June 23rd, 2017
이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 전혈 한 방울에서 호중구를 분리한 다음 단일 미세유체 장치를 사용하여 후속 화학주성 분석을 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 소량의 전혈을 사용하여 호중구 화학주성 분석을 수행하기 위한 코드를 제공합니다. 또한 연구자들이 면역 세포 이동과 관련된 생물학적 질문에 답하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.
이 기술의 주요 장점은 단일 미세유체 장치에 대한 화학주성 분석법의 통합입니다. 이를 통해 25분 안에 조립 및 분석할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 마스터 말두스를 준비합니다.
그런 다음 SU8 금형의 표면을 실란화하여 금형에서 PDMS가 쉽게 분리될 수 있도록 합니다. 다음으로, 플라스틱 비커에 PDMS 베이스 40g과 운반제 4g을 혼합합니다. 준비된 SU8 마스터 몰드를 페트리 접시에 넣고 혼합된 PDMS 용액을 몰드에 조심스럽게 붓습니다.
페트리 접시를 건조기에 넣고 진공 청소기를 적용하여 20분 동안 PDMS 용액의 가스를 제거합니다. 그런 다음 페트리 접시를 오븐에 넣고 섭씨 80도에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 베이킹 후 SU8 금형에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 잘라 떼어냅니다.
PDMS 슬래브를 잘라 개별 디바이스로 분리합니다. PDMS 장치를 다듬어 자석을 고정하기 위해 셀 로딩 포트 주위에 두 개의 벽을 만듭니다. 다음으로, 3mm 직경의 펀처를 사용하여 셀 로딩 포트를 펀칭합니다.
그런 다음 6mm 펀치로 전환하고 폐기물 배출구의 화학 물질 주입구 저장소를 제거합니다. 접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브 표면의 먼지를 제거합니다. 깨끗한 슬래브를 깨끗한 유리에 넣고 플라즈마 기계로 밀어 넣습니다.
3분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 그런 다음 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 높게 설정하십시오. 공기 밸브와 플라즈마를 부드럽게 조정하고 PDMS와 유리 슬라이드를 3분 동안 처리합니다.
완료되면 플라즈마 전원을 끄고 진공을 해제합니다. 핀셋을 사용하여 유리 슬라이드에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 꺼내고 즉시 PDMS 슬래브를 유리 슬라이드 위에 놓고 채널 구조를 아래로 향하게 하여 PDMS 슬래브를 부드럽게 눌러 유리에 접착한 다음 즉시 미세유체 채널을 탈이온수로 채웁니다. PDMS는 일반적으로 배리어 채널의 웰에서 피하기 위해 유리 기판에 가압되었습니다.
장치에서 탈이온수를 제거하고 배출구에서 100마이크로리터의 프리브로넥틴 용액을 추가합니다. 모든 채널이 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 3분 정도 기다립니다. 그런 다음 뚜껑이 있는 페트리 접시에 장치를 넣고 실온에서 한 시간 동안 배양합니다.
그런 다음 장치에서 피브로넥틴 용액을 제거하고 콘센트에서 100마이크로리터의 마이그레이션 배지를 추가합니다. 다시 3분 동안 기다렸다가 모든 채널이 마이그레이션 배지로 채워졌는지 확인합니다. 화학주성 실험에서 장치를 사용하기 전에 실온에서 장치를 한 시간 더 배양합니다.
10마이크로리터의 전혈을 1.5ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 항체 칵테일 2마이크로리터를 추가합니다. 그리고 호중구 분리 키트에서 2마이크로리터의 자성 입자를 넣고 튜브를 부드럽게 혼합하여 항체 태그가 지정된 세포를 자기적으로 라벨링합니다.
라벨 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 두 개의 작은 자기 디스크를 장치의 셀 로딩 포트 양쪽에 연결합니다. 장치의 모든 포트에서 매체를 흡인합니다.
그런 다음 라벨이 표시된 혈액 혼합물 2마이크로리터를 세포 로딩 포트에서 미세유체 장치로 천천히 피펫팅합니다. 미세유체 장치를 섭씨 37도의 온도 조절 현미경 스테이지에 놓습니다. 세포 도킹 영역에 충분한 호중구가 갇힐 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
다음으로, 100마이크로리터의 화학유인 용액과 100마이크로리터의 이동 배지를 두 개의 피펫터를 사용하여 지정된 입구 저장소에 추가합니다. 이것은 연속적인 층류 기반 화학 혼합에 의해 화학 인력 구배를 생성합니다. 화학유인물질은 FMLP와 같은 재조합 단백질 또는 COPD 환자의 가래 상등액과 같은 임상 샘플일 수 있습니다.
흐름이 안정화되면 채널에서 FitZ dextron gradient의 형광 이미지를 획득합니다. 그런 다음 온도 제어 현미경 스테이지 또는 기존 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 장치를 배양합니다. 배양 후 10배 대물렌즈를 사용하여 그래디언트 채널을 이미지화하여 데이터 분석을 위한 세포의 최종 위치를 기록합니다.
호중구는 자성 입자 항체 라벨링과 한 쌍의 자석을 사용하여 미세유체 장치에서 직접 전혈 한 방울에서 음성으로 선택됩니다. 온칩으로 분리된 호중구의 순도를 확인하기 위해 Giemsa 염색을 수행했습니다. 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보여줍니다.
셀 로딩 후, 도킹 구조는 화학적 그래디언트를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆에 셀을 효과적으로 정렬합니다. 화학적 구배에 15분 동안 노출되면 화학주성이 발생합니다. 그리고 이미징을 사용하여 측정할 수 있습니다.
이러한 결과는 15분 후 배지 제어 샘플에서 장벽 채널을 통해 기어다니는 세포가 거의 없음을 보여줍니다. 대조적으로, 많은 호중구는 장벽 채널을 통해 빠르게 이동하여 100나노몰 FMLP 구배로 이동했습니다. 일단 이것은 25 분 안에 우리에서 직접 화학 주성을 우편으로 보낼 수 있습니다.
이는 연구자들이 전체 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 그리고 임상 적용을 위한 도구입니다.
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이 기사는 전혈에서 호중구를 분리하고 단일 미세 유체 장치를 사용하여 화학주기성 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 과정의 통합을 통해 단지 25분 만에 신속한 분석이 가능해져 면역 세포 이동을 연구하는 연구자들에게 접근 가능합니다.
This all-on-chip method enables rapid neutrophil chemotaxis analysis directly from whole blood, addressing a key bottleneck in immunology and inflammation research. By integrating cell isolation and functional assay in a single microfluidic device within 25 minutes, it supports high-throughput screening of immunomodulatory compounds and patient-derived samples. The approach enhances predictive confidence in target validation for neutrophil-mediated diseases such as COPD, sepsis, and autoimmune disorders.
The method fits within the early discovery continuum, enabling rapid transition from target hypothesis to functional validation in immune cell migration assays.