근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거

이 절차의 전반적인 목표는 근육 조직을 액체 질소에 직접 주입하여 동결시키는 동시에 동결 아티팩트를 제거하는 것입니다. 제 연구실의 학생인 Maozhang He는 Yizhong Huang과 함께 이 절차를 시연할 것입니다. 시작하려면 각 극저온 바이알의 시료 ID에 라벨을 붙입니다.

그런 다음 액체 질소 탱크, 보안경 또는 안면 보호대, 냉동고 장갑, 10cm 집게 및 25cm 핀셋과 같은 장비를 정리하십시오. 또한 스티로폼 쿨러, 플라스틱 필름, 메스 및 A4 PVC 바인딩 커버를 정리하십시오. 근육 샘플을 준비하려면 먼저 쿨러에 액체 질소를 채우십시오.

검체를 채취한 후 5분 이내에 샘플을 A4 PVC 바인딩 커버 조각에 부드럽게 놓고 근육 섬유의 방향을 관찰합니다. 그런 다음 메스를 사용하여 길이가 약 3cm, 0.6cm 떨어진 근육 섬유 방향으로 표본을 통해 두 개의 평행 절개를 만듭니다. 절개된 근육을 너비 약 0.6cm, 높이 0.6cm, 길이 1.5cm의 직사각형으로 자릅니다.

그런 다음 10cm 집게를 사용하여 절개 된 근육의 세로 축이 필름의 긴 가장자리와 평행 한 플라스틱 필름 조각에 샘플을 부드럽게 놓습니다. 근육 조직을 라벨이 붙은 극저온 바이알의 하단 중앙, 입구 구멍 사이에 놓고 바이알을 단단히 닫습니다. 조직 샘플을 동결하려면 25cm 핀셋을 사용하여 사전 냉각된 스티로폼 냉각기에 전체 극저온 바이알을 액체 질소에 빠르게 담그고 액체 질소가 더 이상 끓지 않을 때까지 기다립니다.

액체 질소는 전체 cryovial을 담글 수 있도록 적절해야 하며 극저온 바이알은 완전히 액체 수준보다 낮아야 합니다. 근육 샘플을 액체 질소 저장 탱크 또는 장기 보관을 위해 섭씨 80도의 냉동고로 옮깁니다. 얼어붙은 근육과 실온의 용기 또는 기구 사이의 우발적인 접촉을 피하는 것이 중요합니다.

슬라이드를 준비하려면 저온 유지 장치를 섭씨 20도에서 22도 사이로 예냉각하십시오. 오래된 마이크로톤 블레이드를 제거하여 버리고 저온 유지 장치의 나이프 홀더와 롤 방지 플레이트를 닦습니다. 그런 다음 저온 유지 장치에 새 마이크로톤 블레이드를 설치하고 절단 두께를 8마이크로미터로 설정합니다.

액체 질소 저장 탱크 또는 섭씨 80도 냉동고에서 근육 샘플이 포함된 극저온 바이알을 제거하고 액체 질소 또는 드라이아이스에 넣습니다. 그런 다음 샘플을 저온 유지 장치로 옮기고 검체가 저온 유지 장치의 온도와 평형을 이룰 때까지 30분 동안 기다립니다. OCT를 사용하여 샘플을 삽입한 후 샘플을 표본 홀더에 장착합니다.

그런 다음 8개의 마이크로미터 섹션을 자릅니다. 실온 마이크로 슬라이드의 중앙을 향해 섹션을 장착합니다. 즉시 슬라이드를 슬라이드 상자에 넣습니다.

그런 다음 슬라이드 상자를 섭씨 80도의 냉동고에 넣습니다. 슬라이드를 실온에서 건조시키지 마십시오. 여기에서 볼 수 있듯이, 돼지의 롱기시무스 도르시 근육 샘플을 섭씨 80도의 냉동고에 직접 넣었을 때 얼음 결정이 형성되었으며, 이는 근육 동결 절편에 잘 알려진 스위스 치즈 효과를 일으켰습니다.

얼음 결정은 근육 조직을 액체 질소에 직접 담글 때도 형성되었습니다. 또 다른 방법을 사용하여 조직을 OCT 장착 매체에 적절한 방향으로 담근 다음 이소펜탄 슬러리에서 빠르게 동결했을 때 근섬유의 세포질 구획에 많은 바늘 모양의 얼음 결정이 형성되었습니다. 조직을 다중 홀 cryovia로 동결하면 명확하게 보이는 세포질 구획과 주변 조직에 대한 근섬유의 긴밀한 부착으로 우수한 표본 무결성을 얻을 수 있습니다.

이 방법을 사용하여 빠르게 수축하는 근육 섬유와 느리게 수축하는 근육 섬유에서 ATPase 활성을 분석했습니다. 등가 시간이 주어지면 빠르게 수축하는 섬유는 2도로 가볍게 나타나고 느리게 수축하는 섬유는 검은색으로 나타납니다. 여기에 표시된 표준 동결 방법에서는 근육 조직을 OCT 장착 매체와 직접 접촉하지 않고 이소펜탄 슬러리에 담갔지만 이소펜탄의 고체 액체 슬러리 상태는 1시간 이상 유지하기 어렵고 이소펜탄을 항상 사용할 수 있는 것은 아닙니다.