Name: 공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 배우세요 F-actin에 결합하는 단백질을 공동 침강법으로 측정하는 방법을. 초고속 원심분리기를 사용하여 결합 친화도를 정량화하고 세포골격 상호작용을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 National Institutes of Health Grant HL127711에 의해 AVK에 의해 지원되었습니다.

<ol><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+Actin-Binding+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li>
<li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li>
<li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+proteins%3A+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li>
<li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li>
<li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li>
<li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li>
<li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.cshlpress.org/default.tpl?cart=148475793033306084&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=678">Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2009).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li>
<li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li>
<li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actin+gene+family%3A+function+follows+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li>
<li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology%3A+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li>
<li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+actin%3A+purification+and+single+molecule+assembly+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

액틴 동시 침강 분석은 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 신속하게 결정할 수있는 직접적인 기술입니다. 약간의 변경을 가하면이 기법을 사용하여 상호 작용의 친 화성을 측정 할 수도 있습니다. 위의 프로토콜에서 제기 된 점 외에도 분석을 디자인, 실시 및 해석 할 때 다음 사항을 고려해야합니다. 관심있는 단백질 신선하게 준비되거나 동결 된 단백질을 분석에 사용할 수 있습니다. 동결 단백질이 사용되는 경우 동결이 F- 액틴 바인딩에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 결과를 신선한 (결코 동결되지 않은) 단백질과 비교하는 것이 좋습니다. G- 액틴 소스 많은 pelleting 실험은 G-actin을 상대적으로 풍부하기 때문에 근육에서 분리하여 사용합니다. 포유류에서 알파, 베타 및 감마와 같은 세 가지 주된 액틴 이소 타입이 있습니다 (90 % 이상의 서열 식별 기호ty). 그럼에도 불구하고 isotypes 12 , 13 에는 기능적 차이가 있습니다. 가능한 경우, 결합 분석에서 사용되는 G- 액틴 이소 타입 은 생체 내 아이소 타입과 일치해야합니다. 예를 들어, 골격근에서 발현 된 단백질을 테스트 할 경우 알파 - 굴지가 최선의 선택입니다. 섬유 아세포에서 발현되는 단백질을 검사 할 경우 베타 - 액틴 (beta-actin)을 권장합니다. Phalloidin 사용 Phalloidin은 F-actin과 결합하기 때문에 일부 F-actin 결합 단백질 ( 예 : phalloidin 블록 cofilin과 actin 필라멘트의 결합) 14의 결합을 방해하거나 차단할 수 있습니다. 따라서, phalloidin은 조심해서 사용해야하며 가능한 경우 phalloidin으로 처리하지 않은 샘플과 비교합니다. 높은 배경 단백질이 F- 액틴의 부재하에 침전되는 것은 드문 일이 아닙니다 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플 없음에스). 그러나 높은 수준의 백그라운드 침전은 진정한 액틴 동시 침강을 가려 낼 수 있으며 불가능하지는 않더라도 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 또는 상호 작용의 친화력을 측정 하는지를 결정하는 것을 어렵게 만듭니다. 폴리 디카 놀을 반응 완충액 (단계 4.1)에 첨가하면 배경을 상당히 감소시킬 수 있고 쉬운 해결책이다. 그것이 배경을 감소시키지 않는다면, 반응 완충액, 소금 농도 및 / 또는 배양 온도를 조정하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 제본 곡선 결합 곡선을 생성하기 위해서는, 일련의 반응에 대해 관심있는 단백질 또는 F- 악틴의 농도를 변화시키는 것이 필요하다. 실제로, 고정 농도에서 F- 액틴을 유지하고 관심있는 단백질의 농도를 변화시키는 것이 더 쉽고 바람직하다. pelleting 분석에서 고정 농도 ( 예 : 2 μM)에서 F-actin을 유지하면 고농도의 F-actin 농도에서 비특이적 트래핑이 제한되어 예방됩니다F-actin 농도가 낮은 (&lt;0.5 μM) 경우 해중합. Phalloidin을 사용하여 해중합을 막을 수는 있지만, 이것은 시스템에 잠재적 인 복잡 요인을 유발합니다 (3.3 단계 이상 참조). 고정 농도에서 F - 굴지 유지는 또한 샘플을 통해 F - 액틴 펠렛을 비교 (그리고 정상화)하고 실패한 실험 ( 즉, F - 액틴 펠렛은 매우 가변적이어서 농도에 따른 분석을 막음)을 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 고정 농도에서 F- 굴지를 유지하면 액틴 필라멘트에 대한 결합이 협동인지를 결정할 수 있습니다 ( 그림 1C ). 포화 바인딩 모든 결합 실험에서와 같이, F- 액틴에 대한 결합이 포화되어 있고 단백질 + F- 액틴 플러스의 농도가 중요합니다 ( 그림 1C ). 고원이 없으면 정확한 해리 평형 상수를 계산할 수 없습니다. 따라서,시험 할 희석 시리즈를주의 깊게 계획하고 항상 더 높은 농도의 단백질을 포함하는 것이 중요합니다 ( 예 : 예상 Kd보다 적어도 5 ~ 10 배 이상). 바인딩 분석 측정 된 해리 상수가 결정적이기 위해서는, 관심 단백질에 대한 F-actin상의 결합 부위의 농도가 친 화성보다 훨씬 낮아지는 F- 액틴 농도를 사용하여 분석을 수행해야합니다. 이 기준이 충족되었는지 여부를 확인하려면 Bmax에서 결합 사이트의 농도를 추정하십시오. 예를 들어 [F- 액틴]이 2 μM이고 Bmax = 0.5 인 경우 [결합 부위]는 약 1 μM입니다. K d 는 [결합 부위]보다 적어도 5 내지 10 배 더 커야한다. 측정 된 K d 가 [결합 부위]와 동일한 정도의 크기라면, 관찰 된 결합 곡선은 고친 화성 결합 si의 적정을 나타내는 것이 가능하다tes보다는 진정한 구속 isotherm. 이것이 관찰되면 정확한 친화도를 측정하기 위해 10 배 낮은 F-actin 농도를 사용하여 분석을 반복하십시오. 고친 화성 상호 작용의 경우, phalloidin 안정화 (단계 3.3)는 정확하게 친화도를 측정 할만큼 충분히 낮은 F- 액틴 농도를 달성하는 데 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 분석을 수행하고 평가할 때 연구자가 알아야 할 공동 침강 분석의 근본적인 한계가 있습니다. 가장 중요한 것은 공 침강 분석이 진정한 평형 상수를 생성하지 않는다는 것입니다. 원심 분리 과정에서 결합 생성물 ( 즉, 단백질 + F- 액틴)이 반응물과 분리되면 생성물은 해리되어 새로운 평형을 생성 할 수 있습니다. 결과적으로, co-sedimentation assay는 낮은 친화도의 상호 작용을 오산하거나 잘못 검출 할 수 있습니다. 많은 액틴 결합 단백질은 F- 액틴에 대해 낮은 ( 즉, 마이크로 몰러) 친화력을 가지므로, 부정적인 결과 ( <e즉, 검출 할 수없는 결합)이 반드시 단백질이 F- 액틴에 결합하지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 대안으로, TIRF 현미경 기반의 단일 필라멘트 결합 분석법은 해리 상수를 결정할 때보다 민감하고 정확합니다 (이 기술에 대한 리뷰, 참고 자료 15,16 참조). 이러한 제한에도 불구하고, pelleting 분석은 대부분의 연구자의 수단에 속하며 단백질이 F-actin에 결합하는지 여부와 상호 작용의 친 화성을 측정 할 수있는 효과적인 도구입니다.

액틴은 운동성, 수축, 접착 및 형태학을 포함한 여러 세포 과정에서 중요한 역할을하는 필수적인 세포 골격 단백질입니다 1 . 액틴은 단구 구형 액틴 (G- 액틴)과 중합 된 사상 액틴 (F- 액틴)의 두 가지 형태로 존재합니다. 세포 내에서 F- 액틴 조직은 액틴 필라멘트 2 , 3 , 4 의 핵 형성, 성장, 가교 결합 및 분해를 조절하는 많은 단백질 모음에 의해 제어됩니다. 그러나 액틴 네트워크 구성을 조절하기 위해 여러 가지 액틴 결합 단백질이 함께 작용하는 방식은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 단백질 - 단백질 상호 작용의 측정은 단백질이 생화학 적 수준에서 세포 행동에 미치는 영향을 이해하는 중요한 접근법입니다. 많은 다른 assays는 정제 된 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.가용성 단백질에 대한 일반적인 접근법에는 풀다운, 형광 편광, 등온 적정 열량계 및 표면 플라스 몬 공명이 포함됩니다. 중요한 것은, 이들 모든 분석법은 단백질이 용해 될 것을 요구하기 때문에, F- 굴지와 같은 고분자 필라멘트 단백질을 사용하기에 적응하기가 어렵습니다. 여기서 우리는 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친화도를 측정하기위한 기술인 액틴 동시 침강 (actin co-sedimentation) 또는 펠렛 (pelleting) 분석을 설명합니다. 액틴 펠릿 법은 초 원심 분리기를 제외하고 특수 장비가 필요없는 비교적 간단한 기술입니다. 모든 시약은 기본 생화학 지식을 전제로하여 만들거나 구입할 수 있습니다. F - 굴지에 바인딩되면, 분석은 겉보기 친화력 ( 즉, 해리 평형 상수) 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 일단 친화력이 확립되면, 펠릿 화 분석법는 관심 단백질 ( 예 : 번역 후 변형, 돌연변이 또는 리간드 결합)이 F- 액틴 6 과 어떻게 상호 작용 하는지를 측정하는 유용한 도구입니다. 이 기법은 분석을 시도하기 전에 연구자가 알아야 할 한계가 있습니다 (토론 참조).

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 마이크로 초원심분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 로터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브 - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, 토끼 골격근</td><td>세포골격</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>폴리디카놀 (테싯)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 삼인산(ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 (MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(&베타;-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx 이미징 시스템</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant 블루 R-250 염료</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>콜로이드 블루 염색 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

공동 침강에 의한 f-actin에 대한 단백질 결합 측정

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

세포 내에서 필라멘트 액틴 (F- 굴지) 조직은 액틴 핵 생성, 성장, 가교 결합 및 / 또는 분해를 조절하는 다수의 액틴 결합 단백질에 의해 조절된다. 이 프로토콜은 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친 화성 ( 즉, 해리 평형 상수)을 측정하는 기술 - 액틴 동시 침강, 또는 펠렛 화 - 분석을 설명합니다. 이 기술에서 관심 단백질은 먼저 용액 내 F- 굴지와 함께 배양됩니다. 이어서, 차동 원심 분리를 사용하여 액틴 필라멘트를 침전시키고, 펠릿 화 된 물질을 SDS-PAGE로 분석한다. 해당 단백질이 F- 액틴에 결합하면 액틴 필라멘트와 함께 침강합니다. 결합 반응의 생성물 ( 즉, F- 액틴 및 관심 단백질)은 상호 작용의 친화력을 결정하기 위해 정량화 될 수있다. 액틴 펠릿 화 분석법은관심 단백질이 F- 액틴에 결합하고 리간드 결합과 같은 단백질의 변화가 F- 액틴과 어떻게 상호 작용하는지 평가할 수 있습니다.

우리는 co-sedimentation assay에서 F-actin에 결합하는 α-catenin homodimer를 검사했다. 과거의 실험은 F - 굴지에 대한 αE - catenin 동종 이합체의 친화도가 약 ​​1 μM이고 Bmax가 1 11 근처임을 보여 주었기 때문에, 우리는 낮은 농도의 F- 액틴 (0.2 μM보다는 2 μM; 토론). 0.2 μM이 임계 농도보다 낮기 때문에 phalloidin을 첨가하여 토끼 골격근 G-actin (단계 3.3)에서 중합 된 F-actin을 안정화시켰다. 증가하는 농도의 α-catenin homodimer (0.125-12.0 μM)를 0.2 μM F-actin의 존재 또는 부재 하에서 배양 하였다. 샘플을 원심 분리하고 결과물 인 펠렛을 분석 하였다 ( 그림 1A ). 예상대로 α-catenin 동종 이합체가 배경 위에 F- 액틴과 함께 침강 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플을 F-AC와 비교 함)주석 펠릿 샘플). BSA는 음성 대조군으로 수행되었다 ( 그림 1B ). 바운드 단백질을 정량하고 자유 단백질에 플롯하여 상호 작용의 친 화성을 계산했습니다 ( 그림 1C ). 플롯 된 데이터는 Hill 방정식에 가장 잘 맞습니다. 계산 된 Kd는 2.9 μM, Bmax는 0.2, Hill 계수 (h)는 4.8이었다. 따라서, αE - catenin 동종 이합체는 이전의 연구 (~ 1.0 μm의 대 2.9 μm의)와 일치, 낮은 micromolar 친화력과 협조 F - 굴지에 바인딩 11 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> 그림 1 : 고속 F- 액틴 동시 침전 분석. ( A ) 증가하는 농도 (0.125-12.0 μM)의 αE-catenin homodimer를 phalloidi로 안정화 된 0.2 μM F-actin (왼쪽 패널) 또는없는 (오른쪽 패널) 배양 하였다엔. 그들은 RT에서 30 분 동안 배양하고 원심 분리시켰다. 총 (출발 물질의 7.5 %) 및 펠릿 화 된 물질 (펠릿 화 된 물질의 50 %)을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( B ) 4 μM BSA를 음성 대조군으로 사용 하였다. F- 악틴이있는 (+) 또는없는 (-) 총 및 펠릿 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( C ) 자유 αE - catenin (μM)에 대해 A로부터 결합 된 αE-catenin (μM / μM actin)을 나타내었고, Hill 방정식 (적색선)에 적합 하였다. K d , B max 및 Hill 계수 (h)가 나열됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> 그림 2 : 액틴 펠릿 화 정량화 </strong&gt; - 순서도. 이 도식은 총계 및 펠렛 샘플 ( A , CE ) 및 정량화에 사용되는 표준 곡선 ( B )의 예와 함께 섹션 5의 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 5.13 단계 : 1 ) 총 시료 (A)에서 관심 단백질의 양을 측정합니다. 2 ) 단백질 강도 (B) 대 밴드 강도를 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다. 3 ) F - 굴지 ( C )와 함께 침전 된 관심 단백질의 양을 측정합니다. 4 ) F - 굴지 ( D )의 부재에서 pelleted 관심 단백질의 양을 측정합니다. 5 ) F를 액틴에 결합하는 단백질의 양을 결정하기 위해 C에서 D를 뺍니다. 6 ) 각 펠렛 (E)에서 F- 액틴의 양을 측정하고, 샘플 당 F- 액틴의 평균 양을 계산하고, 평균으로 각 샘플을 나눕니다 (아래 숫자는 비율을 나타냄). 7 )각 샘플에 대해 펠렛의 차이를 조정하기 위해 결합 된 단백질의 양 (단계 5에서 계산)을 F- 액틴 펠릿 비율 (단계 6에서 계산)로 나눕니다. 8 ) 표준 곡선 ( B )를 사용하여 각 샘플에서 표준화 된 결합 단백질의 양 (질량)을 계산합니다 (단계 7). 9 ) 결합 곡선을 만들기 위해 유리 단백질과 결합 단백질의 농도를 결정하십시오. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 필라멘트 액틴 (F - 굴지)과 함께 공동 침강하는 단백질의 능력을 테스트하는 방법을 설명하고, 바인딩이 관찰되면 상호 작용의 친화력을 측정하는 방법을 설명합니다.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

이 기술의 전반적인 목표는 단백질이 filamentous actin과 함께 공침(co-sediment)되는 능력을 테스트하고, 결합이 관찰될 경우 상호작용의 친화도를 측정하는 것입니다. 이 방법은 단백질이 F-actin에 결합하는지 여부를 결정하는 간단한 기술입니다. 이 기술의 장점은 초원심분리기를 제외하고는 특수 장비가 필요하지 않으며, 모든 시약을 직접 제조하거나 구매할 수 있다는 점입니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고순도 단백질을 준비하십시오. 280 nanometers에서의 흡광도를 측정하여 단백질 농도를 결정하십시오. 사용 직전에 단백질을 강하게 원심분리하여 불용성 단백질 응집체를 제거하십시오.용해도가 우려되는 경우, 원심분리 후 단백질 농도를 다시 측정하십시오. 다음으로, -80°C 냉동고에서 globular actin 또는 g-actin의 분취액을 꺼내어 빠르게 해동하십시오. G-actin에 10X 중합 버퍼(polymerization buffer)를 첨가하고 물로 희석하여 최종 농도를 1X로 맞추십시오.액틴이 중합될 수 있도록 혼합물을 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 중합 후, 중합된 필라멘트형 액틴(F-actin)을 4 °C에서 보관하며, 이 조건에서 수 주 동안 안정적으로 유지됩니다. 보관 후 F-actin을 사용하기 전에는 튜브를 가볍게 뒤집거나 톡톡 쳐서 모든 액틴이 용해되어 용액 내에 균일하게 분포되었는지 확인하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 관심 단백질의 F-actin 결합을 확립하십시오. F-actin 결합이 확립되면, 단백질을 연속 희석하여 테스트할 최종 농도의 2배 농도로 구성된 7~8개의 샘플 농도 시리즈를 만듭니다. 예를 들어, 테스트 범위가 0.1에서 8 µM인 경우, 마이크로 원심분리 튜브에 1X 반응 버퍼를 사용하여 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 및 0.2 µM 농도의 단백질 희석액을 준비하십시오.초원심분리 튜브 내의 1X 반응 버퍼를 사용하여 표적 단백질을 최종 농도로 희석합니다. 적절한 샘플에 F-actin을 첨가합니다. 그 후 모든 샘플을 실온에서 30분 동안 배양합니다.30분 후, 각 시료의 5분의 1을 취해 시료 버퍼와 혼합합니다. 이것들이 총 시료가 됩니다. 초원심분리기 시료 튜브를 로터에 장착하고 100,000 ×g, 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 각 튜브에서 상층액의 4분의 3을 제거하여 별도의 마이크로 튜브에 담고 4X 샘플 버퍼와 혼합합니다. 이것이 상층액 샘플이 됩니다. 펠릿이 손상되지 않도록 주의하며 겔 로딩 팁을 사용하여 남은 상층액을 제거합니다.그 다음, 모든 튜브에 1X 샘플 버퍼를 추가하고 실온에서 최소 5분 동안 배양합니다. 배양 후, p200 피펫 팁을 사용하여 튜브의 펠렛 부위를 지속적으로 씻어내며 샘플을 8~10회 트리튜레이션(trituration)합니다. 재현탁을 돕기 위해 트리튜레이션 과정 동안 피펫 팁으로 펠렛 위를 부드럽게 긁어줍니다.재현탁된 단백질을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 이것들이 펠렛 샘플입니다. 마지막으로, SDS page를 통해 총 샘플과 펠렛 샘플을 분석합니다.광범위하고 선형적인 범위에서 단백질 밴드 강도를 측정할 수 있는 이미징 시스템을 사용하여 코마시 블루 염색된 젤의 이미지를 획득합니다. alpha e catenin 호모다이머의 농도를 증가시키며 0.2 µM F-actin의 존재 하 또는 부재 하에서 배양하였습니다. 샘플을 원심분리하고 생성된 펠릿을 분석하였습니다.예상대로, alpha e catenin 호모다이머는 배경 값보다 높게 F-actin과 함께 공침전되었습니다. BSA는 음성 대조군으로 사용되었습니다. 결합된 단백질의 양을 정량화하고 이를 유리 단백질 양에 대해 도식화하여 상호작용의 친화도를 계산하였습니다.F-actin이 이미 중합되어 있는 경우, 이 기술은 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때 원심분리 후 상층액을 신속하게 제거하고 펠렛을 완전히 재현탁시키는 것이 매우 중요합니다. 모든 결합 실험과 마찬가지로 F-actin에 대한 결합이 포화되어야 하며, 순도와 F-actin의 값이 평탄기에 도달하는 것이 필수적입니다. 평탄기에 도달하지 않으면 정확한 결합 평형 상수를 계산할 수 없습니다.연구자가 인지해야 할 공동 침강 분석법(co-sedimentation assay)의 근본적인 한계가 있으며, 가장 중요한 점은 이 방법이 진정한 평형 상수를 생성하지 않으므로 낮은 친화도의 상호작용을 잘못 계산하거나 검출하지 못할 수 있다는 것입니다. 이러한 한계에도 불구하고, 공동 침강 분석법은 단백질이 F-actin에 결합하는지 여부를 결정하고 상호작용의 친화도를 측정하는 데 있어 접근성이 높고 효과적인 도구입니다.

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

단백질은 별개의 굴지 구속력이 모듈을 통해 filamentous 굴지 (F - 굴지)에 바인딩합니다. 이 비디오에서 우리는 굴지의 절차를 정기적으로 단백질이나 F - 굴지 바인딩 특정 도메인을 분석하는 데 사용되는 시험 관내 분석이다 공동 침전을 보여줍니다.

굴지 공동 침강 분석, F - 굴지에 바인딩 단백질의 분석

우리는 적용 레이블이없는 운동 특성을 통해 papain 여러 cystatin B로 돌연변이의 바인딩의 구조 - 기능 분석을위한 Biacore의 X100을 사용하여 단백질 상호 작용 분석. 보정이없는 농도 분석 (CFCA)는 표준 곡선을위한 필요없이 유지 바인딩 활동으로 단백질의 농도를 측정합니다. 우리는 CFCA의 운동 분석의 신뢰성을 증가하고 운동 상수가 안정적으로 재조합 단백질의 활동이 감소하더라도 확인할 수 있습니다 사용하는 농도의 확인을 보여줍니다.

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

이 비디오에서는 형광단 태그가 지정된 Shwachman-diamond syndrome(SBDS) 단백질과 신장 인자 유사 1 GTPase(EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 형광 이방성 기술에 대해 설명합니다. EFL1의 농도가 점차적으로 증가하는 SBDS 단백질을 배양할 때 이방성의 꾸준한 증가가 관찰되어 두 단백질 간의 성공적인 상호 작용을 나타냅니다.

Fluorescence Anisotropy-based Detection of Protein-Protein Interaction(단백질-단백질 상호작용의 형광 비등방성 기반 검출)

FtsZ의 중합은 박테리아 세포 분열에 필수적입니다. 이 보고서에서는 FtsZ 중합 활성을 모니터링하기 위한 간단한 프로토콜에 대해 자세히 설명하고 버퍼 조성의 영향에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 FtsZ 중합에 영향을 미치는 조절 단백질 또는 항균 약물과 FtsZ의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

이 프로토콜은 Rac1을 포함한 Rho-family GTPase에 대한 결합 파트너의 상대적 친화도를 비교합니다. 생체 내에서 Rac1 결합 단백질은 단일 결합 계면을 놓고 경쟁하며, 그 형태는 결합된 뉴클레오티드에 의해 결정됩니다. 뉴클레오티드는 중요하면서도 높은 가수분해 속도로 인해 실험적으로 제어하기 어렵습니다.

경쟁 분석법을 이용는 GTPase - 결합 단백질의 친화 비교

단백질 상호 작용은 세포의 기능의 핵심이다. 열량 및 분광 기술은 일반적으로 그 특성을하는 데 사용됩니다. 여기에서 우리는 Shwachman - 다이아몬드 증후군 (SBDS)에 돌연변이 단백질과 신장 인자 같은 1는 GTPase (EFL1) 사이의 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성을 설명합니다.

단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 도구로 형광 이방성

우리는 막 단백질 정제 및 재구성을 단일 크로마토그래피 단계에서 펩티디스크로 결합하는 방법을 제시합니다. 생체 측량 스캐폴드는 생체층 간섭측정을 통해 단백질-리간드 상호 작용의 직접 표면 부착 및 측정에 사용됩니다.

PeptiQuick, 간소화 된 단백질 결합 검정을 위한 생체 면역 펩티디스크에 막 단백질의 한 단계 통합

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질 성분을 사용하여 구슬 표면에 액틴 혜성을 생성하는 방법을 설명합니다. 이러한 시스템은 세포에서 발견되는 돌출 구조를 모방하고 단순화 된 방식으로 힘 생산의 생리적 메커니즘을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.

상업적으로 이용 가능한 단백질을 사용한 액틴 기반 운동성의 재구성

이 방법은 글루칸 포스파타제와 아밀로펙틴의 결합 친화도를 정량화하기 위한 렉틴 기반 시험관 내 침강 분석을 설명합니다. 이 공동 침강 분석은 글루칸 포스파타제 기질 결합을 측정하는 데 신뢰할 수 있으며 다양한 가용화된 글루칸 기질에 적용할 수 있습니다.

글루칸 포스파타제의 기질 결합을 측정하기 위한 Concanavalin A 기반 침강 분석

많은 본질적으로 무질서한 단백질은 수많은 세포 과정에 중요한 행동인 매우 역동적인 생체 분자 응축물의 형성에 관여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서, 우리는 살아있는 세포에 있는 생체 분자 응축물에서 단백질이 서로 상호 작용하는 동역학을 정량화하기 위한 단 하나 분자 화상 진찰 근거한 방법을 제시합니다.

생체 분자 응축물 내 단백질 상호 작용 역학의 단일 분자 측정

배우세요 F-actin에 결합하는 단백질을 공동 침강법으로 측정하는 방법을. 초고속 원심분리기를 사용하여 결합 친화도를 정량화하고 세포골격 상호작용을 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

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