꿀벌을위한 억제 성 화학 물질을 차단하는 비디오 추적 프로토콜

이 실험 절차의 전반적인 목표는 꿀벌에 대한 화학적 기피제를 평가하는 것입니다. 이 방법은 어떤 화학 물질이 꿀벌의 행동을 조절하여 먹이원으로부터 멀어지게 하는지와 같은 곤충학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 꿀벌에 대한 화학적 기피제를 비교적 빠르고 쉽게 스크리닝할 수 있는 간단한 접근 방식을 제공한다는 점입니다.

대조군 처리를 위한 설탕-아가로스 큐브를 준비하려면, 반냉각된 설탕-아가로스 용액을 웨이 보트 몰드에 붓습니다. 기피제 처리를 위해서는 반냉각된 아가로스 용액에 원하는 양의 화합물을 첨가합니다. 본 시연에서는 1% DEET 최종 농도를 사용합니다.

플라스크를 흔들어 화합물을 혼합한 다음, 용액을 무게 측정용 보트 몰드에 붓습니다. 설탕-아가로스 큐브가 냉각되면, 응고된 큐브를 몰드에서 꺼내 젖은 페이퍼 타월이 들어 있는 플라스틱 용기에 넣습니다. 용기를 냉장고에 넣어 보관합니다.

트래킹 소프트웨어에서 화면 왼쪽에 위치한 실험 탐색기 바의 실험 설정으로 이동하십시오. 올바른 카메라가 선택되었는지, 그리고 비디오 녹화 화면이 페트리 접시 아레나 중심에 맞춰져 있는지 확인하십시오. 비디오 녹화 화면의 중심을 맞추어야 하는 경우, 카메라 설정의 관심 영역(area of interest) 제어 항목으로 들어가서 Center X 및 Center Y 옵션을 선택하십시오.

실험 설정(experiment settings)에서 아레나 수를 16으로 변경하십시오. 추적 기능(tracked features)에서 중심점 검출(center point detection)을 선택하십시오. 그런 다음 아레나 설정(arena settings)을 선택하여 분석에 필요한 아레나를 구성하십시오.

16개의 페트리 접시를 카메라 아래에 배치된 라이트 박스 위에 4x4 패턴으로 놓습니다. 아레나 설정에서 오른쪽 도구 패널에 있는 배경 캡처 버튼을 사용하여 16개 페트리 접시의 사진을 찍습니다. 이 사진은 아레나 설정을 위한 템플릿으로 사용됩니다.

아레나 설정 화면 상단의 툴바에서 타원 생성(create ellipse)을 선택하고, 캡처된 이미지 속 페트리 접시 중 하나의 직경과 일치하는 원을 그립니다. 아레나 1 마커를 원 안에 배치하십시오. 그런 다음 오른쪽 도구 패널의 아레나 1 아래에 위치한 존 그룹 1(zone group one)을 선택하십시오.

화면 상단 툴바에서 rectangle(사각형) 생성을 선택하십시오. 이 도구를 사용하여 30 by 30 pixel 크기의 정사각형을 만듭니다. 그런 다음 이전 단계에서 생성한 원의 중심에 배치하십시오.

상단 툴바에서 add zone을 선택한 다음 사각형 중앙을 클릭하십시오. 영역을 한 칸 이동시켜 사각형 안에 위치하도록 합니다. 그다음, 오른쪽 도구 패널에서 arena one을 선택하고 duplicate complete arena를 클릭하십시오.

드롭다운 메뉴에서 다른 모든 아레나를 선택한 후 확인(OK)을 클릭하십시오. 복제된 아레나 설정을 캡처된 이미지의 나머지 페트리 접시로 이동시키십시오. 그런 다음 아레나 1을 선택하고 상단 툴바에서 스케일 보정(calibrate scale)을 선택하십시오. 아레나 1 페트리 접시의 직경을 가로질러 보정선을 그리십시오.

지름 측정값을 9 cm로 변경하십시오. 우측 도구 패널에서 arena settings(아레나 설정) 검증을 선택하십시오. 다음으로, 좌측 제어 바에서 detection settings(검출 설정)를 선택하십시오.

검출 설정 1을 선택한 다음, 우측 도구 상자에 있는 드롭다운 메뉴에서 그레이스케일(gray scaling)을 선택합니다. 검출(detection) 항목에서 범위를 0에서 83으로 설정하십시오. 검출 설정을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 '검출 설정 2'라는 이름의 새로운 설정을 만듭니다.

그레이스케일(gray scaling)이 계속 선택되어 있는지 확인하되, 다른 파라미터는 변경하지 마십시오. 실험 탐색기(experimental explorer)에서 시험 목록(trial list)을 선택하고 상단 도구 모음에서 변수 추가(add variable)를 클릭하십시오. 사용자 정의 변수 이름을 Treatment로 지정하십시오.

사용자 정의 처리 열에서 사전 정의 값 드롭다운 바를 선택하고 대조군과 처리군을 사전 정의 값으로 추가하십시오. 상단 도구 모음에 있는 시험 추가 버튼을 클릭하여 두 개의 시험을 추가하십시오. 그런 다음 각 아레나에 대해 대조군 아레나인지 또는 처리군 아레나인지 선택하십시오.

다음으로, 실험 탐색기(experiment explorer) 패널에서 데이터 프로필(data profile)을 선택하십시오. 왼쪽 열의 사용자 정의 독립 변수(user defined independent variables) 항목 아래에 있는 처리(treatment)를 선택하십시오. 그러면 플로우차트가 있는 영역에 필터 상자가 추가됩니다.

팝업 상자에서 C를 선택한 다음, 새로 생성된 필터를 시작 상자와 결과 상자 사이에 배치하십시오. 플로우차트 화살표는 시작 상자에서 필터로, 그리고 최종적으로 결과 상자로 향하도록 조정되어야 합니다. 이 단계를 반복하되, 이번에는 필터로 T를 선택하고 공통 요소 섹션에서 result를 선택하십시오.

새로 생성한 상자들을 플로우차트 영역으로 이동시키고 화살표로 상자들을 연결한 후 파일을 저장하십시오. 비주얼 트래킹 프로그램을 실행하고 이 분석을 위해 생성된 저장된 실험 파일을 엽니다. 검출 설정 2를 선택하십시오.

그런 다음 16개의 페트리 접시 중 8개의 중심에 대조군 설탕-아가로스 큐브를 넣습니다. 나머지 8개의 접시에는 설탕-아가로스 화합물 큐브를 사용하여 동일한 과정을 반복합니다. 핀셋을 사용하여 플라스틱 상자에서 꿀벌 한 마리를 꺼내 대조군 페트리 접시 중 하나에 넣습니다.

나머지 15개의 페트리 접시에 대해 이 단계를 반복하십시오. 모든 접시를 라이트박스 위에 놓습니다. 적색 스펙트럼으로 설정된 LED 조명 배열로 라이트박스의 하단을 비추고, 각 페트리 접시의 아레나 영역에 아레나 검출 영역이 맞도록 배치하십시오.

외부 빛을 차단하고 아레나 내부의 그림자를 줄이기 위해 박스와 카메라 전체를 검은색 플라스틱 시트로 둘러쌉니다. 페트리 접시 배치가 완료되면, detection settings one이 선택된 설정인지 확인하십시오. 이 시점에서 시각적 추적 소프트웨어는 페트리 접시 아레나 내의 꿀벌만을 인식해야 합니다.

그런 다음 실험 탐색기(experiment explorer)에서 데이터 수집(acquisition)을 선택하십시오. 오른쪽에 있는 데이터 수집 제어 팝업창의 녹색 '시작(start trial)' 버튼을 눌러 기록을 시작합니다. 분석을 10분 동안 진행한 후, 데이터 수집 제어 팝업창의 빨간색 '중지(stop trial)' 버튼을 클릭하여 기록을 중단하십시오.

개별 꿀벌의 섭식 행동에 미치는 DEET의 영향에 대한 대표적인 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 대조군 큐브에 노출된 개체들은 섭식 구역에서 평균 343초를 보낸 반면, DEET가 포함된 큐브에 노출된 개체들은 16초를 보냈습니다. 여기 두 가지 서로 다른 화합물이 개별 꿀벌의 섭식 행동에 미치는 영향에 대한 대표적인 결과가 제시되어 있습니다.

비기피 화합물에 노출된 개체들은 feeding zone에서 평균 282초를 보냈으며, 이는 약 352초를 보낸 대조군과 대비됩니다. 기피 화합물에 노출된 경우, 개체들이 feeding zone에서 머무는 시간은 약 23초로 현저히 감소했습니다. 이는 평균 493초를 보낸 대조군과 비교한 결과입니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 20분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 모든 준비물을 미리 갖추고 꿀벌을 충분한 시간 동안 굶기는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면 비디오 추적 소프트웨어를 사용하여 먹이원에 주입된 화합물이 개별 꿀벌에 미치는 영향을 결정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 절차 이후, 화합물이 군집 수준에 미치는 영향에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 근접장 및 야외 분석(near field and field assays)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다. 개발 이후, 이 기술은 곤충학 분야의 연구자들이 새로운 화학 물질과 그것이 꿀벌의 먹이 활동 행동에 미치는 영향을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 화합물을 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 개인 보호 장구를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.