만성 외상성 뇌증 모델링을위한 새로운 방법 Drosophila

이 새로운 절차의 전반적인 목표는 초파리(Drosophila)에 폐쇄성 외상성 뇌 손상을 입혀 새로운 만성 외상성 뇌병증 모델을 확립하는 것입니다. 이 방법은 반복적인 외상이 어떻게 뉴런 퇴행을 유발하는지와 같은 만성 외상성 뇌병증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 동물의 몸체의 다른 부분에 손상을 주지 않고 조정 가능한 강도의 반복적인 충격을 플라이 헤드에 직접 전달한다는 것입니다.

이 방법의 실제 시연은 초파리 머리가 너무 작고 머리에만 충격을 가하는 것이 중요하기 때문에 장치 조립 및 파리 로딩 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 초파리를 진동시키거나 때리기 위하여 이용되는 기구를 만들기 위하여는, 첫째로, 기구의 충격기 부분을 만드십시오. 1ml 폴리카보네이트 투베르쿨린 주사기에서 플런저를 제거한 다음 1ml 표시에서 배럴을 자릅니다.

임팩터의 경우 200마이크로리터 피펫 팁에 있는 에어로졸 장벽을 사용하십시오. 이 임팩터는 길이가 3mm, 직경이 4mm여야 합니다. 그런 다음 평평한 면이 노즐을 향하도록 하여 임팩터를 주사기 배럴에 포장합니다.

힘을 주려면 주사기 배럴을 이산화탄소 흐름 조절기에 부착하십시오. 레귤레이터에는 On Off 토글 스위치가 있어야 하며 가스 유량을 잘 제어해야 합니다. 그런 다음 배럴을 철제 스탠드에 수직으로 고정하여 임팩터가 배럴 바닥으로 떨어지도록 합니다.

다음으로 플라이 홀더를 만듭니다. 200마이크로리터 피펫 팁으로 시작하십시오. 피펫 끝을 작은 끝에서 5mm 잘라 직경 8mm의 구멍을 만듭니다.

파리 머리는 이 구멍에 맞지만 흉부는 맞지 않습니다. 마지막으로 플라이 홀더와 임팩터 장치용 A를 만듭니다. 먼저 작은 구멍에서 1mm 길이의 1mm 피펫 팁을 44mm 자릅니다.

둘째, 바늘 덮개에서 6mm 길이를 잘라 1ml 주사기를 만듭니다. 그런 다음 두 가지를 함께 밀어 넣습니다. 이산화탄소를 사용하여 생후 2일 된 성인 암컷 파리를 마취합니다.

이산화탄소 패드에서 가는 브러시를 사용하여 플라이를 홀더에 부드럽게 옮깁니다. 그런 다음 머리가 끝에서 튀어나올 때까지 홀더를 부드럽게 두드립니다. 주둥이가 노출되어 있으면 뭉툭한 1ml 주사기 바늘을 사용하여 주사기 끝 부분에 부드럽게 밀어 넣습니다.

플라이 바디, 특히 입 부분을 홀더 내부에 유지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 파리가 내부 장기를 손상시키거나 음식을 섭취할 수 없어 죽을 수 있습니다. 그런 다음 가스 압력을 100킬로파스칼로 설정하고 필요에 따라 흐름을 조정합니다.

플라이가 로드되면 플라이 헤드가 아래를 향하도록 커넥터를 사용하여 홀더를 주사기 배럴에 조입니다. 그런 다음 토글 스위치를 사용하여 임팩터를 움직이는 가스 폭발을 보내 파리를 한 번만 공격합니다. 이제 플라이 홀더를 분리하고 플라이를 이산화탄소 패드에 다시 버립니다.

파리가 회복될 때까지 빈 유리병에 파리를 솔질합니다. 바이알당 플라이 1마리를 보관합니다. 복구에는 몇 분 밖에 걸리지 않습니다.

이 과정을 반복하여 실험 그룹당 4마리의 파리를 테스트합니다. 테스트와 가짜의 두 그룹을 처리하는 데 20-30분 밖에 걸리지 않습니다. 충격기 튜브에 에어로졸 장벽을 포함하지 않는 것을 제외하고는 가짜를 실험 동물처럼 취급하십시오.

페트리 접시에서 파리의 움직임을 추적하려면 먼저 6cm 접시에 투명 실리콘 엘라스토머를 채워 추적 경기장을 만듭니다. 실리콘과 뚜껑 사이에 3mm의 간격을 두어 파리가 그 틈새를 자유롭게 걸을 수 있지만 날아갈 수는 없도록 합니다. 추적 경기장 아래에는 흰색 배경이 있습니다.

다음으로, 같은 치료 그룹의 파리 4마리를 마취하고 투기장에 놓습니다. 파리가 경기장에 한 시간 동안 적응하도록 하면 조명이 완전히 켜져 있고 섭씨 약 22도여야 합니다. 실온보다 뜨겁지 않습니다.

한 시간 후, 경기장 위에 위치한 전하 결합 장치 카메라를 사용하여 5분 동안 파리의 활동을 기록합니다. 5분 녹음 후 경기장의 파리를 마취하고 새 가정용 유리병에 다시 넣습니다. 그런 다음 경기장을 처분하십시오.

나중에 무료로 사용할 수 있는 Ctrax 소프트웨어를 사용하여 녹음을 분석합니다. 이 소프트웨어는 추적 데이터를 생성하며, 이 데이터는 MATLAB 형식과 같은 프로그래밍 가능한 언어 호환 형식으로 내보낼 수 있습니다. 데이터에서 프레임당 이동한 거리, 각 플라이의 평균 도보 거리, 플라이당 이동한 평균 거리를 계산합니다.

통계적 유의성을 위해 치료 그룹당 약 100마리의 파리를 검사할 것으로 예상됩니다. 만성 외상성 뇌병증 모델을 확립하기 위해, 서로 다른 속도에서 충격을 가하는 장치에 의해 만들어진 단일 폐쇄 머리 손상의 효과를 2일 된 Canton-S 암컷을 사용하여 분석했습니다. 가스 압력은 100킬로파스칼로 유지되었습니다.

테스트된 가장 높은 유속으로 한 번의 타격에 노출된 파리는 최소한의 외부 결함을 나타냈습니다. 외부 손상에 대한 명확한 증거는 없었음에도 불구하고, 분당 15리터의 유속으로 인한 부상은 급성으로 치명적이었으며, 24시간 이내에 생존율이 10% 미만이었습니다. 유속이 낮을수록 생존율이 증가했습니다.

분당 5리터 이하에서 100% 생존이 달성되었기 때문에 분당 5리터를 모델의 표준으로 선택했습니다. 파리는 공격을 받은 직후 4분 이내에 점차 기동성을 회복했습니다. 샴의 회복 시간은 1분 정도 빨랐다.

충돌 후 비디오 지원 이동 추적은 기관차 기능을 측정하는 데 사용되었습니다. 충돌 후 이틀 동안 운동은 서서히 정상으로 돌아왔다. 점진적인 회복에 대한 이러한 증거는 인간의 CTE 회복과 일치합니다.

장기적인 영향을 평가하기 위해 5일 동안 5회 타격하는 반복적인 외상성 뇌 손상 프로토콜이 적용되었습니다. 치료 후 20일 후, 각 그룹에서 생존한 구성원의 이동을 비교한 결과 치료받은 그룹은 분명히 덜 걸었습니다. 치료군의 수명도 상당히 감소했는데, 중앙값은 26일로 대조군의 37일에 비해

개발 후, 이 기술은 경미한 반복성 외상성 뇌 손상 분야의 연구자들이 고전적인 동물 모델인 Drosophila melanogaster에서 병원성 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 코, 흉부 및 복부를 에어로졸 장벽의 직접적인 충격으로부터 보호하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.