신경 근육 질환의 마우스 모델에서 호흡 근육 활동 및 환기의 반복 측정

본 절차의 전반적인 목표는 질병의 진행 과정 동안 호흡근 활동과 환기량을 반복적으로 측정하는 것입니다. 선택된 근육에 근전도 리드를 삽입한 텔레메트리 장치를 외과적으로 이식한 후 측정을 진행합니다. 이 방법은 질병이나 부상으로 인해 횡격막 기능이 손상되었을 때 보조 호흡근이 어떻게 이를 보완하는지에 대한 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 질병 진행 과정 전반에 걸쳐 자유롭게 행동하는 동일한 생쥐에서 환기와 호흡근 활동을 측정할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 ALS의 진단 및 치료에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며, 다른 신경근 질환 또는 척수 손상 모델에도 적용될 수 있습니다. 먼저 EMG 전극을 준비하십시오.

전선 처리 전용 가위를 사용하여 원위부 리드선을 다듬어, 표적 근육에 도달할 수 있도록 리드선 길이가 약 3cm가 되게 합니다. 그다음 메스를 사용하여 전선 자체를 자르지 않도록 주의하며 플라스틱 피복의 0.5cm 부분을 제거합니다. 이어서 전선 처리 도구를 사용하여 리드선의 끝부분을 원래 길이의 4~5배로 늘려줍니다.

리드선의 노출된 전선 부분을 0.5 centimeters 길이로 자릅니다. 그다음, 이전에 제거한 플라스틱 케이싱에서 0.25 centimeter 길이의 튜브를 잘라 전선 끝을 덮을 리드 캡을 준비합니다. 마우스에 마취제를 투여한 후, 발가락 꼬집기와 꼬리 꼬집기를 통해 반응이 없는지 확인하여 마우스가 완전히 마취되었는지 확인합니다.

그 후 마우스를 수술 준비대로 옮기고, 수술 중 마취 상태를 유지하기 위해 노즈 콘(nose cone)을 장착합니다. 수술 중 안구가 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과용 윤활 연고를 바릅니다. 회복 과정에서 마우스가 리드선을 뽑거나 긁어서 상처를 낼 가능성을 줄이기 위해 수술 부위와 같은 쪽(동측)의 발톱을 깎습니다.

귀와 어깨 사이의 수술 부위가 드러나도록 마우스의 털을 깎습니다. 그런 다음 수술 부위를 소독제와 이소프로판올로 번갈아 닦아냅니다. 이식 절차를 시작하려면 앞다리를 같은 쪽 발 방향으로 당겨 견갑골을 미측으로 이동시켜 사각근과 승모근에 접근할 수 있도록 합니다.

둔단형 곡선 핀셋을 사용하여 수술 부위와 같은 쪽의 앞발을 고정하고, 테이프로 발을 고정합니다. 새 수술용 장갑을 착용한 후, 메스를 사용하여 어깨와 귀 사이를 2cm 길이로 사선 절개합니다. 그 다음 양손에 층판절제술용 핀셋을 하나씩 잡고, 지방 패드를 뒤로 당긴 후 승모근과 광경근을 벌려 흉쇄유돌근과 사각근을 덮고 있는 근막을 노출시킵니다.

창백한 색의 흉쇄유돌근과 횡격막신경을 지표로 삼아 사각근을 식별하십시오. 횡격막신경은 사각근과 평행하게 주행하며, 흉쇄유돌근은 그 아래쪽에 위치한다는 점에 유의하십시오. 사각근은 승모근 아래에서 경추로부터 갈비뼈까지 비스듬하게 주행합니다.

생체 전위 전극을 횡격막 신경(phrenic nerve)에 인접하여 주행하는 근육으로 식별 가능한 전사각근(anterior scalene muscle)에 삽입합니다. 다음으로, 조직 분리 가위의 끝을 마우스의 피부 아래로 삽입하고, 송신기 너비보다 약간 더 큰 포켓이 형성될 때까지 가위를 벌려 송신기가 들어갈 포켓을 만듭니다. 따뜻한 멸균 식염수로 포켓 내부를 세척합니다.

그런 다음 평평한 면이 근육을 향하도록 송신기를 삽입합니다. 송신기가 평평하게 놓이고 전선이 꼬이지 않고 서로 평행하게 포켓 밖으로 나오도록 배치합니다. 송신기로부터 사각근과 승모근까지 리드를 연결하여, 두 세트의 생체 전위 리드가 서로 평행하게 평평이 놓이도록 합니다.

다음으로 척추후궁절제술용 포셉(laminectomy forceps)을 사용하여 전사각근을 주변 근육으로부터 분리합니다. 그런 다음 25-gauge 바늘을 근섬유에 수직이 되도록 사각근에 삽입합니다. 바늘 끝으로 리드(lead) 하나를 삽입한 후, 와이어의 절연 부위까지 리드가 근육 내에 남도록 바늘을 근육에서 뽑아냅니다.

어떤 색상의 리드가 어느 근육에 삽입되었는지 기록하십시오. 리드에 접착제를 쉽게 도포할 수 있도록 21게이지 바늘에 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 묻힙니다. 그런 다음, 리드가 삽입된 근육 근처의 노출된 와이어 끝부분에 접착제를 도포하십시오.

리드 캡을 전선 위로 빠르게 밀어 넣어 리드 캡과 근육 사이에 전선이 노출되지 않도록 합니다. 캡의 원위 쪽에 남은 과잉 전선을 절단하고, 리드 캡과 전선의 끝부분에 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 도포합니다. 고정 장치를 풀기 전에 접착제가 중합될 때까지 충분한 시간을 둡니다.

다음으로 동일한 근육에 첫 번째 리드와 평행하게 반대 극성 리드를 동일한 방식으로 삽입합니다. 이 리드는 첫 번째 리드에서 1~2mm 떨어진 곳에 위치해야 합니다. 여기에 표시된 것과 같이 사각근 바로 앞에 위치한 승모근에 리드를 삽입하는 절차를 반복합니다.

다음으로 와이어 리드가 제자리에 고정되었는지 확인하고, 동물이 리드를 잡아당기지 않고 신체 움직임을 수행할 수 있을 만큼 리드에 충분한 여유가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 전지(forelimb)를 고정하고 있는 테이프를 조심스럽게 제거하십시오. 지방 패드를 근육 위로 다시 당겨 삽입된 리드를 덮어줍니다.

다음으로 피부 플랩을 서로 당겨 절개선이 일치하도록 맞춥니다. 곡선 핀셋으로 피부 플랩의 일부를 함께 집고, 이 라인을 따라 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 도포합니다. 동물이 여전히 마취 상태일 때 수술 후 통증을 완화하기 위해 carprofen 0.1 milliliters를 피하 주사합니다.

동물을 노즈콘에서 꺼내어, 동물이 깨어나 케이지 안을 자발적으로 움직일 때까지 미리 가온된 인큐베이터 내의 깨끗한 케이지에 둡니다. EMG 및 플레티스모그래피 기록 전, 마우스가 적응할 수 있도록 플레티스모그래피 챔버에 최소 1시간 동안 둡니다. 기록 시작 전이며 캘리브레이션 이후에, 이식된 동물의 1인치 이내에 강력한 자석을 배치하여 송신기를 켭니다.

수신기 전면의 빨간색 표시등을 통해 송신기의 전원 켜짐 상태를 확인할 수 있습니다. Acquisition(획득)이라고 표시된 드롭다운 메뉴를 사용하여 Acquisition 시작(Start Acquisition)을 선택하고 데이터 수집을 시작하십시오. 기록 시간은 실험에 따라 다를 수 있으나, 일반적으로 체적 측정(plethysmography) 및 EMG 기록은 1~3시간 동안 지속됩니다.

데이터 수집이 완료되면 자석을 사용하여 송신기를 끄고 동물을 홈 케이지로 복귀시킵니다. 다음은 생후 98일 차의 증상 발현 전 SOD-1(G93A) 마우스에서 측정한 사각근과 승모근의 WBP 및 EMG 트레이스입니다. 동물이 휴식 중인 기간이 분석에 사용됩니다.

빨간색 상자는 증상 발현 전 쥐의 특징인 EMG burst(전기생리학적 폭발)가 없는 휴식기 EMG 트레이스를 보여줍니다. 빨간색 상자 외부의 트레이스는 동물이 움직일 때 전형적으로 나타나는 plethysmography 트레이스, 근육 활동 및 EMG 트레이스의 크고 불규칙한 피크를 보여줍니다. 이 이미지는 생후 126일째의 증상이 나타난 SOD-1(G93A) 쥐의 승모근에서 측정된 WBP 및 EMG 트레이스를 보여주며, 쥐가 휴식 중임에도 EMG burst가 관찰됩니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 35분 이내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 통해, 이식된 동물 모델을 이용하여 질병이나 부상 모델에서 보조 호흡근 활성을 강화하는 약물의 효능을 평가할 수 있습니다.