고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

이 절차의 전반적인 목표는 효모 세포의 미세소관 역학을 측정하는 것입니다. 이 방법은 세뇨관 및 미세소관 조절자의 돌연변이가 살아있는 세포의 미세소관 역학을 조절하는 방법과 같은 미세소관 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 효모 세포가 이미지에서 안정화된다는 것입니다.

오히려, 10분 동안의 높은 시간 해상도 또는 몇 시간 동안의 낮은 시간 해상도입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Colby Fees와 제 연구실의 대학원생 두 명인 Cassi Estrem입니다. 이 실험에 사용된 효모 세포는 GFP 표지 튜불린을 구성적으로 발현하도록 구성되었습니다.

단일 콜로니에서 약 1마이크로리터의 효모 세포를 3ml의 합성 완전 배지 플레이트에 접종합니다. 세포가 섭씨 30도에서 250RPM으로 흔들면서 밤새 자라도록 합니다. 다음 날, 포화 배양액을 배지에서 0.1 미만의 OD600으로 희석합니다.

희석된 배양액을 섭씨 30도 셰이커에 3-4시간 동안 또는 OD600이 0.4에서 0.8 사이가 될 때까지 되돌립니다. 파라핀 필름 시트를 너비 4인치, 길이 7인치의 조각으로 절단하여 플로우 챔버 슬라이드 준비를 시작합니다. 4인치 너비의 파라핀 필름에 표준 현미경 슬라이드를 세로로 놓고 슬라이드가 3-4층 두께의 필름으로 덮이도록 슬라이드 주위를 3-4회 감습니다.

레이어를 함께 눌러 합리적인 밀봉이 있는지 확인하되 너무 세게 누르거나 필름이 구겨지지 않도록 하십시오. 깨끗한 상자 커터 면도기와 다른 슬라이드를 사용하여 절단을 위한 직선 모서리를 제공하고 슬라이드의 바깥쪽 가장자리를 따라 파라핀 필름을 자릅니다. 작업 슬라이드에서 여분의 필름을 벗겨내고 버립니다.

두 번째 슬라이드를 직선 가장자리로 사용하여 슬라이드의 긴 축을 따라 쌓인 필름 레이어를 각각 너비가 2-4mm인 약 10개의 스트립으로 자릅니다. 다음으로, 슬라이드의 짧은 축을 따라 적층된 파라핀 필름 층을 이전 절단에 수직으로 절단하여 너비가 2-4mm, 길이가 23-24mm, 두께가 3-4인 스트립을 만듭니다. 면도기를 45도 각도로 사용하여 절단된 필름 스트립을 벗겨냅니다.

그런 다음 집게를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드에 절단 스트립을 고르게 분배하여 원하는 수의 챔버를 만듭니다. 이 예에서는 4개의 필름 스트립을 사용하여 3개의 챔버를 만듭니다. 필름 스트립 위에 단일 커버 슬립을 놓고 집게로 제자리에 이동합니다.

준비된 슬라이드, 커버 슬립을 섭씨 약 95도로 설정된 핫 플레이트에 놓고 필름 스트립이 반투명해질 때까지 슬라이드를 약 3분 동안 가열합니다. 핀셋을 사용하여 파라핀 필름 스트립 바로 위에 있는 커버 슬립 영역을 부드럽게 눌러 슬라이드와 커버 슬립을 함께 밀봉합니다. 집게를 사용하여 핫 플레이트에서 슬라이드를 제거하고 커버 슬립 면이 위를 향하도록 하여 식히도록 따로 보관합니다.

슬라이드가 냉각되면 필름이 흰색 불투명 색상으로 돌아갑니다. 이 절차를 시작하려면 Concanavalin A의 냉동 200마이크로리터 분취액을 실온에서 해동합니다. 약 100마이크로리터의 해동된 Concanavalin A를 열린 끝단 중 하나에 피펫팅하여 준비된 슬라이드의 각 챔버에 추가합니다.

그런 다음 Concanavalin A가 커버 슬립에 부착될 수 있도록 두 개의 마이크로퓨지 튜브 랙 사이에 슬라이드, 커버 슬립을 5분 동안 걸어둡니다. 슬라이드를 커버 슬립업 위치로 되돌리고 챔버를 합성 완전 매체로 세척하여 Concanavalin A를 제거합니다. 종이 타월의 모서리를 사용하여 챔버의 한쪽 끝에서 유체를 빼내는 동시에 챔버의 다른 쪽 끝으로 새 액체를 피펫팅하여 챔버를 통해 매체 챔버 부피의 2배를 흐릅니다.

로드셀은 Directed flow 방법을 사용하여 Cell Suspension의 챔버 부피의 2배를 유동시킵니다. 슬라이드를 걸고 커버 슬립을 10분 동안 걸어 셀이 커버 슬립에 부착되도록 합니다. 합성 완전 배지의 챔버 부피의 4배를 통해 흘러 부착되지 않는 세포를 씻어냅니다.

종이 타월의 깨끗한 모서리로 챔버의 각 끝을 조심스럽게 말리고 반월판을 커버 슬립의 가장자리로 가져옵니다. 챔버의 각 끝을 따뜻한 밀봉제로 밀봉합니다. 이미지 획득은 1.45 NA 100X CFI Plan Apo 대물렌즈, 압전 스테이지, 회전 디스크 컨포칼 스캐닝 장치, 조명 레이저 및 EMCCD 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 수행됩니다.

이미지 획득 중에 스테이지의 온도를 실온으로 유지합니다. 세포에 초점을 맞추고 슬라이드에서 함께 그룹화된 세포를 검색하여 획득 필드에 동일한 초점면에 최소 5-6개의 세포가 함께 모여 있는지 확인합니다. 다차원 수집을 프로그래밍하여 시간 경과에 따라 여러 zSeries를 수집합니다.

활성 획득 설정 내의 설정을 다음과 같이 조정합니다: 전체 효모 셀을 포함하는 총 Z 깊이 6마이크로미터, 오버샘플링 없이 집광을 최대화하기 위한 300나노미터의 Z 단계 크기, 총 시간 10분, z시리즈 간 4초의 시간 간격, 각 Z 평면에 대한 노출 시간 90밀리초. 실행을 클릭하여 획득을 시작하고 전체 10분 동안 실행되도록 허용합니다. 데이터는 이미지 시리즈로 저장되며 타임 랩스 이미징의 예시 결과가 여기에 표시됩니다.

ImageJ를 열고 획득한 이미지 스택을 제어판으로 직접 드래그하여 이미지 분석을 시작합니다. 가져온 바이오 형식이 자동으로 시작됩니다. 선택"확인"이미지 스택을 하이퍼스택으로 로드합니다.

ZProject 함수를 사용하여 각 zSeries를 2차원 투영의 최대 강도로 축소합니다. 이미지 스택에 중간 필터를 적용하면 process 메뉴, filter 하위 메뉴 및 median 기능을 선택하여 얼룩 노이즈를 줄일 수 있습니다. 반경 상자에 2.0픽셀을 입력하고 확인을 클릭합니다."필드에서 NFA 이전 셀을 식별합니다.

이들은 중간 크기의 새싹과 길이가 약 1-1 점 5 마이크로 미터인 짧은 유사 분열 방추체가 특징입니다. 이미지 시리즈의 첫 번째 시점부터 시작하여 분할된 선 도구를 사용하여 아스트랄 미세소관과 더 강하게 라벨링된 방추 미세소관 사이의 접합부에 위치한 단일 아스트랄 미세소관을 따라 세포질에 있는 플러스 말단까지 선을 그립니다. 미세소관의 끝을 두 번 클릭하여 분할된 선을 완성합니다.

키보드의 M 버튼을 눌러 측정 기능을 사용하여 결과 테이블에 측정값을 기록합니다. 모든 시점에 대해 측정이 이루어진 후 결과 테이블에서 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 "다른 이름으로 저장"을 선택하여 데이터를 선택합니다. 이 그래픽은 야생형 세포에서 아스트랄 미세소관 역학의 시계열을 보여주며, 이전에 더 안정적인 미세소관을 가지고 있는 것으로 나타난 돌연변이 균주를 보여줍니다.

미세소관은 미세소관 길이를 시각화하기 위해 GFP 태그가 지정된 알파 튜불린으로 표시됩니다. 빨간색 화살표는 아스트랄 미세소관의 전체 길이를 추적하며, 화살촉은 플러스 끝을 나타냅니다. 미세소관의 길이는 각 시점에서 8분 동안 측정되었으며, 이렇게 수집된 길이는 생명 플롯에 표시되어 있습니다.

녹색 점은 중합을 나타내고 분홍색 점은 해중합을 나타냅니다. 재앙 이벤트는 화살촉으로 표시됩니다. 이 플롯은 돌연변이의 미세소관이 야생형 미세소관보다 더 길고 더 적은 재앙을 나타낸다는 것을 보여줍니다.

또한, 상행 및 하강 미세소관 길이의 기울기에서 결정된 중합 및 해중합 속도는 야생형에 비해 돌연변이에서 감소합니다. 미세소관 역학(microtubule dynamics)을 측정한 결과, 돌연변이 세포의 미세소관(microtubule)이 야생형(wild type)에 비해 역동성이 감소했다는 사실도 밝혀졌습니다. 마스터링되면 슬라이드 준비, 세포 로딩 및 이미지 획득을 30분 이내에 수행할 수 있으며, 이는 하루 만에 다양한 샘플을 이미징할 수 있음을 의미합니다.

슬라이드 챔버는 Concanavalin을 추가하기 전에 미리 만들고 저장할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 간단한 슬라이드 챔버에서 효모 세포를 안정화하고, 4차원으로 이미지를 만들고, 살아있는 세포에서 미세소관 역학을 측정하는 방법을 잘 이해해야 합니다. 미세소관 외에도 이 절차를 수정하여 몇 초에서 몇 시간에 이르는 시간 척도에 걸쳐 살아있는 효모 세포에서 다른 형광 표지 단백질의 역학을 측정할 수 있습니다.