하는 데 도움이 됩니다. 이전의 한계는 표지 부위의 접근성 문제와 내인성 결합 부위로 인한 배경 표지였습니다. 이 기술의 함의는 막 단백질에 대한 더 나은 생물물리학적 이해로 확장되는데, 이는 기존의 전압 고정 형광 분석법으로는 접근할 수 없었던 도메인을 이제 탐색할 수 있기 때문입니다.

Xenopus 난모세포를 외과적으로 제거한 후, SOS 용액으로 난모세포를 3회 세척하십시오. 크고 건강한 난모세포를 개별적으로 선택하여, 주입 전 항생제와 5% horse serum이 첨가된 Barth 용액에서 18 °C로 최소 4시간 동안 배양하십시오. DNA를 핵 내로 주입하려면, 난모세포를 손상시키지 않고 핵에 도달할 수 있도록 길고 가는 주입 팁을 준비하십시오.

그 다음, 주입 팁을 오일로 채우고, 나노인젝터 장치에 주입 팁을 장착합니다. 이어서, 실체 현미경 아래에 나노인젝터를 설치하고 포셉으로 팁의 끝부분을 부러뜨립니다. 그 후, 팁 끝부분 내부에 기포가 남지 않을 때까지 오일을 배출합니다.

그 후, 실체현미경 하에서 Parafilm 조각 위에 nuclease-free water에 희석된 0.1 µg/µL pAnap 1 µL를 분주하고, 주사 팁에 DNA를 채웁니다. 그런 다음, 항생제가 첨가된 Barth's solution이 들어 있는 메쉬 포함 주입 디쉬로 난모세포를 옮깁니다. 난모세포의 핵은 동물극에 위치하므로, 주사 팁을 동물극의 중심을 향하게 하고 팁이 동물반구의 중심 근처까지 도달하도록 찌릅니다.

다음으로, 9.2 nanoliters의 pAnap 용액을 각 난세포의 핵에 주입합니다. 그 후, Anap 특이적 tRNA 및 tRNA 합성효소의 강력한 발현을 위해 항생제와 5% horse serum이 첨가된 2 milliliters의 Barth's solution에서 18 degrees Celsius로 6~24시간 동안 난세포를 배양합니다. 이제 나노인젝터를 다시 준비하되, 이번에는 주입 팁이 DNA 주입 때만큼 가늘 필요는 없습니다.

Anap의 광퇴색을 방지하기 위해 이 시점부터는 적색광 하에서만 작업하십시오. 1 mM Anap 1 µL와 1~2 µg/µL mRNA 1 µL를 Parafilm 조각 위에서 직접 혼합하고, 주입 팁에 이 혼합 용액을 채우십시오. 팁을 세포막 바로 아래의 식물극에 찌르고, 각 pAnap 주입 난자에 혼합 용액 46 nL를 주입하십시오.

그런 다음, 난모세포를 차광 박스에 넣거나 플라스크를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 항생제와 5% horse serum이 첨가된 Barth's solution에서 18 °C로 2~3일 동안 배양합니다. 매일 신선한 Barth's solution으로 교체하고, 오염을 방지하기 위해 죽은 난모세포를 제거합니다.

본 설정에서는 절개형 전압-클램프 장비가 형광 현미경 설정에 통합되어 있습니다. 기록 챔버는 슬라이더 위에 설치되어 있어, 난자를 배치하기 위한 표준 실체 현미경과 형광 측정을 수행하기 위한 현미경 사이를 이동할 수 있습니다. 포토다이오드 검출 시스템이 형광 현미경의 C-마운트 출력 포트에 연결되어 있으며, 광전류 판독 값은 디지털 신호 처리기의 두 번째 입력 채널에 연결되어 있습니다.

형광 여기를 위한 광원으로 100W, 12V 할로겐 램프가 사용됩니다. 여기광은 여기 광원과 현미경 사이에 위치한 기계적 셔터에 의해 제어됩니다. 활성화는 디지털 신호 처리기에서 오는 TTL 펄스를 통해 트리거되며, 기록 소프트웨어에서 타이밍을 설정하여 기록 시작 약 100 milliseconds 전에 셔터가 열리도록 하고, 필터 큐브 터렛에 적절한 필터 큐브가 장착되어 있어야 합니다.

2색 VCF를 위해, 기록 직전에 준비된 난자를 라벨링 용액에 희석한 5 µM TMR maleimide에서 15분 동안 배양하십시오. 그 후, 기록 전 라벨링 용액으로 난자를 3회 세척하여 과잉 염료를 제거하십시오. 이 단계에서 단백질은 두 가지 서로 다른 형광체로 특이적으로 라벨링됩니다.

난모세포를 마운팅한 후, 동물극이 위를 향하게 하고 투과성을 부여한 상태에서 챔버를 현미경으로 밀어 넣고 4X 대물렌즈를 사용하여 난모세포에 초점을 맞춥니다. 다음으로, 전압 감지 V1 전극으로 난모세포를 관통시킵니다. 그 후, 40X 수침 대물렌즈로 교체합니다.

위쪽을 향하고 있는 동물극에 초점을 맞춥니다. 그 후 적색광을 끕니다. 필터 큐브 터렛과 포토다이오드에 연결된 광학 출력 포트를 돌려 Anap 필터 큐브를 선택합니다.

그 후, 할로겐 램프를 최고 강도로 켜고 셔터를 2~5초 동안 열어 난모세포에서 발생하는 배경 형광 강도를 측정합니다. 다음으로 클램프를 켜고 배스/가드(bath/guard) 스위치를 활성(active) 상태로 전환한 뒤, 헤드스테이지의 노브를 돌려 막 전위를 명령 전위로 조정합니다. 이어서 기록 소프트웨어에서 유지 전위, 스텝 프로토콜, 펄스 횟수 및 길이를 선택합니다.

그런 다음, 전압 의존적 전류와 Anap 형광 강도를 기록합니다. 2색 VCF의 경우, 큐브 터렛을 돌려 TMR 필터 큐브를 선택합니다. Anap에서 설명한 것과 동일하게 TMR의 배경 형광을 측정하고, 전압 의존적 전류와 TMR 형광 강도를 동시에 기록합니다.

이 그림은 Shaker 돌연변이를 발현하는 동일한 난모세포에서 단계별 프로토콜을 사용하여 얻은 Anap 및 TMR 형광 신호를 보여줍니다. L382 stop W434F 배경에 외부 용액에서 접근 가능한 시스테인을 추가하고 이를 TMR maleimide로 라벨링함으로써, 동일한 단백질의 서로 다른 영역에서 일어나는 실시간 움직임을 동시에 탐색할 수 있습니다. 전압에 따른 정상 상태 형광 강도를 도식화하여 형광 전압 관계를 얻습니다.

이 영상을 시청한 후, Xenopus 난자에 형광 비천연 아미노산을 발현시키는 방법과 단색 또는 이색 전압 고정 형광 측정법(voltage-clamp fluorometry)을 수행하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 전통적인 전기생리학 실험과 거의 동일한 시간이 소요되며, 다만 난자의 핵에 DNA를 주입하는 추가 단계가 필요할 뿐입니다. 이 절차를 시도할 때는 비천연 아미노산이 없는 상태에서 누출 발현(leak expression)이 있는지 확인하는 것이 중요합니다.

단백질 내 스톱 코돈의 삽입 위치에 따라 누출 발현(leak expression) 정도가 달라지므로, 모든 돌연변이에 대해 이 작업을 수행해야 합니다. 이제 이 기술을 통해 연구자들은 많은 조절 메커니즘이 일어나는 단백질의 세포질 부위에서 발생하는 구조적 변화를 연구할 수 있습니다.