고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

이 실험 절차의 전체적인 목표는 효모 세포 내의 미세소관 역학을 측정하는 것입니다. 이 방법은 미세소관 및 미세소관 조절 인자의 돌연변이가 살아있는 세포 내에서 미세소관 역학을 어떻게 조절하는지와 같은 미세소관 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 효모 세포를 이미지 상에서 안정화할 수 있다는 점입니다.

대신에, 10분 동안의 높은 시간 해상도 또는 수 시간 동안의 낮은 시간 해상도를 선택합니다. 절차 시연은 본 연구실의 두 대학원생인 Colby Fees와 Cassi Estrem이 맡아 진행하겠습니다. 본 실험에 사용된 효모 세포는 GFP가 표지된 tubulin을 상시 발현하도록 제작되었습니다.

플레이트 상의 단일 콜로니에서 효모 세포 약 1 µL를 취해 3 mL의 합성 완전 배지(synthetic complete medium)에 접종합니다. 30 °C에서 250 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 포화된 배양액을 배지 내에서 OD600이 0.1 미만이 되도록 희석합니다.

희석된 배양액을 30 °C 진탕 배양기에 넣고 3~4시간 동안, 또는 OD600 수치가 0.4에서 0.8 사이가 될 때까지 배양합니다. 가로 4인치, 세로 7인치 크기로 파라핀 필름 시트를 잘라 유체 챔버 슬라이드 준비를 시작합니다. 표준 현미경 슬라이드를 파라핀 필름의 4인치 너비 방향으로 길게 놓은 다음, 슬라이드가 3~4겹 두께의 필름으로 덮이도록 필름을 슬라이드 주변으로 3~4번 감쌉니다.

층들을 함께 눌러 적절하게 밀봉되었는지 확인하되, 너무 세게 누르거나 필름에 주름이 생기지 않도록 주의하십시오. 깨끗한 커터 칼날과 직선 가이드 역할을 할 다른 슬라이드를 사용하여, 슬라이드의 바깥쪽 가장자리를 따라 파라핀 필름을 자릅니다. 작업 슬라이드에서 남은 필름을 벗겨내어 폐기하십시오.

두 번째 슬라이드를 직선 가이드로 사용하여, 겹쳐진 필름 층을 슬라이드의 장축을 따라 너비 약 2~4 mm의 스트립 10개로 자릅니다. 다음으로, 겹쳐진 파라핀 필름 층을 이전 절단면과 수직이 되도록 슬라이드의 단축을 따라 잘라, 너비 2~4 mm, 길이 23~24 mm, 두께 3~4층의 스트립을 만듭니다. 면도날을 45도 각도로 사용하여 절단된 필름 스트립을 떼어냅니다.

그다음 핀셋을 사용하여 절단된 스트립을 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 고르게 배치하여 원하는 수의 챔버를 만듭니다. 본 예시에서는 4개의 필름 스트립을 사용하여 3개의 챔버를 만듭니다. 필름 스트립 위에 커버슬립 한 장을 덮고, 핀셋으로 위치를 조정합니다.

준비된 슬라이드를 커버슬립이 위로 오도록 하여 약 95 °C로 설정된 핫플레이트 위에 올리고, 필름 스트립이 반투명해질 때까지 약 3분 동안 가열합니다. 핀셋을 사용하여 파라핀 필름 스트립 바로 위에 있는 커버슬립 부위를 부드럽게 눌러 슬라이드와 커버슬립을 함께 밀봉합니다. 포셉을 사용하여 슬라이드를 핫플레이트에서 제거하고, 커버슬립 면이 위를 향하도록 놓아 식힙니다.

슬라이드가 식으면서 필름은 다시 흰색의 불투명한 색상으로 돌아갑니다. 이 절차를 시작하려면, 냉동 보관된 200 µL의 Concanavalin A 분주액을 실온에서 해동하십시오. 준비된 슬라이드의 열려 있는 끝단 중 하나로 피펫팅하여, 각 챔버에 해동된 Concanavalin A를 약 100 µL씩 첨가하십시오.

그 다음, Concanavalin A가 커버슬립에 부착될 수 있도록 슬라이드를 커버슬립이 아래로 향하게 하여 두 개의 마이크로 튜브 랙 사이에 5분 동안 매달아 둡니다. 슬라이드를 다시 커버슬립이 위로 향하는 위치로 돌려놓고, 합성 완전 배지로 챔버를 세척하여 Concanavalin A를 제거합니다. 페이퍼 타월의 모서리를 사용하여 챔버의 한쪽 끝에서 액체를 끌어내는 동시에 다른 쪽 끝으로 신선한 액체를 피펫팅하여, 챔버 부피의 2배에 해당하는 배지를 챔버에 흐르게 합니다.

지향성 흐름법을 사용하여 챔버 부피의 2배에 해당하는 세포 현탁액을 흘려보내 세포를 로딩합니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 슬라이드를 커버슬립이 아래로 향하게 하여 10분 동안 매달아 둡니다. 합성 완전 배지를 챔버 부피의 4배만큼 흘려보내 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다.

종이 타월의 깨끗한 모서리를 사용하여 챔버의 각 끝부분을 조심스럽게 닦아내고, 메니스커스가 커버 슬립의 가장자리에 오도록 합니다. 따뜻한 실란트로 챔버의 각 끝을 밀봉합니다. 이미지 획득은 1.45 NA 100X CFI Plan Apo 대물렌즈, 피에조 스테이지, 스피닝 디스크 공초점 스캐닝 유닛, 조명 레이저 및 EMCCD 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 수행합니다.

이미지 획득 과정 동안 스테이지 온도를 실온으로 유지하십시오. 세포의 초점을 맞추고 슬라이드 내에서 세포들이 군집을 이룬 곳을 찾아, 획득 영역의 동일한 초점 평면에 최소 5~6개의 세포가 함께 모여 있는지 확인하십시오. 시간에 따라 여러 zSeries를 수집할 수 있도록 다차원 획득 설정을 프로그래밍하십시오.

활성 획득 설정 내의 설정을 다음과 같이 조정하십시오: 효모 세포 전체를 포함하도록 총 Z 깊이는 6 µm로, 오버샘플링 없이 빛 수집을 최대화하도록 Z 단계 크기는 300 nm로, 총 시간 기간은 10분으로, zSeries 간 시간 간격은 4초로, 그리고 각 Z 평면의 노출 시간은 90 ms로 설정합니다. Run을 클릭하여 획득을 시작하고, 10분 전체 기간 동안 실행되도록 둡니다. 데이터는 이미지 시리즈로 저장되며, 타임랩스 이미징의 결과 예시가 여기에 표시됩니다.

ImageJ를 실행하고 획득한 이미지 스택을 컨트롤 패널로 직접 드래그하여 이미지 분석을 시작합니다. Bio-formats 가져오기가 자동으로 시작됩니다. 이미지 스택을 하이퍼스택(hyperstack)으로 로드하려면 "Okay"를 선택하십시오.

ZProject 함수를 사용하여 각 zSeries를 최대 강도 2차원 투영으로 통합합니다. Process 메뉴, Filter 하위 메뉴에서 Median 기능을 선택하여 이미지 스택에 미디언 필터를 적용함으로써 스펙클 노이즈를 감소시킵니다. 반경 상자에 2.0 pixels를 입력하고 확인을 누릅니다. 시야 내의 pre-NFA 세포를 식별합니다.

이들은 중간 크기의 출아 세포와 약 1~1.5 µm 길이의 짧은 유사분열 방추사로 특징지어집니다. 이미지 시리즈의 첫 번째 시점부터 시작하여, 분절선 도구를 사용하여 성상 미세소관과 더 강하게 표지된 방추사 미세소관 사이의 접합부에 위치한 지점부터 세포질에 있는 플러스(+) 말단까지 단일 성상 미세소관을 따라 선을 그립니다. 미세소관의 끝부분을 더블 클릭하여 분절선을 완성합니다.

키보드의 M 버튼을 눌러 측정 기능을 사용하여 결과 표에 측정값을 기록합니다. 모든 시점에 대한 측정이 완료되면, 결과 표의 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 "다른 이름으로 저장"을 선택하여 데이터를 선택합니다. 이 그래픽은 야생형 세포와 이전에 더 안정적인 미세소관을 가진 것으로 나타난 돌연변이 균주의 성상 미세소관 역동성 시계열을 보여줍니다.

미세소관 길이를 시각화하기 위해 GFP가 태그된 alpha tubulin으로 미세소관을 라벨링하였습니다. 빨간색 화살표는 성상 미세소관의 전체 길이를 나타내며, 화살표 머리는 플러스(+) 끝단을 의미합니다. 8분 동안 각 시점마다 미세소관 길이를 측정하였으며, 이렇게 수집된 길이는 생존 곡선(life plots)에 표시되었습니다.

녹색 점은 중합을 나타내며, 분홍색 점은 탈중합을 나타냅니다. 카타스트로피(Catastrophe) 이벤트는 화살표 머리로 표시되었습니다. 이 그래프들은 돌연변이체의 미세소관이 야생형 미세소관보다 더 길고, 카타스트로피 발생 빈도가 더 낮음을 보여줍니다.

또한, 미세소관 길이의 상승 및 하강 기울기로부터 결정된 중합 및 탈중합 속도는 야생형에 비해 변이체에서 감소하였습니다. 미세소관 역학 측정 결과, 변이체 세포 내의 미세소관은 야생형보다 동역학성이 감소한 것으로 나타났습니다. 슬라이드 준비, 세포 로딩 및 이미지 획득 과정에 숙달되면 30분 이내에 수행할 수 있으며, 이는 하루에 많은 다양한 샘플의 이미지를 촬영할 수 있음을 의미합니다.

슬라이드 챔버는 Concanavalin A를 첨가하기 전에 미리 제작하여 보관할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단순 슬라이드 챔버에서 효모 세포를 안정화하고, 4차원으로 이미징하며, 살아있는 세포 내의 미세소관 역학을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미세소관 외에도, 이 절차를 수정하여 초 단위에서 시간 단위까지의 시간 범위에 걸쳐 살아있는 효모 세포 내 다른 형광 표지 단백질의 역학을 측정할 수 있습니다.