Zebrafish 개발에 급성 신부전 모델링을위한 정확한 세포 제거 방법

본 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬(Zebrafish)의 신장 상피 세포에 표적 절제를 유도하여 신단위(nephron) 손상 및 회복 모델을 구축하는 것입니다. 이 방법은 장기 재생, 특히 신장 재생 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 재생에 관여하는 주요 세포 과정은 무엇인지, 생존 조직의 가소성 범위는 어느 정도인지 등 다양한 질문들을 다룰 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 손상 부위의 정밀한 시공간적 제어가 가능하며 손상 정도를 조절할 수 있다는 점입니다. 이 기술은 신장 세포의 손상 및 재생에 관여하는 세포 및 분자 과정에 대한 정밀한 시공간적 평가를 가능하게 하므로, 급성 신손상의 치료나 진단으로 응용 범위가 확장될 수 있습니다. 먼저, kidney GFP 형광 제브라피시를 교배하여 배아를 생성하십시오.

수정 후 24시간 동안 배아를 28.5 degree celsius의 E3 용액에 보관하십시오. 그 다음, E3 배지를 0.003%PTU가 포함된 E3 용액으로 교체하십시오. 배아를 인큐베이터에 넣고 6일 이상 배양하면 신장이 성숙하게 됩니다.

제브라피쉬의 실시간 이미징을 위한 매핑을 위해, 0.2 mg/mL trigaine 용액이 포함된 1%~2% 저융점 아가로스를 준비합니다. 플라스틱 또는 유리 피펫을 사용하여 배아를 용액으로 옮기기 전에 아가로스 trigaine 용액이 식었는지 확인하십시오. 그다음, 전송 피펫을 사용하여 아가로스 내의 유생을 흡입한 후 35 mm 디쉬의 중앙에 배치합니다.

제브라피시가 포함된 아가로스를 빠르게 펴서 디쉬 바닥을 고르게 덮습니다. 그다음 유리 프로브를 사용하여 광절제 및 이미징을 위해 유충의 방향을 잡는데, 이때 관심 있는 신장 분절이 빔 경로에 수직이 되도록 하고 반대편 분절은 레이저 빔에서 떨어지도록 합니다. 제브라피시의 방향 설정은 레이저 절제와 관련된 이후 단계에서 매우 중요합니다.

유충이 아가로스 내에서 수직 상태를 유지하도록 하는 것이 권장되는 좋은 방법입니다. 증발을 최소화하기 위해 페트리 접시를 덮고 아가로스가 약 15분 동안 응고되도록 둡니다. 텍스트 프로토콜에 따라 정립형 구성으로 공초점 현미경 설정을 완료한 후, 유충이 들어 있는 페트리 접시를 현미경 슬라이드 위에 놓고 모델링 클레이를 사용하여 고정합니다.

다음으로, 슬라이딩 페트리 접시를 현미경 스테이지 위에 배치합니다. 그런 다음, 이미징 용액 3 mL를 추가합니다. 워터 디핑 렌즈 하에서 스테이지를 천천히 올려, 빔 경로에 공기가 갇히지 않도록 렌즈가 약간 기울어지게 합니다.

렌즈가 일정 각도로 용액에 닿으면, 배아가 시야 중심에 오도록 조정하십시오. 이제 형광 광원을 사용하여 관심 영역의 세그먼트를 찾은 다음, 손상을 입힐 표면 분지(superficial branch)에 초점을 맞추십시오. 빛 산란을 최소화하기 위해 표면 분지를 선택합니다.

현미경 소프트웨어에서 view, acquisition control, C2plus compact GUI로 이동합니다. 픽셀 체류 시간(pixel dwell time)을 1.9 microseconds로, 프레임 크기를 512 by 512 pixels로, 핀홀 크기를 90 microns로 설정합니다. 405 nanometer 레이저 강도는 0으로, 488 레이저 강도는 낮은 값으로 설정하십시오.

488 nanometer 레이저를 사용하는 동안 소프트웨어 인터페이스에서 scan을 클릭하십시오. 빔 경로와 수직이며 GFP 형광이 잘 시각화되어 나타나는 관심 분절을 찾으십시오. 해당 영역이 확인되면 ROI로 이동하여 elliptic ROI를 선택해 관심 영역을 그리십시오.

다음으로, view, acquisition controls, C2plus scan area로 이동하여 band scan area를 선택하면 해당 인터페이스 내에 직사각형 마스크가 나타납니다. 커서를 사용하여 레이저 절제(laser ablation) 대상 세그먼트를 포함하도록 직사각형 스캔 영역을 수동으로 지정하십시오. 마스크 영역 내에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 선택 사항을 적용합니다.

488 nm 레이저만을 사용하여 GFP를 활성화하고, 녹색 채널을 모니터링하면서 시간 측정을 시작합니다. 488 레이저의 강도가 상대적으로 낮게 설정되었는지 확인하십시오. 'measure'에서 'time measurement'를 선택하여 관심 영역 내 GFP의 평균 강도를 측정합니다.

그래프 또는 데이터 탭을 사용하여 ROI 내의 평균 강도 수준을 모니터링하십시오. 보라색 레이저를 사용하여 레이저 출력 제어 바를 오른쪽 끝까지 밀어 강도를 100%로 높임으로써 신장 세포에 손상을 유도하십시오. 그래프 탭에서 선 그래프를 관찰하거나 데이터 탭을 사용하여 GFP 강도의 수치를 확인하고, 강도가 원하는 수준까지 떨어질 때까지 기다리십시오.

예를 들어, 기저선의 50%가 될 때까지 기다립니다. 타원형 ROI 내의 GFP 강도가 원하는 수준으로 떨어지면, 소프트웨어 제어 패널에서 레이저 출력 슬라이더를 왼쪽 끝까지 이동하여 보라색 레이저의 강도를 즉시 0으로 낮춥니다. 마지막으로, 새로운 GFP 형광 기저선을 측정합니다.

이 그림에서 보는 바와 같이, 405 nanometer 레이저 광선에 노출된 후 GFP 형광이 세포 하나씩 계속해서 사라집니다. 220 minutes가 되면 절제된 분절 전체의 GFP 양성 반응이 100% 소실됩니다. 이는 GFP 발현의 하향 조절이 아니라 세포 사멸로 인한 것이며, 이는 GFP 양성 반응을 잃은 세포에서 적색 형광 propidium iodide 양성 핵이 나타나는 것을 통해 확인할 수 있습니다.

이 이미지들은 초기 노출량을 조절함으로써 손상 정도와 손상된 상피의 반응을 정밀하게 제어할 수 있음을 보여줍니다. 초기 GFP 광탈색(photo bleaching) 정도가 10%에서 20%인 경우, 손상 후 5시간 시점에서 GFP 양성률의 감소가 거의 관찰되지 않습니다. 50% 및 60%의 광탈색은 5시간 후 GFP의 완전한 소실로 이어지는 반면, 30% 및 40%의 광탈색은 중간 정도의 결과를 보이며, 약 35%의 광탈색에서 추정 사망률 50%가 관찰됩니다.

이는 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide) 염색으로 뒷받침되며, 20% 광퇴색(photo bleaching)의 경우 절제 100분 후 프로피듐 아이오다이드 염색이 거의 나타나지 않습니다. 그러나 50% 광퇴색은 절제된 상피에서 60분 후부터 지속적인 프로피듐 아이오다이드 양성 반응을 유도합니다. 반면 30% 및 40% 광퇴색은 중간 정도의 프로피듐 아이오다이드 유입으로 이어집니다.

이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 30분 이내에 완료할 수 있습니다. 레이저와 화학 시약을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 레이저 빔을 직접 바라보지 않는 것과 화학 물질 취급 시 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 이 절차를 수행하는 동안 항상 준수해야 함을 잊지 마십시오. 이 절차 이후에는 세포 및 분자 수준에서 신장 손상 및 회복을 분석하기 위한 추가적인 질문에 답하기 위해 타임랩스 현미경 관찰, 면역형광 염색 및 기타 방법들을 수행할 수 있습니다.

이 기술은 개발 이후 신장 재생 분야 연구자들에게 새로운 길을 열어주었습니다. 제브라피쉬의 손상 후 집단 세포 이동과 신장 복구의 역할을 탐구하고자 합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 공초점 현미경을 사용하여 GFP 형질전환 제브라피쉬 유생 및 배아의 특정 신장 분절에 손상을 입히는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.