Name: 혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: 배우세요 혈액 방울에서 호중구를 분리하고 단일 마이크로플루이딕 칩에서 화학 주 화성 분석을 수행하는 방법을. 25분 내에 결과를 얻을 수 있어 면역 세포 이동 연구에 효율적입니다.

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이 연구는 부분적으로 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC) 및 캐나다 보건 연구원 (CIHR)의 연구비 지원에 의해 지원됩니다. 위니펙의 빅토리아 종합 병원 (Victoria General Hospital)과 위니펙의 세븐 옥스 종합 병원의 임상 연구 및 응용 연구소 (Clinical Institute of Applied Research and Education)에 감사드립니다. Hagit Peretz-Soroka 박사에게 분석 작동 전략에 대한 도움이되는 토론에 감사드립니다. <style type="text/css">
</style> 워털루 대학교 (University of Waterloo)의 캐롤린 렌 (Carolyn Ren) 교수와 닥터 (Xiaoming, Cody) Chen 박사는 촬영 과정에서 관대 한 지원을 해주신 것에 대해 감사드립니다.

모든 인간 샘플 수집 프로토콜은 위니펙의 매니토바 대학 (University of Manitoba)의 공동 연구 교수 윤리위원회 (Joint-Faculty Research Ethics Board)의 승인을 받았습니다. 1. 미세 유체 장치 제작 ( 그림 1A ) <ol><li> 디자인 및 인쇄 투명 마스크. <ol><li> 이전에 자세히 설명한대로 장치를 설계하십시오. 그림 1A를 참조하십시오. 참고 :이 장치에는 두 개의 레이어가 있습니다. 첫 번째 층 (4 μm 높이)은 그라디언트 채널 옆의 셀을 트랩하는 셀 도킹 차단 채널을 정의합니다. 두 번째 층 (높이 60μm)은 기울기 생성 채널, 세포 로딩을위한 포트 및 채널, 화학 물질 유입구 저장소 및 폐기물 배출구를 정의합니다. 정렬 마크는 2 개의 층을 위해 설계된다. 두 번째 레이어의 경우, 업스트림 채널의 길이와 너비는 각각 60 mm와 200 μm입니다. 하류의 길이와 너비구불 구불 한 입력 채널은 각각 6 mm와 280 μm입니다. </li><li> 고해상도 프린터를 사용하여 투명 필름 마스크에 첫 번째 및 두 번째 레이어 피쳐를 인쇄합니다. 참고 : 인쇄 해상도는 디자인의 최소 기능에 따라 다릅니다. 현재 디자인에서 10μm 최소 피쳐에 대해 32,000dpi가 선택되었습니다. </li></ol></li><li> 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. <ol><li> 실리콘 웨이퍼를 플라즈마 세정기에 넣으십시오. 3 분간 진공을가한다. </li><li> 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 30 분 동안 실리콘 웨이퍼를 처리하기 위해 산소 플라즈마를 사용하십시오. </li><li> 플라즈마 세정 장치를 끄고 실리콘 웨이퍼를 꺼냅니다. 실리콘 웨이퍼는 디바이스 몰드를 제조 할 준비가된다. </li></ol></li><li> 클린 룸 시설에서 사진 석판 술을 사용하여 첫 번째 레이어를 제작하십시오. 참고 : 정확한 제조 매개 변수는 제조 시설에 따라 다를 수 있습니다. <ol><li> 10 mL SU-8 2025를 10 mL SU-8 2000을 유리 브레이커로 사용하여 설계된 포토 레지스트를 준비한다. 거품이 사라질 때까지 퓸 후드에 혼합물을 10 분 동안 두십시오. </li><li> 조심스럽게 적절한 척으로 스피너에 세척 된 실리콘 웨이퍼를 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼 중앙에 포토 레지스트 혼합물 3 mL를 붓습니다. 500rpm에서 5 초 동안 스핀합니다. 그런 다음 30 초 동안 3,000 rpm으로 회전시켜 실리콘 웨이퍼에 최종 4 μm 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻습니다. </li><li> 조심스럽게 스피너에서 실리콘 웨이퍼를 꺼내고 핫 플레이트에서 95 ° C로 4 분간 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬기에 놓고 UV 노출 시간을 6 초로 설정합니다. 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 첫 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다. </li><li> 부착 된 마스크가있는 투명 유리판을 정렬 장치에 천천히 올려 놓고 마스크를 실리콘 웨이퍼에 맞 춥니 다. 시를 드러내시오.licon 웨이퍼를 UV에 연결하여 셀 도킹 구조를 패턴 화합니다. </li><li> 조심스럽게 유리판을 제거하고 노출 된 실리콘 웨이퍼를 꺼내십시오. 95 ° C에서 4 분간 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 베이킹합니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 흄 후드에 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 30 초 동안 부드럽게 흔드십시오. </li><li> 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 이소 프로필 알콜 (IPA)을 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. 흄 후드 내부의 질소 가스로 실리콘 웨이퍼를 건조시킨다; 첫 번째 레이어가 준비되었습니다. </li></ol></li><li> 첫 번째 레이어에 두 번째 레이어를 만듭니다. <ol><li> 접착 테이프를 사용하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 덮으십시오. 조심스럽게 첫 번째 레이어와 함께 실리콘 웨이퍼를 스피너의 진공 척 위에 놓고 진공을 적용하여 실리콘 웨이퍼를 고정시킵니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼에 3 mL의 SU-8 2025 포토 레지스트를 붓습니다. 5 초 동안 500 rpm으로 실리콘 웨이퍼를 회전시킵니다. 그런 다음 2000 rpm으로 30 회전실리콘 웨이퍼 상에 최종 60㎛ 두께의 포토 레지스트 코팅을 얻는다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 조심스럽게 스피너에서 꺼내 핫 플레이트로 옮깁니다. 65 ° C에서 2 분간 구우십시오. </li><li> 부드럽게 접착 테이프를 제거하여 첫 번째 레이어의 정렬 표시를 노출하십시오. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 95 ° C에서 6 분 동안 베이킹합니다. </li><li> 조심스럽게 실리콘 웨이퍼를 마스크 정렬 장치에 놓고 UV 노출 시간을 18 초로 설정합니다. </li><li> 접착 테이프를 사용하여 투명 유리판에 두 번째 레이어의 투명 마스크를 조심스럽게 부착합니다. </li><li> 부착 된 마스크가있는 유리판을 조심스럽게 정렬 장치에 놓고 마스크와 정렬 장치의 검사 현미경을 사용하여 교차 정렬 표시로 실리콘 웨이퍼의 첫 번째 레이어를 정렬합니다. </li><li> 포토 레지스트 코팅 된 실리콘 웨이퍼를 UV에 노출시켜 셀 로딩 및 그래디언트 채널을 패턴 화하십시오. </li><li> 조심스럽게 유리판을 제거하고 실리콘을 꺼내십시오.어퍼. 실리콘 웨이퍼를 2 분 동안 65 ° C에서 핫 플레이트에 베이킹 한 다음 실리콘 웨이퍼를 다른 95 ° C 핫 플레이트로 옮기고 6 분 동안 베이킹합니다. </li><li> 실리콘 웨이퍼를 연기 후드로 옮기고 SU-8 개발자가 들어있는 유리 팬에 넣으십시오. 부드럽게 6 분 동안 이것을 흔드십시오. </li><li> 신선한 SU-8 현상액을 사용하여 흄 후드 내부의 IPA를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 청소하십시오. </li><li> 흄 후드 내부에 질소 가스를 사용하여 실리콘 웨이퍼를 건조시킵니다. 핫 플레이트에 실리콘 웨이퍼를 놓고 금형을 150 ° C에서 30 분 동안 하드 베이킹합니다. 두 번째 레이어가 준비되었습니다. </li></ol></li><li> 마스터 몰드 표면 수정. 참고 : silanization 표면 수정 단계는 soft-lithography에서 금형으로부터 PDMS (polydimethylsiloxane) 방출을 촉진하기 위해 SU-8 몰드에 적용됩니다. <ol><li> Micropipette tip에 트리 데카 플루오로 -1,1,2,2- 테트라 히드로 옥틸 (트리클로로 실란) 용액 10 μL를 넣습니다. 15 ML 플라스틱 튜브에 micropipette 팁을 넣어튜브의 캡을 느슨하게하십시오. </li><li> 튜브와 SU-8 패턴 실리콘 웨이퍼를 데시 케이 터 내부에 놓고 1 시간 동안 진공을가한다. 마스크 몰드는 PDMS 장치를 제조 할 준비가된다. </li></ol></li><li> PDMS 장치를 제작하십시오. <ol><li> 플라스틱 비커에 PDMS베이스 40g과 경화제 4g을 혼합하여 PDMS 솔루션을 준비하십시오. 페트리 접시에 준비 SU - 8 마스터 금형을 놓고 조심스럽게 금형에 44 g PDMS 솔루션을 부어. </li><li> 페트리 접시를 데시 케이 터에 넣고 20 분 동안 PDMS 용액을 탈기시키기 위해 진공을가하십시오. 그런 다음 페트리 접시를 오븐에 넣고 PDMS를 80 ° C에서 2 시간 동안 경화시킵니다. </li><li> 굽기 후에, 페트리 접시를 가지고 가고 청결한 벤치에 두십시오. 조심스럽게 자르고 SU - 8 곰팡이에서 PDMS 슬랩을 벗겨. </li><li> 직경 3mm의 펀처를 사용하여 셀로드 포트를 펀치 아웃합니다. 직경 6mm의 천공기를 사용하여 화학 물질 주입구 저장소와 폐기물 배출구를 펀치하십시오. </li><li> 에 먼지를 제거접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브의 표면 플라즈마 기계에 PDMS 슬래브와 깨끗한 유리 슬라이드를 놓습니다. 진공을 3 분 동안 적용하십시오. </li><li> 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 HIGH로 설정하십시오. 부드럽게 공기 밸브를 조정하고 3 분 동안 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드 plasmatreat. </li><li> 플라즈마 전원을 끄고 진공을 해제하십시오. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브와 유리 슬라이드를 꺼내십시오. </li><li> 유리 슬라이드 위에 PDMS 슬라브 (채널 구조가 아래를 향한 상태)를 즉시 놓습니다. 부드럽게 PDMS 슬래브를 눌러 유리에 접착시킵니다. 즉시 마이크로 유체 채널을 탈 이온수로 채 웁니다. 미세 유동 장치 제조 및 조립이 완료된다. </li></ol></li></ol> 2. Microfluidic 세포 이동 분석 준비 <ol><li> 미세 유체 장치 준비. <ol><li> 950에 재고 fibronectin 솔루션 (1 MG / ML)의 50 μL를 희석하여 50 μg / ML fibronectin 솔루션을 준비81; 바이오 안전성 캐비닛 내 Dulbecco의 인산염 완충 생리 식염수 (DPBS). </li><li> 로스웰 파크 기념 연구소 (Rotwe Park Memorial Institute) 배지 (RPMI-1640) 9 mL와 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)이 첨가 된 RPMI-1640 1 mL를 혼합하여 이동 배지를 준비합니다. </li><li> 장치에서 탈 이온수를 제거하십시오. </li><li> 콘센트에서 100 μL의 fibronectin 용액을 장치에 첨가하십시오. 모든 채널이 fibronectin 용액으로 채워지는지 3 분간 기다립니다. 덮인 페트리 접시에 microfluidic 장치를 실온에서 1 시간 놓습니다. </li><li> 장치에서 피브로넥틴 용액을 꺼냅니다. 콘센트에서 100 μL 이동 매체를 추가하십시오. 모든 채널이 이동 매체로 채워지는지 3 분간 기다리십시오. </li><li> 실온에서 1 시간 더 장치를 품는다; 장치는 화학 주성 실험을위한 준비가 완료됩니다. </li></ol></li><li> chemotaxis 실험을위한 chemoattractant 솔루션 준비. <ol><li> t에서 100 nM fMLP 용액 준비1mL 이동 매체. 1.5 ML 튜브 fMLP 솔루션 주식 ​​FITC - Dextran (10 kDa, 1 MM) 5 μL를 섞는다. 참고 : FITC-Dextran은 기울기 측정에 사용됩니다. 또는 그라디언트 표시기로 Rhodamine을 사용하십시오. fMLP 화학 유인 물질 용액은 화학 주성 실험을위한 준비가 완료되었습니다. </li></ol></li><li> Sputum 샘플 준비. 참고 : COPD 환자의 객담 검체로 유도 된 호중구 주 화성을이 올 온칩 방법의 임상 진단 응용으로 테스트했습니다. <ol><li> COPD 환자로부터 객담 샘플을 수집하기위한 인간 윤리 규약을 얻습니다. 참고 : 우리는 위니펙의 Seven Oaks General Hospital (매니토바 대학 승인)에서 샘플을 수집 할 수있는 승인을 받았습니다. </li><li> 모든 과목에서 정보에 근거한 서면 동의서를받습니다. </li><li> COPD 환자의 자발적 객담 샘플을 수집하십시오. 500 mL의 가래 샘플을 1.5 mL 튜브에 넣으십시오. </li><li> 500 μL 0.1 % 디 첨가thiothreitol을 1.5 mL 튜브에 넣고 부드럽게 섞는다. 튜브를 37 ° C의 수조에 15 분간 놓습니다. </li><li> 753 XG에서 10 분 동안 시료를 원심 분리 한 후 상등액을 수집한다. 상등액을 865 xg에서 5 분간 원심 분리하고 최종 상등액을 수집한다. 사용하기 전에 수집 된 상등액을 -80 ° C의 냉동고에 보관하십시오. </li><li> 주 화성 실험 준비가되었을 때, 객담 용액을 녹인다; 900 μL 이동 매체를 1.5 mL 튜브에 옮기고 바이오 안전성 캐비닛 안의 100 μL 가래 용액과 혼합하십시오. 가래 용액은 화학 주성 실험을 위해 준비된다. </li></ol></li><li> 혈액 샘플 수집. <ol><li> 건강한 기증자로부터 혈액 샘플을 채취하기 위해 인간 윤리 강령을 취득하십시오. 모든 헌혈자로부터 서면 동의서를받습니다. 참고 : 위니펙 빅토리아 종합 병원 (Winnipeg)의 샘플 (University of Manit의 공동 교수 연구 윤리위원회 승인)오바). </li><li> 정맥 천자에 의해 혈액 샘플을 수집하고 EDTA 코팅 튜브에 샘플을 넣으십시오. 실험 전에 튜브를 바이오 안전성 캐비닛에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 3. All-on-chip 화학 주성 분석 실험 <ol><li> 온칩 셀 분리 ( 그림 1B ). <ol><li> 바이오 안전성 캐비닛 안에 1.5 mL 튜브에 10 μL 전혈을 놓습니다. 참고 : 혈액 샘플 채취의 세부 사항은 2.4 절에 있습니다. </li><li> 호중구 격리 키트 (물질 표 참조)에서 2 μL 항체 칵테일 (Ab)과 2 μL 자성 입자 (MP)를 1.5 ML 튜브에 넣고 부드럽게 섞으십시오. 이것은 호중구를 제외한 혈액 세포를 표시합니다. </li><li> 상온에서 5 분간 혈액 - Ab - MP 혼합물을 품어. 참고 : 이것은 혈액 내 항체 표지 세포를 자기 적으로 표시합니다. </li><li> 두 개의 작은 자기 디스크를 셀 로딩 p의 양면에 부착하십시오.장치의 오르 트. 장치의 모든 포트에서 매체를 토출하십시오. </li><li> 세포로드 포트에서 microfluidic 장치로 천천히 피펫 2 μL 혈액 - Ab - MP 혼합물. 참고 : 자기 적으로 분류 된 세포는 호중구가 장치로 흘러 들어가고 세포 도킹 구조에 갇히게되는 동안 세포 로딩 포트의 측면 벽에 갇혀 있습니다. </li><li> 충분한 호중구가 세포 도킹 영역에 갇힐 때까지 몇 분간 기다립니다. </li></ol></li><li> 화학 주성 분석 ( 그림 1C ). <ol><li> 37 ° C에서 온도 제어 현미경 스테이지에 microfluidic 장치를 놓습니다. </li><li> 2 개의 피펫 터를 사용하여 지정된 입구 저장소에 100 μL 화학 유인 물질 용액 (fMLP 또는 가래 용액)과 100 μL 이동 매체를 첨가하십시오. 이것은 압력에 의해 보조되는 연속적인 층류 - 화학적 혼합에 의해 구배 채널에서 화학 유인 물질 구배를 생성 할 것이다균형 구조. 참고 : 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 가래 수집에 대한 자세한 내용은 2.3 절에 나와 있습니다. <ol><li> 배지 대조 실험의 경우, 유입 배지 모두에 이동 배지를 첨가하십시오. </li></ol></li><li> 그라디언트 채널에서 FITC-Dextran의 형광 이미지를 얻습니다. </li><li> &quot;File | Open&quot;명령을 사용하여 이미지를 ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다. </li><li> &quot;Analyze | Plot Profile&quot;명령을 사용하여 그라디언트 채널에서 형광 강도 프로파일을 측정합니다. </li><li> 추가 플로팅을 위해 측정 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다. </li><li> 온도 제어 현미경 스테이지 또는 15 분 전통적인 세포 배양 보육에서 장치를 품어. </li><li> 10X 대물 렌즈를 사용하여 데이터 분석을 위해 셀의 최종 위치를 기록하는 그래디언트 채널을 이미지화합니다. </li><li> 필요한 경우 시간 경과 현미경으로 장치에 세포 이동을 기록하십시오. </li></ol></li></ol> 4. 세포 이동 Data 분석 ( 그림 1C ) <ol><li> 아래 설명 된대로 도킹 구조에서 세포 이동 거리를 계산하여 주 화성 분석을 분석합니다. 그림 1C를 참조하십시오. </li><li> 이미지를 NIH ImageJ 소프트웨어로 가져옵니다 (버전 1.45). </li><li> 그라디언트 채널로 이동 한 각 셀의 가운데를 선택합니다. </li><li> 최종 위치에 대해 선택한 셀의 좌표를 측정합니다. 도킹 구조의 가장자리에있는 점의 좌표를 초기 참조 위치로 측정하십시오. </li><li> 측정 된 좌표 데이터를 스프레드 시트 소프트웨어 ( 예 : Excel)로 내 보냅니다. 셀의 이동 거리를 셀의 최종 위치와 그라디언트 방향을 따른 초기 참조 위치의 차이로 계산합니다. </li><li> 마이크로 미터까지의 거리를 보정하십시오. chemotaxis의 측정으로 모든 세포의 이동 거리의 평균과 편차를 계산합니다. </li><li> Mig 비교Student &#39;s t -test를 사용하는 배지 대조 실험에 대한 화학 자극기 기울기가있는 배양 거리. </li><li> 세포 이동의 시간 경과 이미지가 기록되면, 세포 이동 분석 및 chemotaxis는 세포 추적 분석 15 로 더 분석 할 수 있습니다. 참고 : all-on-chip chemotaxis assay를 만들고 수행하는 데 필요한 자료는 재료 표에 자세히 설명되어 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).</li>
<li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cells+in+motion%3A+migrating+toward+improved+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li>
<li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+trafficking+in+tissue+development%2C+growth%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132 (4), 612-630 (2008).</li>
<li>Condeelis, J., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cell+movement+in+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cell movement in tumours.</a> Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).</li>
<li>Kruger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%3A+between+host+defence%2C+immune+modulation%2C+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury.</a> PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).</li>
<li>Mócsai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+novel+functions+of+neutrophils+in+immunity%2C+inflammation%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond.</a> J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).</li>
<li>Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+navigation+and+the+combinatorial+control+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis.</a> J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).</li>
<li>Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-mediated+tumour+angiogenesis%3A+subversion+of+immune+responses+to+promote+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth.</a> Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).</li>
<li>Wu, J., Wu, X., Lin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+microfluidics-based+chemotaxis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies.</a> Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).</li>
<li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).</li>
<li>Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+microfluidic+gradient+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological applications of microfluidic gradient devices.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).</li>
<li>Irimia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+measuring+neutrophil+migratory+responses+to+fast+switches+of+chemical+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients.</a> Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).</li>
<li>Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+opposing+chemoattractant+gradients+using+microfluidic+chemotaxis+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices.</a> Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).</li>
<li>Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+decisions+during+neutrophil+chemotaxis+inside+bifurcating+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels.</a> Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+neutrophil+migration+patterns+during+sepsis+after+major+burns%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns.</a> PloS One. 9 (12), e114509(2014).</li>
<li>Butler, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+injury+reduces+neutrophil+directional+migration+speed+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices.</a> PloS One. 5 (7), e11921(2010).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+evaluating+neutrophil+chemotaxis+induced+by+sputum+from+COPD+patients%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients.</a> PloS One. 10 (5), e0126523(2015).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+kit-on-a-lid%3A+a+versatile+platform+for+neutrophil+chemotaxis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays.</a> Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).</li>
<li>Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+assay+from+a+drop+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration assay from a drop of blood.</a> Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24962731">Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Jones, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+precise+measurements+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+neutrophil+chemotaxis+in+whole-blood+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets.</a> J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).</li>
<li>Sackmann, E. K. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+asthma+from+a+drop+of+blood+using+neutrophil+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis.</a> P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547816500035">An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum.</a> Technology. 04 (02), 104-109 (2016).</li>
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이 논문에서는 호중구를 전혈에서 직접 분리하고 화학 주성 테스트를 단일 미세 유체 칩에 직접적으로 분리하는 상세한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 이 방법은 간편한 조작, 고순도 호중구의 부정적 선택, 신속한 샘플 - 결과 화학 주성 테스트, 감소 된 시약 및 샘플 소비 및 정확한 세포 이동 데이터 분석에서 유용한 기능을 제공합니다. 대략적으로, 입력 된 전체 혈액 샘플로부터의 호중구의 적어도 25 %가 장치의 도킹 구조에 효과적으로 들어가고, 우리는 칩식 Giemsa 염색에 의해 호중구 순도가 높다는 것을 발견했다. 이 개발 된 all-on-chip chemotaxis 분석 방법은 다양한 세포 이동 연구 및 임상 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법의 연구 응용은 배지에서의 호중구 주 화성을 fMLP 구배와 비교함으로써 입증되었다. 마찬가지로,이 방법은 COPD spu에서 호중구 화학 주성을 시험하는데 사용될 수있다임상 진단을위한 세포 기능성 바이오 마커를 개...

화학 주성은 용해성 화학 물질 농도 구배로 이동하는 세포 이동 과정으로 면역 반응 1 , 2 , 3 , 조직 발달 4 및 암 전이 5를 포함한 많은 생물학적 과정에 결정적으로 관여합니다. 호중구는 가장 풍부한 백혈구 하위 집합이며 신체의 타고난 숙주 방어 기능을 가능하게하고 적응 면역 반응을 중재하는 데 중요한 역할을합니다 6 , 7 . 호중구에는 고도로 조절 된 주 화성 기계가 장착되어있어이 운동성 면역 세포가 병원체에서 유도 된 화학 유인 물질 ( 예 : fMLP)과 호스트 유래 화학 유인 물질 ( 예 : 인터루킨 -8)을 통과 할 수 있습니다. 호중구의 이동과 주 화성은 다양한 생리 학적 문제를 매개한다.염증 및 암과 같은 질병 1 , 9 . 따라서, 호중구 주 화성의 정확한 평가는 호중구 생물학 및 관련 질병 연구에 중요한 기능적 판독을 제공한다. 널리 사용되는 기존의 chemotaxis assays ( 예 : transwell assay 10 )와 비교하여 microfluidic 장치는 정확하게 제어 된 화학 구배 생성 및 소형화로 인해 세포 이동 및 화학 주성의 정량적 평가에 큰 가능성을 보여줍니다 11 , 12 , 13 . 지난 20 년 동안 다양한 생물학적 세포 유형, 특히 호중구의 화학 주성을 연구하기 위해 다양한 미세 유체 장치가 개발되었습니다. Spatiotemporally complex che에서 호중구의 이동을 특성화하는데 많은 노력이 기울여졌다.<html> 마이크로 유체 장치 ( 14 , 15)에 구성된 미세 기울기를 나타낸다. 흥미로운 전략은 또한 microfluidic 장치를 사용하여 neutrophils에 의해 방향 결정을 연구하기 위해 개발되었습니다. 생물 학적 연구 이외에도, microfluidic 장치의 응용 프로그램은 질병 평가 17 , 18 , 19 임상 샘플을 테스트하기 위해 확장되었습니다. 그러나, 많은 미세 유체 장치의 사용은 전문 연구 기관에만 국한되어 많은 양의 혈액 샘플로부터 오랫동안 호중구를 분리해야합니다. 따라서, 신속한 호중구 주 화성 분석을위한 통합 마이크로 유체 장치를 개발하는 추세가있어왔다. 20 , 21 , 22 ,ef &quot;&gt; 23 , 24 . 이 방향으로, 단일 음향 소자에 자기 음성 호중구 정제와 후속 화학 주성 분석을 통합 한 all-on-chip 방법이 개발되었습니다 25 . 이 올 온칩 방법은 다음과 같은 새로운 특징을 가지고 있습니다. 1) 접착 기반 세포 포착이나 세포 크기 기반 필터링을 통해 혈액으로부터 호중구를 분리하는 이전의 온칩 전략과는 달리,이 새로운 방법은 높은 chemoattractant 자극에 chemotaxis 측정뿐만 아니라 전체 혈액의 소량에서 neutrophils의 고순도, 온 - 자기 분리, 2) 세포 도킹 구조는 화학 기울기 채널에 가까운 호중구의 초기 위치를 정렬하는 데 도움이되며 단일 세포 추적없이 간단한 화학 주성 분석을 가능하게합니다. 3) 호중구 격리와 chemot의 통합axis 분석은 실험 단계 사이에 중단이 없을 ​​때 25 분 안에 빠른 시료 - 결과 주 화성 분석을 가능하게합니다. 이 백서는이 온칩 주 화성 분석의 구성, 작동 및 데이터 분석 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 논문은 알려진 재조합 화학 주성분 및 복잡한 chemotactic 샘플을 환자에게 테스트 한 다음 호중구 화학 주 화성을 수행하기 위해 개발 된 방법을 효과적으로 사용하고 문제 해결 전략, 한계 및 향후 방향에 대한 토론을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Device fabrication</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mask aligner</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 세척기</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>진공 건조기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>디지털 스케일</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 더 얇은</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 포토레지스트</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 개발자</td><td>Microchem</td><td>SU-8 개발자</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>Silicon, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(트리데카플루오로-1,1,2,2-테트라하이드로옥틸) 트리클로로실란</td><td>겔레스트</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산 (PDMS)</td><td>엘스워스 접착제</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>커팅 패드</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>주문 제작</td></tr><tr><td>펀처</td><td>해당</td><td>없음 :</td><td>사용자 정의</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Source</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>On-chip cell isolation and chemotaxis assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>VWR</td><td>CACB356008</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>자기 디스크</td><td>인디고 기기</td><td>44202-1</td><td>직경 5mm, 두께 1mm 두께</td></tr><tr><td>FITC-덱스트란</td><td>시그마-알드리치</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>로다민</td><td> 시그마-알드리치</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa 염색 용액</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-U 반전 형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>현미경 환경 챔버.</td><td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

호중구의 이동과 주 화성은 우리 몸의 면역계에 중요합니다. 미세 유체 장치는 실시간 시각화, 화학 물질 농도 구배 생성의 정확한 제어, 시약 및 시료 소비 감소 등의 이점 때문에 호중구 이동 및 주 화성을 조사하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 최근에, 전체 혈액으로부터 직접적으로 통합되고 용이하게 작동되는 미세 유체 주 화성 분석 시스템을 개발하기위한 노력이 마이크로 유체 연구원에 의해 이루어졌다. 이 방향에서, 첫 번째 all-on-chip 방법은 작은 혈액량 샘플에서 호중구의 자기 음성 정화와 주 화성 분석을 통합하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 방법은 25 분 내에 신속한 시료 - 결과 호중구 주 화성 시험을 허용합니다. 본 백서에서는 문제 해결 전략, limi에 대한 토론과 함께 온칩 주 화성 분석을위한 상세한 구성, 작동 및 데이터 분석 방법을 제공합니다미래 방향. 이 all-on-chip 방법을 사용하여 정의 된 chemoattractant, N -Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) 및 만성 폐색 성 폐 질환 (COPD) 환자의 객담을 테스트하는 호중구 주 화성 분석의 대표 결과가 표시됩니다. 이 방법은 많은 세포 이동 관련 조사 및 임상 적용에 적용 가능합니다.

호중구는 미세 유체 장치에서 직접 한 방울의 전체 혈액에서 부정적으로 선택됩니다. 분리 된 호중구의 순도는 Giemsa 염색에 의해 확인되었으며, 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보였다 ( 그림 2A ) 25 . 이것은 소량의 전혈에서 고순도의 효과적인 칩 중성구 분리를 나타냅니다. 또한, 도킹 구조는 화학 구배 ( 그림 2B ) 25 를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆의 셀을 효과적으로 정렬 할 수 있습니다. 기울기 생성은 연속적인 층류 화학 약품 혼합을 기반으로하며, 흐름은 입구 및 출구 용액의 서로 다른 레벨로부터의 압력 차에 의해 유도됩니다...

이 기사에서는 전혈에서 온 칩 호중구 분리와 단일 마이크로 유체 칩의 화학 주성 테스트를 통합하여 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을 수행하는 자세한 방법을 제공합니다.

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

이 절차의 전반적인 목표는 전혈 한 방울에서 호중구를 분리한 다음 단일 미세유체 장치를 사용하여 후속 화학주성 분석을 수행하는 방법을 시연하는 것입니다. 이 방법은 소량의 전혈을 사용하여 호중구 화학주성 분석을 수행하기 위한 코드를 제공합니다. 또한 연구자들이 면역 세포 이동과 관련된 생물학적 질문에 답하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 단일 미세유체 장치에 대한 화학주성 분석법의 통합입니다. 이를 통해 25분 안에 조립 및 분석할 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 마스터 말두스를 준비합니다.그런 다음 SU8 금형의 표면을 실란화하여 금형에서 PDMS가 쉽게 분리될 수 있도록 합니다. 다음으로, 플라스틱 비커에 PDMS 베이스 40g과 운반제 4g을 혼합합니다. 준비된 SU8 마스터 몰드를 페트리 접시에 넣고 혼합된 PDMS 용액을 몰드에 조심스럽게 붓습니다.페트리 접시를 건조기에 넣고 진공 청소기를 적용하여 20분 동안 PDMS 용액의 가스를 제거합니다. 그런 다음 페트리 접시를 오븐에 넣고 섭씨 80도에서 2시간 동안 PDMS를 경화시킵니다. 베이킹 후 SU8 금형에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 잘라 떼어냅니다.PDMS 슬래브를 잘라 개별 디바이스로 분리합니다. PDMS 장치를 다듬어 자석을 고정하기 위해 셀 로딩 포트 주위에 두 개의 벽을 만듭니다. 다음으로, 3mm 직경의 펀처를 사용하여 셀 로딩 포트를 펀칭합니다.그런 다음 6mm 펀치로 전환하고 폐기물 배출구의 화학 물질 주입구 저장소를 제거합니다. 접착 테이프를 사용하여 PDMS 슬래브 표면의 먼지를 제거합니다. 깨끗한 슬래브를 깨끗한 유리에 넣고 플라즈마 기계로 밀어 넣습니다.3분 동안 진공 청소기를 적용합니다. 그런 다음 플라즈마 전원을 켜고 레벨을 높게 설정하십시오. 공기 밸브와 플라즈마를 부드럽게 조정하고 PDMS와 유리 슬라이드를 3분 동안 처리합니다.완료되면 플라즈마 전원을 끄고 진공을 해제합니다. 핀셋을 사용하여 유리 슬라이드에서 PDMS 슬래브를 조심스럽게 꺼내고 즉시 PDMS 슬래브를 유리 슬라이드 위에 놓고 채널 구조를 아래로 향하게 하여 PDMS 슬래브를 부드럽게 눌러 유리에 접착한 다음 즉시 미세유체 채널을 탈이온수로 채웁니다. PDMS는 일반적으로 배리어 채널의 웰에서 피하기 위해 유리 기판에 가압되었습니다.장치에서 탈이온수를 제거하고 배출구에서 100마이크로리터의 프리브로넥틴 용액을 추가합니다. 모든 채널이 피브로넥틴 용액으로 채워질 때까지 3분 정도 기다립니다. 그런 다음 뚜껑이 있는 페트리 접시에 장치를 넣고 실온에서 한 시간 동안 배양합니다.그런 다음 장치에서 피브로넥틴 용액을 제거하고 콘센트에서 100마이크로리터의 마이그레이션 배지를 추가합니다. 다시 3분 동안 기다렸다가 모든 채널이 마이그레이션 배지로 채워졌는지 확인합니다. 화학주성 실험에서 장치를 사용하기 전에 실온에서 장치를 한 시간 더 배양합니다.10마이크로리터의 전혈을 1.5ml 튜브에 넣습니다. 그런 다음 항체 칵테일 2마이크로리터를 추가합니다. 그리고 호중구 분리 키트에서 2마이크로리터의 자성 입자를 넣고 튜브를 부드럽게 혼합하여 항체 태그가 지정된 세포를 자기적으로 라벨링합니다.라벨 혼합물을 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 두 개의 작은 자기 디스크를 장치의 셀 로딩 포트 양쪽에 연결합니다. 장치의 모든 포트에서 매체를 흡인합니다.그런 다음 라벨이 표시된 혈액 혼합물 2마이크로리터를 세포 로딩 포트에서 미세유체 장치로 천천히 피펫팅합니다. 미세유체 장치를 섭씨 37도의 온도 조절 현미경 스테이지에 놓습니다. 세포 도킹 영역에 충분한 호중구가 갇힐 때까지 몇 분 정도 기다립니다.다음으로, 100마이크로리터의 화학유인 용액과 100마이크로리터의 이동 배지를 두 개의 피펫터를 사용하여 지정된 입구 저장소에 추가합니다. 이것은 연속적인 층류 기반 화학 혼합에 의해 화학 인력 구배를 생성합니다. 화학유인물질은 FMLP와 같은 재조합 단백질 또는 COPD 환자의 가래 상등액과 같은 임상 샘플일 수 있습니다.흐름이 안정화되면 채널에서 FitZ dextron gradient의 형광 이미지를 획득합니다. 그런 다음 온도 제어 현미경 스테이지 또는 기존 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 장치를 배양합니다. 배양 후 10배 대물렌즈를 사용하여 그래디언트 채널을 이미지화하여 데이터 분석을 위한 세포의 최종 위치를 기록합니다.호중구는 자성 입자 항체 라벨링과 한 쌍의 자석을 사용하여 미세유체 장치에서 직접 전혈 한 방울에서 음성으로 선택됩니다. 온칩으로 분리된 호중구의 순도를 확인하기 위해 Giemsa 염색을 수행했습니다. 결과는 호중구의 전형적인 고리 모양과 엽 모양의 핵을 보여줍니다.셀 로딩 후, 도킹 구조는 화학적 그래디언트를 적용하기 전에 그래디언트 채널 옆에 셀을 효과적으로 정렬합니다. 화학적 구배에 15분 동안 노출되면 화학주성이 발생합니다. 그리고 이미징을 사용하여 측정할 수 있습니다.이러한 결과는 15분 후 배지 제어 샘플에서 장벽 채널을 통해 기어다니는 세포가 거의 없음을 보여줍니다. 대조적으로, 많은 호중구는 장벽 채널을 통해 빠르게 이동하여 100나노몰 FMLP 구배로 이동했습니다. 일단 이것은 25 분 안에 우리에서 직접 화학 주성을 우편으로 보낼 수 있습니다.이는 연구자들이 전체 세포 이동의 메커니즘을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 그리고 임상 적용을 위한 도구입니다.

an-all-on-chip-method-for-rapid-neutrophil-chemotaxis-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

이 동영상은 all-on-chip 방법을 사용한 호중구 화학주성 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 면역자기 음성 선택에 의해 전혈에서 호중구를 직접 분리한 후 미세유체 칩에서 화학주성 분석을 수행할 수 있습니다.

전혈을 이용한 신속한 호중구 화학요법 분석을 위한 미세유체 칩 기반 방법

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

호중구의 부착을 정량하는 방법이보고되어있다. 이 방법은 혈관에서 발생 된 것과 유사한 동적 흐름 환경을 생성한다. 그것은 허용 정제 부착 분자 (리간드) 또는 투명 스트레스 생체 환경 유사한 맥락에서 내피 세포 기질 (HUVEC) 중 하나에 호중구 부착 조사.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

카메라 화학 주성 분석 화학 주성은 매개 세포 이동 방향을 제어하는​​ 방법에 진핵 세포의 이해에 필수적이다. 1) 실시간 다중 화학 주성 분석법 고해상도 모니터링 및 2)에 동시에 화학 유인 그라데이션 시각화 및 호중구와 같은 HL60 세포의 이벤트 신호의 시공간 역학 : 여기서는 대한 구체적인 방법을 설명한다.

이미징 G의 호중구와 같은 HL60 세포에서 화성과 시그널링 이벤트 수용체가 매개 단백질 결합

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

이 프로토콜은 공간적으로 제어된 호중구 무리를 제공하는 생체 입자 마이크로어레이를 생성합니다. 그것은 호중구가 마이그레이션 하는 동안 해제 하는 중재자에 쉽게 액세스를 제공 하 고 정량적 이미징 분석을 허용 합니다.

생체 외에서 인간 호중구 떼의 화학 및 분자 분석을 위한 생체 입자 미세어레이

여기에서, 우리는 향상된 화학탁증 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 목표는 전통적인 세균 화학 요법 방법의 단계와 비용을 줄이고 식물 미생물 상호 작용을 이해하는 데 중요한 자원역할을하는 것입니다.

루트 엑수데이트에서 뿌리 균 화학 물질의 신속 한 식별에 대 한 향상 된 화학 분석

이 프로토콜은 다양한 신호 전달 경로의 기능을 포괄하는 스크리닝 방법으로 사용되는 호중구 기능 분석 세트를 특징으로 합니다. 이 프로토콜에는 세포 생존율, 순도, 활성 산소 종 생산, 실시간 이동, 식세포작용 및 호중구 세포외 트랩에 대한 예비 제안에 대한 초기 및 간단한 평가가 포함됩니다.

호중구 기능에 대한 간략한 개요를 위한 일련의 스크리닝 기법

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

배우세요 혈액 방울에서 호중구를 분리하고 단일 마이크로플루이딕 칩에서 화학 주 화성 분석을 수행하는 방법을. 25분 내에 결과를 얻을 수 있어 면역 세포 이동 연구에 효율적입니다.

혈액 방울로부터의 신속한 호중구 화학 주 화성 분석을위한 올 온칩 (all-on-chip) 방법

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