Name: 고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 학습하세요 생존 효모 세포에서 미세소관 역학을 측정하는 고해상도 공초점 현미경법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 돌연변이와 조절 인자가 미세소관 거동에 미치는 영향을 실시간으로 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 다양한 FP-TUB1 플라스미드를 공유 케리 블룸 (노스 캐롤라이나 대학), 켱 리 (NCI), 스티븐 마르쿠스 (콜로라도 주립 대학), 그리고 엘마 쉬에벨 (Universität 하이델베르크를) 감사합니다. 우리는 슬라이드 챔버의 제조 방법에서 우리를 훈련에 대한 멜리사 가드너 (미네소타 대학)에 감사하고 있습니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (JKM에) R01GM112893-01A1과 (CE에) T32GM008730을 부여에 의해 지원되었다.

<ol><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+spindles+and+spindle+plaques+in+the+cell+cycle+and+conjugation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).</li>
<li>Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tub4p%2C+a+yeast+gamma-tubulin-like+protein%3A+implications+for+microtubule-organizing+center+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function.</a> J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).</li>
<li>Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Tubulin-like+Tub4p+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+associated+with+the+spindle+pole+body+substructures+that+organize+microtubules+and+is+required+for+mitotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation.</a> J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).</li>
<li>Winey, M., Bloom, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22491889">Mitotic spindle form and function.</a> Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).</li>
<li>Gupta, M. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Tubulin+C354+mutations+that+severely+decrease+microtubule+dynamics+do+not+prevent+nuclear+migration+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast.</a> Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Gartz Hanson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alpha-tubulin+mutation+disrupts+neural+development+and+tubulin+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis.</a> Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).</li>
<li>Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+negatively+charged+carboxy-terminal+tail+of+beta-tubulin+promotes+proper+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation.</a> Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).</li>
<li>Song, S., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+CDC5+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis.</a> J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).</li>
<li>Knop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging+of+yeast+genes+using+a+PCR-based+strategy%3A+more+tags+and+improved+practical+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines.</a> Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).</li>
<li>Kosco, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+dynamics+by+Stu2p+is+essential+for+spindle+orientation+and+metaphase+chromosome+alignment+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast.</a> Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).</li>
<li>Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+stabilization+of+microtubule+dynamic+instability+in+vitro+by+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine.</a> Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).</li>
<li>Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+and+discrete+functions+for+tubulin+carboxy-terminal+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails.</a> Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).</li>
<li>Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+living+budding+yeast%3A+anaphase+A+but+no+metaphase+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate.</a> Science. 277 (5325), 574-578 (1997).</li>
<li>Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc14-regulated+midzone+assembly+controls+anaphase+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B.</a> J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).</li>
<li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

신진 효모 모델은 시간이 지남에 이미지 하나의 미세 소관의 능력과 효모 유전학의 도구를 사용하여 tubulin의와 미세 소관 규제를 조작 할 수있는 기능을 포함하여, 생체 내 환경에서 미세 소관 역학의 고해상도 측정을 수집하기위한 주요 이점을 제공한다. 콘 카나 발린 A-코팅 챔버 용융 아가 패드를 포함하여 전술 한 장치들상에서 다수의 이점을 제공한다. 챔버와 슬라이드 미리 만들어 장기 보관하거나 즉시 사용 가능 할 수있다. 또한 콘 카나 발린 A-코팅 챔버는 세포가 원래 배양 된 동일한 매체&gt; 6 시간 동안 효모 세포를 배양 할 수있다. 챔버 내의 세포의 수는 챔버 이미지를 만들 수있는 기간을 지시한다는 것을 명심해야한다. 코팅 챔버는 효모 세포의 단일 층 커버 슬립에 부착되도록. 마지막으로, 여러 개의 챔버를 만드는 것은 가능여러 가지 다른 효모 균주는 같은 슬라이드에 몇 군데 있습니다. 상대적으로 ...

미세 소관은 αβ-tubulin의 단백질 서브 유니트로 이루어지는 골격 중합체이며, 세포 내 운반, 세포 분열, 형태 형성 및 세포 운동성 포함 콘텍스트의 다양한 사용된다. 언제 어디서 미세 소관 양식이 다양한 역할에 대한 미세 소관 네트워크를 구축하기 위해 세포는 신중하게 조절해야합니다. 이 규정은 무료 하부 단위로 미세 소관 폴리머 또는 분해 미세 소관에 αβ-tubulin의 서브 유닛을 조립하거나하는 반응을 제어하여 수행됩니다; 이것은 미세 소관 역학로 알려져 있습니다. 미세 소관 분야의 주요 목표는 튜 불린 및 / 또는 미세 소관에 결합하는 αβ-tubulin의 서브 유닛 및 외부 규제 기관의 연구를 포함하여 미세 소관 역학을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하는 것입니다. 잘 확립 된 실험 방법은 COM 종종 정제 αβ-tubulin의 단백질을 사용하여 시험 관내에서 이러한 시스템을 재구성하는정제 된 외부 레귤레이터 환 경의. 이 유용한 방법이지만, 재구성 된 시스템의 미세 소관의 역 동성이 살아있는 세포에서 관찰 된 것과 크게 다른 것은 분명하다. 예를 들어, 미세 소관은 빠르게 성장하고 체외에 비해 생체 내에서 느리게 수축. 이러한 차이는 세포의 알려진 외부 조절기 (1)의 유용성뿐만 아니라, 아직까지 정의되지 않은 요인에 기인 할 수있다. 따라서 미세 소관 규제 및 네이티브 셀룰러 맥락에서 역 동성을 방해 돌연변이의 활동을 결정하는 것이 중요합니다. 후생 동물 모델은 미세 소관 기능과 고차원 조직을 조사하는 일반적인 시스템적일 수 있지만, 몇 가지 실제적인 문제는 심각하게 미세 소관 역학의 정확한 측정을 위해이 모델의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 첫째, 셀 당 수천 수십 이르기까지 미세 소관의 높은 수는, 자신에 어렵게 만든다시간이 지남에 따라 개별 미세 소관을 추적 할 수 있습니다. 많은 연구는 선택적 같은 최종 결합 (EB) 계열의 단백질과 같은 미세 소관 단부에 지역화 단백질을 묘화함으로써이 문제를 다룬다. 그러나, 이러한 단백질은 후생 동물 2 미세 소관 성장의 끝을 지역화하는 것으로 알려져있다. 따라서, 이들 단백질의 효용은 간접적 재앙 주파수와 역학의 다른 측면을, 직접 측정하면서, 성장 속도를 측정하기 위해 제한된다. 둘째, 게놈 편집 기술의 발전에도 불구하고 안정적으로 형광 표지 튜 불린 또는 선택적으로 튜 불린 또는 미세 소관 규제를 조작하는 돌연변이를 도입을 발현하는 세포를 만드는 것이 중요한 과제로 남아. 또한, 후생 동물의 많은 튜 불린 아이소 타입의 존재는 돌연변이가 개별 튜 불린 유전자에 미치는 영향을 연구를 혼동. 신진 효모 시스템은 생체 microtubu에서 측정하기위한 몇 가지 중요한 이점을 제공르 역학. 효모는 개별 미세 소관의 시각화를 허용 간략화 미세 소관의 네트워크를 가지고있다. 효모에서 미세 소관은 핵 봉투 3에 포함 된 스핀들 극 기관 (SPB는)으로 알려진 센터를 조직에서 발산. SPB는 미세 소관은 4, 5 핵 γ-tubulin의 작은 착물에 대한 지지체로 작용한다. SPB는 미세 소관은, 스핀들 미세 소관과 별 미세 소관의 두 개의 클래스를 핵. 핵질로 스핀들 미세 소관 프로젝트 및 동원체의 미 세관을 통해 염색체에 부착 및 극간 소관 6 겹치는 스핀들 비아를 안정화시키는 것이 중요하다. 대조적으로, 미세 소관 별의 바깥 세포질 내로 돌출하고는 스핀들 미세 소관의 밀집 네트워크 비교적 드문 비교된다. 유사 분열하는 동안, 사전 anaphase (핵분열 말기) 세포는 SPB 중 하나에서 나오는 1-2 별 미세 소관이있다; 이 내가로 존재오히려 7 번들로보다 미세 소관 ndividual. 유사 분열 동안 별 미세 소관의 역할은 꽃 봉오리 목으로 알려진 어머니와 새싹 구획 사이의 접합에 핵 스핀들을 이동하는 것입니다. 이 운동으로 결국 꽃 봉오리 목 8로 핵 스핀들을 당겨 별 미세 소관에 힘을 생성하는 잘 정의 된 경로를 포함한다. 효모 시스템의 또 다른 장점은 비할 데없는 정밀 미세 소관 규제 및 튜 불린 서브 유닛을 조사하는 데 사용할 수있는 자사의 유전학의 유틸리티입니다. 단일 β-tubulin의 유전자 (TUB2)와 두 개의 α-tubulin의 유전자 (TUB1 및 TUB3) 효모는 또한 튜 불린 동형의 간략화 레퍼토리를 갖는다. 돌연변이 용이 유전자로 도입시켜 균질 튜 불린 인구 (9) (10)에 조사 될 수있다. 널리 여러 가지가 있습니다가능한 라벨 미세 소관에 대한 구조, 이들은 안정적인 표현 염색체 유전자좌에서 통합의 대상이 될 수있다 (토론 참조). 이 방법의 전반적인 목적은 미소 관 역학 고분해능 측정을위한 네 개의 차원 (X, Y, Z, 및 T) 효모 살아있는 세포에서 단일 이미지 소관이다. 효모 세포의 형광 표지 된 튜 불린의 구성 적, 낮은 수준의 발현 구성체의 통합을위한 방법들이 설명된다. 촬상 전에, 살아있는 세포는 장기 이미징 세포를 안정화 렉틴 콘 카나 발린 A의 코팅 된 슬라이드 챔버에 장착된다. 화상 취득을위한 최적의 파라미터뿐만 아니라, 데이터 분석을위한 플로도 기재되어있다.

<table><tbody><tr><td>DOB (dropout bases)</td><td>일출 과학&nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>선라이즈 과학&nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 폴리스티렌 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA (Samon Sperm)&nbsp; 멸균 DiH2O</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; D7656</td>은 <td>DiH2O에서 10mg/mL로 재현탁합니다. 부분 표본을 -20 &ordm에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>합성 완전 매체&nbsp;</td><td>일출 과학&nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>콘카나발린 A</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>L7647</td>은 <td>DiH2O에서 2mg/mL로 재현탁합니다. 부분 표본을 -20 &ordm에 저장하십시오. C</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>파라 필름</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>파라핀 필름</td></tr><tr><td>VALAP (바셀린, 라놀린 및 파라핀의 동일한 부분)</td><td></td><td></td><td>은 75 &ordm에서 용융됩니다. C 사용 전</td></tr><tr><td>집게&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>포예틸렌 글리콜 (PEG) 3350</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E 반전 퍼펙트 포커스 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>피에조 전기 스테이지&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 스캐너</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>레이저 콤바이너 모듈</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD 카메라</td><td>Andor Technology</td><td>iXon Ultra 897&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 소프트웨어</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Bio-Formats Importer 플러그인</td><td>개방형 현미경 환경</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>참조: Song, S. and Lee, K. S. 사이토키네시스에서 Saccharomyces cerevisiae CDC5의 새로운 기능. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001년)</td></tr></tbody></table>

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

동적 미세 소관은 많은 세포 과정의 기초이며, 미세 소관 역학의 정확한 측정은 세포가 이러한 과정을 조절하는 방법에 대한 방법과 유전자 돌연변이에 미치는 영향 규정 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 후생 동물 모델에서 미세 소관 역학의 정량화는 유전자 조작에 높은 미세 소관 밀도 및 제한 사항을 포함하여 관련 문제의 번호가 있습니다. 반면, 신진 효모 모델은 이러한 문제를 극복 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 효모 살아있는 세포에서 단일 미세 소관의 역학을 측정하는 방법을 설명합니다. 형광 태그 튜 불린을 발현하는 세포는 안정한 저속 화상 획득을 가능하게 조립 슬라이드 챔버에 부착되어있다. 고속 대한 상세한 가이드의 4 차원 이미지 획득은 공 초점 화상 스택 동적 미세 소관의 속성을 정량화하는 프로토콜뿐만 아니라, 제공된다. 이 방법은, 종래의 효모 유전자와 결합 잠정량적 튜 불린 소단위의 활성을 변경하는 레귤레이터 미세 소관 또는 돌연변이의 영향을 평가하기위한 유일하게 적합한 접근법을 IDES.

효모 살아있는 세포에서 미세 소관의 역학을 측정하는 것은 미세 소관 규제 또는 튜 불린를 코딩하는 유전자의 돌연변이가 영향을 중합 및 해중합 속도뿐만 아니라, 이러한 상태 간의 전환의 주파수를 소단위 방법을 평가하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 그림 1 표시 야생형 세포에서 별 미세 소관 역학의 시간 시리즈 (430Δ tub2-) β-tubulin에 돌연변이와 돌연변이 세포. 미세 소관은 미세 소관의 길이를 시각화하는 GFP - 태그 α-tubulin에 함께 표시되어 있습니다. 빨간 화살표는 각 화상 (Figure1A 1 C)의 별 미세 소관의 길이를 추적. 미세 소관의 길이가 8 분 동안 각각의 시간 지점에서 측정하고,이 길이는 컴파일 수명 플롯 (도 1b 및 1 D)에 도시되어있다. 이 데이터는 중...

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

이 실험 절차의 전체적인 목표는 효모 세포 내의 미세소관 역학을 측정하는 것입니다. 이 방법은 미세소관 및 미세소관 조절 인자의 돌연변이가 살아있는 세포 내에서 미세소관 역학을 어떻게 조절하는지와 같은 미세소관 분야의 핵심 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 효모 세포를 이미지 상에서 안정화할 수 있다는 점입니다.대신에, 10분 동안의 높은 시간 해상도 또는 수 시간 동안의 낮은 시간 해상도를 선택합니다. 절차 시연은 본 연구실의 두 대학원생인 Colby Fees와 Cassi Estrem이 맡아 진행하겠습니다. 본 실험에 사용된 효모 세포는 GFP가 표지된 tubulin을 상시 발현하도록 제작되었습니다.플레이트 상의 단일 콜로니에서 효모 세포 약 1 µL를 취해 3 mL의 합성 완전 배지(synthetic complete medium)에 접종합니다. 30 °C에서 250 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 세포를 배양합니다. 다음 날, 포화된 배양액을 배지 내에서 OD600이 0.1 미만이 되도록 희석합니다.희석된 배양액을 30 °C 진탕 배양기에 넣고 3~4시간 동안, 또는 OD600 수치가 0.4에서 0.8 사이가 될 때까지 배양합니다. 가로 4인치, 세로 7인치 크기로 파라핀 필름 시트를 잘라 유체 챔버 슬라이드 준비를 시작합니다. 표준 현미경 슬라이드를 파라핀 필름의 4인치 너비 방향으로 길게 놓은 다음, 슬라이드가 3~4겹 두께의 필름으로 덮이도록 필름을 슬라이드 주변으로 3~4번 감쌉니다.층들을 함께 눌러 적절하게 밀봉되었는지 확인하되, 너무 세게 누르거나 필름에 주름이 생기지 않도록 주의하십시오. 깨끗한 커터 칼날과 직선 가이드 역할을 할 다른 슬라이드를 사용하여, 슬라이드의 바깥쪽 가장자리를 따라 파라핀 필름을 자릅니다. 작업 슬라이드에서 남은 필름을 벗겨내어 폐기하십시오.두 번째 슬라이드를 직선 가이드로 사용하여, 겹쳐진 필름 층을 슬라이드의 장축을 따라 너비 약 2~4 mm의 스트립 10개로 자릅니다. 다음으로, 겹쳐진 파라핀 필름 층을 이전 절단면과 수직이 되도록 슬라이드의 단축을 따라 잘라, 너비 2~4 mm, 길이 23~24 mm, 두께 3~4층의 스트립을 만듭니다. 면도날을 45도 각도로 사용하여 절단된 필름 스트립을 떼어냅니다.그다음 핀셋을 사용하여 절단된 스트립을 깨끗한 현미경 슬라이드 위에 고르게 배치하여 원하는 수의 챔버를 만듭니다. 본 예시에서는 4개의 필름 스트립을 사용하여 3개의 챔버를 만듭니다. 필름 스트립 위에 커버슬립 한 장을 덮고, 핀셋으로 위치를 조정합니다.준비된 슬라이드를 커버슬립이 위로 오도록 하여 약 95 °C로 설정된 핫플레이트 위에 올리고, 필름 스트립이 반투명해질 때까지 약 3분 동안 가열합니다. 핀셋을 사용하여 파라핀 필름 스트립 바로 위에 있는 커버슬립 부위를 부드럽게 눌러 슬라이드와 커버슬립을 함께 밀봉합니다. 포셉을 사용하여 슬라이드를 핫플레이트에서 제거하고, 커버슬립 면이 위를 향하도록 놓아 식힙니다.슬라이드가 식으면서 필름은 다시 흰색의 불투명한 색상으로 돌아갑니다. 이 절차를 시작하려면, 냉동 보관된 200 µL의 Concanavalin A 분주액을 실온에서 해동하십시오. 준비된 슬라이드의 열려 있는 끝단 중 하나로 피펫팅하여, 각 챔버에 해동된 Concanavalin A를 약 100 µL씩 첨가하십시오.그 다음, Concanavalin A가 커버슬립에 부착될 수 있도록 슬라이드를 커버슬립이 아래로 향하게 하여 두 개의 마이크로 튜브 랙 사이에 5분 동안 매달아 둡니다. 슬라이드를 다시 커버슬립이 위로 향하는 위치로 돌려놓고, 합성 완전 배지로 챔버를 세척하여 Concanavalin A를 제거합니다. 페이퍼 타월의 모서리를 사용하여 챔버의 한쪽 끝에서 액체를 끌어내는 동시에 다른 쪽 끝으로 신선한 액체를 피펫팅하여, 챔버 부피의 2배에 해당하는 배지를 챔버에 흐르게 합니다.지향성 흐름법을 사용하여 챔버 부피의 2배에 해당하는 세포 현탁액을 흘려보내 세포를 로딩합니다. 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 슬라이드를 커버슬립이 아래로 향하게 하여 10분 동안 매달아 둡니다. 합성 완전 배지를 챔버 부피의 4배만큼 흘려보내 부착되지 않은 세포를 씻어냅니다.종이 타월의 깨끗한 모서리를 사용하여 챔버의 각 끝부분을 조심스럽게 닦아내고, 메니스커스가 커버 슬립의 가장자리에 오도록 합니다. 따뜻한 실란트로 챔버의 각 끝을 밀봉합니다. 이미지 획득은 1.45 NA 100X CFI Plan Apo 대물렌즈, 피에조 스테이지, 스피닝 디스크 공초점 스캐닝 유닛, 조명 레이저 및 EMCCD 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용하여 수행합니다.이미지 획득 과정 동안 스테이지 온도를 실온으로 유지하십시오. 세포의 초점을 맞추고 슬라이드 내에서 세포들이 군집을 이룬 곳을 찾아, 획득 영역의 동일한 초점 평면에 최소 5~6개의 세포가 함께 모여 있는지 확인하십시오. 시간에 따라 여러 zSeries를 수집할 수 있도록 다차원 획득 설정을 프로그래밍하십시오.활성 획득 설정 내의 설정을 다음과 같이 조정하십시오: 효모 세포 전체를 포함하도록 총 Z 깊이는 6 µm로, 오버샘플링 없이 빛 수집을 최대화하도록 Z 단계 크기는 300 nm로, 총 시간 기간은 10분으로, zSeries 간 시간 간격은 4초로, 그리고 각 Z 평면의 노출 시간은 90 ms로 설정합니다. Run을 클릭하여 획득을 시작하고, 10분 전체 기간 동안 실행되도록 둡니다. 데이터는 이미지 시리즈로 저장되며, 타임랩스 이미징의 결과 예시가 여기에 표시됩니다.ImageJ를 실행하고 획득한 이미지 스택을 컨트롤 패널로 직접 드래그하여 이미지 분석을 시작합니다. Bio-formats 가져오기가 자동으로 시작됩니다. 이미지 스택을 하이퍼스택(hyperstack)으로 로드하려면 "Okay"를 선택하십시오.ZProject 함수를 사용하여 각 zSeries를 최대 강도 2차원 투영으로 통합합니다. Process 메뉴, Filter 하위 메뉴에서 Median 기능을 선택하여 이미지 스택에 미디언 필터를 적용함으로써 스펙클 노이즈를 감소시킵니다. 반경 상자에 2.0 pixels를 입력하고 확인을 누릅니다. 시야 내의 pre-NFA 세포를 식별합니다.이들은 중간 크기의 출아 세포와 약 1~1.5 µm 길이의 짧은 유사분열 방추사로 특징지어집니다. 이미지 시리즈의 첫 번째 시점부터 시작하여, 분절선 도구를 사용하여 성상 미세소관과 더 강하게 표지된 방추사 미세소관 사이의 접합부에 위치한 지점부터 세포질에 있는 플러스(+) 말단까지 단일 성상 미세소관을 따라 선을 그립니다. 미세소관의 끝부분을 더블 클릭하여 분절선을 완성합니다.키보드의 M 버튼을 눌러 측정 기능을 사용하여 결과 표에 측정값을 기록합니다. 모든 시점에 대한 측정이 완료되면, 결과 표의 데이터를 복사하여 스프레드시트에 붙여넣고 "다른 이름으로 저장"을 선택하여 데이터를 선택합니다. 이 그래픽은 야생형 세포와 이전에 더 안정적인 미세소관을 가진 것으로 나타난 돌연변이 균주의 성상 미세소관 역동성 시계열을 보여줍니다.미세소관 길이를 시각화하기 위해 GFP가 태그된 alpha tubulin으로 미세소관을 라벨링하였습니다. 빨간색 화살표는 성상 미세소관의 전체 길이를 나타내며, 화살표 머리는 플러스(+) 끝단을 의미합니다. 8분 동안 각 시점마다 미세소관 길이를 측정하였으며, 이렇게 수집된 길이는 생존 곡선(life plots)에 표시되었습니다.녹색 점은 중합을 나타내며, 분홍색 점은 탈중합을 나타냅니다. 카타스트로피(Catastrophe) 이벤트는 화살표 머리로 표시되었습니다. 이 그래프들은 돌연변이체의 미세소관이 야생형 미세소관보다 더 길고, 카타스트로피 발생 빈도가 더 낮음을 보여줍니다.또한, 미세소관 길이의 상승 및 하강 기울기로부터 결정된 중합 및 탈중합 속도는 야생형에 비해 변이체에서 감소하였습니다. 미세소관 역학 측정 결과, 변이체 세포 내의 미세소관은 야생형보다 동역학성이 감소한 것으로 나타났습니다. 슬라이드 준비, 세포 로딩 및 이미지 획득 과정에 숙달되면 30분 이내에 수행할 수 있으며, 이는 하루에 많은 다양한 샘플의 이미지를 촬영할 수 있음을 의미합니다.슬라이드 챔버는 Concanavalin A를 첨가하기 전에 미리 제작하여 보관할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 단순 슬라이드 챔버에서 효모 세포를 안정화하고, 4차원으로 이미징하며, 살아있는 세포 내의 미세소관 역학을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 미세소관 외에도, 이 절차를 수정하여 초 단위에서 시간 단위까지의 시간 범위에 걸쳐 살아있는 효모 세포 내 다른 형광 표지 단백질의 역학을 측정할 수 있습니다.

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여기에서, 우리는 연구원이 유사분열과 만두증 도중 살아있는 핵분열 효모 세포에 있는 단백질 행동 그리고 핵 역학을 공부하는 것을 허용하는 비 독성 현미경 검사법인 살아있는 세포 화상 진찰을 제시합니다.

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여기에 제출된 것은 손상되지 않은 조직에서 초해상도 라이브 세포 이미징을 위한 프로토콜입니다. 우리는 그것의 네이티브 조직 환경에 있는 높게 민감한 성인 줄기 세포 인구를 화상 진찰을 위한 조건을 표준화했습니다. 이 기술은 살아있는 조직에서 생물학적 현상의 직접적인 관찰을 허용하는 시간적 및 공간 해상도의 균형을 포함한다.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

핵분열 효모는 FtsZ 및 MreB와 같은 박테리아 세포골격 단백질을 GFP와 함께 번역 융합 단백질로 발현하여 중합을 시각화하는 이종 숙주로 사용됩니다. 또한 중합에 영향을 미치는 화합물은 형광 현미경을 사용하여 이미징하여 식별합니다.

박테리아 세포골격 단백질을 표적으로 하는 항균 약물 스크리닝을 위한 플랫폼으로서의 핵분열 효모

이 프로토콜은 효모 세포 주기 정지 및 선택적 방출의 두 가지 방법을 자세히 설명하고 S. cerevisiae에서 세포 주기 의존적 과정을 연구하기 위한 형광 현미경의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

발아 효모의 세포 주기 의존적 과정의 조작 및 분석

학습하세요 생존 효모 세포에서 미세소관 역학을 측정하는 고해상도 공초점 현미경법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 돌연변이와 조절 인자가 미세소관 거동에 미치는 영향을 실시간으로 연구하는 데 활용됩니다.

고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

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