근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거

본 실험 절차의 전체적인 목표는 근육 조직을 액체 질소에 직접 침전시켜 동결 아티팩트를 제거하면서 냉동시키는 것입니다. 제 연구실의 학생인 Maozhang He가 Yizhong Huang과 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 각 극저온 보관 튜브에 샘플 식별 정보를 표시하십시오.

그런 다음, 액체 질소 탱크, 보안경 또는 안면 보호구, 냉동 장갑, 10cm 포셉, 25cm 핀셋 등 다음과 같은 장비를 준비하십시오. 또한, 스티로폼 아이스박스, 플라스틱 필름, 메스 및 A4 PVC 바인더 커버를 준비합니다. 근육 샘플을 준비하려면 먼저 아이스박스에 액체 질소를 채우십시오.

검체를 얻은 후 5분 이내에, 샘플을 A4 PVC 바인더 커버 위에 조심스럽게 올려놓고 근섬유의 방향을 관찰합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 근섬유 방향을 따라 검체에 약 3cm 길이로, 간격은 0.6cm가 되도록 두 개의 평행한 절개를 가합니다. 절개된 근육을 가로 약 0.6cm, 세로 0.6cm, 길이 1.5cm의 직사각형 모양으로 다듬습니다.

그 다음, 10cm 포셉을 사용하여 절개된 근육의 장축이 플라스틱 필름의 긴 가장자리와 평행하도록 샘플을 필름 위에 조심스럽게 놓습니다. 라벨이 부착된 극저온 보관 튜브의 하단 중앙, 입구 구멍 사이에 근육 조직을 넣고 튜브 캡을 단단히 닫습니다. 조직 샘플을 동결시키기 위해, 25cm 핀셋을 사용하여 예냉된 스티로폼 쿨러 내의 액체 질소에 극저온 보관 튜브 전체를 빠르게 담그고, 액체 질소가 더 이상 끓지 않을 때까지 기다립니다.

액체 질소는 크라이오바이알 전체를 잠기게 할 수 있을 만큼 충분해야 하며, 크라이오바이알이 액체 수면 아래에 완전히 잠겨야 합니다. 근육 샘플을 액체 질소 보관 탱크 또는 80 °C 냉동고로 옮겨 장기 보관하십시오. 냉동된 근육이 상온의 용기 또는 기구와 우발적으로 접촉하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.

슬라이드를 준비하려면, 크라이오스탯을 20 °C에서 22 °C 사이로 사전 냉각하십시오. 기존의 마이크로톰 칼날을 제거하여 폐기하고, 크라이오스탯 내의 나이프 홀더와 안티롤 플레이트를 닦아냅니다. 그런 다음, 크라이오스탯에 새 마이크로톰 칼날을 장착하고 절편 두께를 8 µm로 설정하십시오.

근육 샘플이 들어있는 극저온 보관 용기를 액체 질소 저장 탱크 또는 -80°C 냉동고에서 꺼내어 액체 질소 또는 드라이아이스 위에 둡니다. 그 다음 샘플을 크라이오스탯(cryostat)으로 옮기고, 검체가 크라이오스탯의 온도와 평형을 이룰 때까지 30분 동안 기다립니다. OCT를 사용하여 샘플을 포매한 후, 검체 홀더에 샘플을 장착합니다.

그 후, 8µm 두께로 절편을 제작합니다. 상온의 마이크로 슬라이드 중앙 부분에 절편을 부착합니다. 슬라이드를 즉시 슬라이드 보관함에 넣습니다.

그런 다음, 슬라이드 상자를 -80 °C 냉동고에 넣습니다. 슬라이드가 상온에서 마르지 않도록 하십시오. 여기에서 볼 수 있듯이, 돼지의 longissimus dorsi 근육 샘플을 -80 °C 냉동고에 직접 넣었을 때 얼음 결정이 형성되었으며, 이는 근육 냉동 절편에서 잘 알려진 스위스 치즈 효과(Swiss cheese effect)를 유발했습니다.

근육 조직을 액체 질소에 직접 담갔을 때도 얼음 결정이 형성되었습니다. 다른 방법을 사용하여 조직을 적절한 방향으로 OCT 매립제에 담근 후 이소펜탄 슬러리로 급속 냉동시켰을 때, 근섬유의 세포질 구획에서 많은 바늘 모양의 얼음 결정이 형성되었습니다. 다공성 크라이오바이알(multi-hole cryovial)에 조직을 냉동하면 세포질 구획이 뚜렷하게 보이고 근섬유가 주변 조직에 밀착되어 표본의 무결성이 매우 우수하게 유지됩니다.

이 방법을 사용하여 속근 및 지근 섬유의 ATPase 활성을 분석하였습니다. 동일한 시간 동안 반응시켰을 때, 속근 섬유는 2단계의 밝은 색으로 나타나며, 지근 섬유는 검은색으로 나타납니다. 여기에 제시된 표준 동결법에서는 근육 조직을 OCT 마운팅 매질과 직접 접촉하지 않은 상태에서 이소펜탄 슬러리에 침지시켰으나, 이소펜탄의 고체-액체 슬러리 상태를 1시간 이상 유지하기는 어려우며 이소펜탄을 항상 사용할 수 있는 것도 아닙니다.