Name: 근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 학습하세요 근육 조직을 액체 질소에 직접 침지하여 결빙 인공물을 제거하는 방법을. 다중 홀 크라이오바이알을 사용하면 질소 가스의 담요 효과를 방지하여 생물학적 샘플 보존을 개선할 수 있습니다.

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이 프로젝트는 중국 국가 자연 과학 재단 (NSFC)에 의해 지원되었다 : 31301950 및 31671288입니다.

현재의 방법은 확립 수확하고 실험실에서 조직 학적 염색법 1,000 근육 샘플들을 저장하는 검증되었다. 동물의 관리 및 사용과 관련된 모든 절차는 중국의 농업의 교육부에 의해 설립 된 지침을 따랐다. 샘플 수집 1. 장비 <ol><li> 각 극저온 유리 병에 샘플 ID를 레이블. 참고 : 극저온 병은 특별히 동결 절단 (Cryosections) 절차 (그림 1A)에 대한 신선한 조직 샘플을 동결하도록 설계되었습니다. 바이알 금형 공장 (도 1C)에 폴리 프로필렌으로 제조된다. </li><li> 적절한 액체 질소 탱크에 액체 질소, 보안경 또는 안면 쉴드, 냉동기 장갑 10 개 cm 집게 25 개 cm 핀셋, 스티로폼 쿨러 (내부 치수 : 길이 20cm × 12 cm x 세로 135 cm 높이 아래의 장비를 구하는 ; 외형 치수 : 폭 X 15cm 상위 24 cm × 16 cm 길이), 플라스틱 필름 (폭 0.1 mm 두께 X 2.5 cm X 0.8 cm 길이)메스와 A4 PVC 바인딩 커버 (21cm X 29.5 cm) (도 1b). </li></ol> 근육 샘플의 제조 2 <ol><li> 앞서 시료 채취의 액체 질소로 5 분 스티로폼 쿨러를 채운다. 참고 : 액체 질소의 일부가 떨어져 종기와 신선한 샘플을 터치하면 가스로 전환하기 때문에 액체 질소의 큰 열이 필수적이다. 손실을 보충하기 위해 액체 질소의 전송의 빈도를 감소시키기 위해, 적절한 크기의 스티로폼 냉각기 샘플의 수에 따라 미리 획득해야한다. </li><li> 검체가 획득되면, 부드럽게 A4 PVC 결합 덮개의 부분에 배치하고, 근육 섬유의 방향을 관찰한다. 참고 : 여기, 우리는 돼지의 마지막 허리 뼈에 처음부터 등심의 도리스 근육의 단면을 사용했다. 시편은 약 12cm, 길이 8cm, 폭과 5cm 높다. </li><li> 시편 난을 통해 두 개의 평행 한 절개를 만들기 위해 메스를 사용하여N 근육 섬유의 방향, 길이 약 3 cm 및 0.6 cm 이격. 약 0.6 cm x 세로 0.6 cm X 1.5 cm 높이 긴 사각형으로 절개 근육 낸다. 주 : 근육 섬유의 단면적을 측정의 신뢰도는 주로 근육 절개의 섬유 배향에 의존한다. </li><li> 부드럽게 막 (도 2A)의 긴 에지에 평행 한 절개 근육의 종축과, 플라스틱 필름의 조각에 시료를 넣어 10cm 집게를 사용한다. 주 : 근육 섬유의 배향 인해 급속 동결을 시료에 균열을 방지하는 접착 기능을 고정하는 데 도움이 유지 기능 : 플라스틱 필름은 두 가지 기능을 갖는다. </li><li> 집게를 사용하여, 단지 미소 구멍 사이 표지 저온 바이알의하면 중앙으로 근육 조직을 배치하고 단단히 바이알 (도 2B)를 모자. </li></ol> 3. 냉동 및 보관 근육 샘플에스 <ol><li> 25cm 핀셋을 사용하여, 신속하게 액체 질소 (약 10-20 S)를 비등하지 않을 때까지 기다리고, 예비 냉각 스티로폼 쿨러에서 액체 질소의 전체 저온 바이알 잠수함. 참고 : 액체 질소가 끓는 때 cryovial이 너무 신중하게 10 ~ 20 초 동안 끓는 액체 질소의 병을 담가 떠. </li><li> 액체 질소 저장 탱크 또는 장기간 저장을 위해 -80 ° C에 냉동 근육 시료를 옮긴다. </li></ol> 4. 슬라이드 제조 <ol><li> -20 ℃ 및 -22 ° C의 사이에 저온 유지 장치를 사전 냉각. </li><li> 제거 이전 마이크로톰 블레이드 폐기의 저온 유지 장치에서 나이프 홀더 티롤 판을 닦아 저온 유지 장치에서 새 마이크로톰 블레이드를 설치하고, 8 μm의 절삭 두께를 설정. </li><li> 액체 질소 저장 탱크로부터 저온 바이알에서 근육 샘플을 전송 또는 -80 ° C에 냉동 저온 유지 장치로, 액체 질소 나 드라이 아이스에 반송. </리&gt; <li> 시료는 저온 유지 장치의 온도와 평형화 30 분을 기다린다. 참고 : 높은 온도가 시편에서 얼음 결정의 형성을 일으킬 수 있기 때문에 표본을 만지지 수있는 장비는 사전 냉각해야합니다. </li><li> 수용성 글리콜 및 수지 OCT ()의 최적 절단 온도 제제 하에서 시험편 홀더에 샘플을 탑재. 8 μm의 단면을 절단. 주 : CSAF 근육 섬유의 단면적이기 때문에, 근육 섬유의 방향에 대해 수직으로 절단 각도를 조정한다. </li><li> 방 온도하는 마이크로의 중심을 향해 절을 마운트합니다. 즉시 -80 ° C 냉장고에 슬라이드 상자에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 RT에서 건조하는 것을 허용하지 않습니다. </li></ol>

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</ol>

관심 없음 충돌은 금융 또는 다른 저자에 의해 선언되지 않습니다.

여기서는 동결 근육 기능의 조직 학적 평가를 수행하는 근육 조직을 저장하는 새로운 다공 cryovial을 설명한다. 이 프로토콜의 핵심 변성 단계는 다공 cryovial의 샘플은 직접 액체 질소에 침지된다는 점이다. 우리의 지식에, 이것은 기존의 동결 방법 중 근육의 냉동 절편 우수한 냉동 샘플 (대표 결과를 참조)를 얻을 수있는 간단하고 rapidest 방법입니다. 근육 연구자들이 직면 한 기술적 과제는 얼음 결정이 절편을 위해 근육 조직을 강화하는 수단으로 동결 사용할 때 형성 할 가능성이 있다는 것입니다. 대표 결과에서 언급 한 바와 같이, 세 가지 요소는 적절한 차가운 소스를 선택하는 시료의 수분을 최소화하고 차가운 소스와 접촉 전체 표면의 비율을 증가 포함한 병리학 적 연구에 대한 적절한 근육 동결을 결정하는데 중요한 역할을한다. 먼저,동결의 비율은 절편의 냉동 조직의 준비 기간 동안 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 동결이 느린 경우 큰 얼음 결정이 세포 외로 형성...

골격 근육은보기의 영양 및 처리 지점에서 고기를 생산하는 동물의 가장 중요한 구성 요소입니다. 근육 성장의 효율성과 결과 고기의 품질 : 육류 산업에서,이 개 특히 중요한 측면이있다. 근육의 주성분으로, 근육 섬유 성장 성능과 동물 1 신선한 고기의 품질에 직접적으로 관련이 있습니다. 예를 들어, 섬유의 총 수 (TNF)와 섬유의 단면적 (CSAF)은 주로 근육 질량과 고기의 품질을 결정; 또한, 섬유 유형 구성 (FTC)가 강하게 신선한 고기의 품질이 영향을 미칩니다. 따라서, 동물의 근육 섬유 특성의 조작은 코어 수익성 농장 1의 경쟁력을 높이기 위해 매우 효과적인 방법이다. 지금까지 여러 가지 고유 및 외부 요인은 근육 섬유 characterist를 조작 확인 된ICS 1. 이 조작은 돼지 5 소 3 미오 스타틴 유전자 양 4의 Callipyge 유전자 및 RYR1 IGF2 유전자와 같은 특정 유전자와 동물의 대상 선택을 통해 달성 될 수있다. 또한, 다이어트 제어 및 특정 호르몬 치료는 근육 섬유의 특성 (6)에 중요한 역할을한다. 따라서, 유전 및 영양 요소를 결합하는 방법은 살코기의 내용과 고기의 품질을 향상시킬 수 있습니다. 근육 섬유의 구조의 해명은 여전히 ​​도전이기 때문에, 근육 섬유에 대한 연구는 육류 산업에 제한됩니다. 근섬유 특성 등 미오신 triphosphatase 아데노신 (ATP 아제) 조직 화학 분석과 같은 방법을 사용하여 식별된다. 이 방법의 냉동 (6-8 μm의) 얇은 섹션에있는 효소는 사실에 의존근육 섬유는 화학적으로 특정 제품에 반응 할 수있다. 단, 근육의 수분 함량은 위치에 관계없이 (즉, 뒤, 복부 또는 뒷다리) (7), 돼지, 토끼, 마우스 및 인간의 75 % 이상이다. 이전에 8, 9를 설명한 바와 같이, 저온부의 준비 과정 - 유물을 동결 - 근육의 높은 수분 함량은 일반적으로 발생하는 문제가 발생합니다. 대부분의 경우, 적절하게 우리의 경험에 따르면, 도살장 생산 라인에서 근육 조직을 동결하는 것은 거의 불가능하다. 여기에 제시된 프로토콜은 높은 처리량 방식으로 냉동 절편을 위해 근육 조직을 동결하기 위해 실험실에서 사용 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 방법의 하이라이트는 액체 질소에 냉동 플래시 근육 조직 용으로 설계된 새로운 cryovial이다. 현재 워크 플로우 동시에 조직을 용이하게 할 수명확하게 표시 함과 세포질 주변 조직에 꽉 근섬유의 동격으로 우수한 근육 동결 절단 (Cryosections)에 대한 동결 처리. 액체 질소가 조직과 혼합되지 않기 때문에, 또한,이 프로토콜은 조직 분석 옵션의 다양한 배열에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>크라이오스탯 마이크로톰</td><td>&nbsp; 라이카</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>디지털 현미경&nbsp;</td><td>니콘</td><td>니콘 DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 극저온 바이알&nbsp; &nbsp; 플라스틱 필름</td><td></td><td></td><td>자체 설계</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td>Commomly 사용</td></tr><tr><td>메스</td><td></td><td></td><td>Commomly - 사용</td></tr><tr><td>10cm 집게</td><td></td><td></td><td>Commomly - 사용</td></tr><tr><td>25cm 핀셋</td><td></td><td></td><td>Commomly 사용</td></tr><tr><td>안전 유리</td><td></td><td></td><td>Commomly 사용</td></tr><tr><td>냉동 장갑</td><td></td><td></td><td>일반적으로 사용됨</td></tr></tbody></table>

근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 cryovial 제거

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

골격 근육의 생리에 대한 연구는 적절하게 명확하게 볼 세포질 구획으로 섹션을 얻기 위해 표본을 처리하는 기술적 과제에 직면 해있다. 또 다른 장애물은 주위 조직에 근섬유의 꽉 동격이다. 조직 고정 및 파라핀 매립 처리는 근섬유의 수축을 초래하기 때문에, 동결 절편을 위해 근육 조직 강화의 최적의 방법이다. 그러나, 일반적으로 발생하는 문제, 얼음 결정의 형성은, 때문에 근육의 높은 수분 함량의 동결 절편의 준비 기간 동안 발생합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 제 적절히 액체 질소에 침지하여 그 근육 조직을 동결하는 간단하고 효율적인 방법을 설명한다. 단독으로 액체 질소를 사용의 문제점은 다음 절연체로서 작용하고 조직의 냉각을 저해 조직에 질소 가스 배리어의 형성을 유발한다는 것이다. 하는 네브라스카이 &quot;증기 담요 &#39;효과를 방지하려면w cryovial은 조직 표면 주위의 액체 흐름 속도를 증가하기 위해 설계되었다. 이것은 병의 벽 (14 개)에 유입 구멍의 총 펀칭에 의해 달성 하였다. 버블 역학에 따르면, 작은 거품 적은 가능성의 액체 흐름의 결과의 높은 속도는 가스 배리어를 형성한다. 액체 질소가 유입 관통 구멍 cryovial로 유입되면, 조직 주변의 유속 가스 배리어를 제거하기에 충분히 빠르다. 미리 냉각 펜탄을 이용하여 근육 조직을 동결하는 방법에 비해,이 프로토콜은보다 간단하고 효율적이며 처리량하게 근육을 고정하기 위해 사용될 수있다. 또한,이 방법은 실온에서 가연성이 매우 이소 펜탄에 액세스 할 수없는 기관에 최적입니다.

cryovial 그림 및 동결 절편의 준비 기간 동안 근육을 동결에 대한 일반적인 실험실 장비는 그림 1에 나타내었다. 크리오 바이알 (cryovial)는 금형 공장에서 폴리 프로필렌으로 만들어진다. 각 바이알은 입구 구멍 (14)의 총이있다 : 하나는 캡이고; 또 하단이고; 나머지 12 형태 4 개 개의 병렬 라인, 서로 90 °의 4 개 개의 구멍 각각. 이러한 흡입 구멍 때 &quot;증기 블랭킷&quot;효과를 액체 질소와 접촉 조직을 피하기 위해 조직을 다음 액체 질소의 유속을 빠르게 할 수있다. 따라서, 거의 얼음 결정은 냉동 샘플에서 형성한다. 중요한 것은, 이소 펜탄, 28 ° C에서 끓는점 매우 휘발성과 가연성 액체는이 절차에서 필요하지 않습니다. 더이 방법의 장점을 강조하기 위해, 우리는 등심의 dorsi...

이 프로토콜은 액체 질소에 직접 급락으로 근육 조직을 동결하는 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 질소 가스의 &quot;블랭킷 효과&quot;를 방지 할 수있는 새로운 cryovial를 강조 할 때, 액체 질소 연락처 검체의 조직 표면.

근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 근육 조직을 액체 질소에 직접 침전시켜 동결 아티팩트를 제거하면서 냉동시키는 것입니다. 제 연구실의 학생인 Maozhang He가 Yizhong Huang과 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 각 극저온 보관 튜브에 샘플 식별 정보를 표시하십시오.그런 다음, 액체 질소 탱크, 보안경 또는 안면 보호구, 냉동 장갑, 10cm 포셉, 25cm 핀셋 등 다음과 같은 장비를 준비하십시오. 또한, 스티로폼 아이스박스, 플라스틱 필름, 메스 및 A4 PVC 바인더 커버를 준비합니다. 근육 샘플을 준비하려면 먼저 아이스박스에 액체 질소를 채우십시오.검체를 얻은 후 5분 이내에, 샘플을 A4 PVC 바인더 커버 위에 조심스럽게 올려놓고 근섬유의 방향을 관찰합니다. 다음으로, 메스를 사용하여 근섬유 방향을 따라 검체에 약 3cm 길이로, 간격은 0.6cm가 되도록 두 개의 평행한 절개를 가합니다. 절개된 근육을 가로 약 0.6cm, 세로 0.6cm, 길이 1.5cm의 직사각형 모양으로 다듬습니다.그 다음, 10cm 포셉을 사용하여 절개된 근육의 장축이 플라스틱 필름의 긴 가장자리와 평행하도록 샘플을 필름 위에 조심스럽게 놓습니다. 라벨이 부착된 극저온 보관 튜브의 하단 중앙, 입구 구멍 사이에 근육 조직을 넣고 튜브 캡을 단단히 닫습니다. 조직 샘플을 동결시키기 위해, 25cm 핀셋을 사용하여 예냉된 스티로폼 쿨러 내의 액체 질소에 극저온 보관 튜브 전체를 빠르게 담그고, 액체 질소가 더 이상 끓지 않을 때까지 기다립니다.액체 질소는 크라이오바이알 전체를 잠기게 할 수 있을 만큼 충분해야 하며, 크라이오바이알이 액체 수면 아래에 완전히 잠겨야 합니다. 근육 샘플을 액체 질소 보관 탱크 또는 80 °C 냉동고로 옮겨 장기 보관하십시오. 냉동된 근육이 상온의 용기 또는 기구와 우발적으로 접촉하지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.슬라이드를 준비하려면, 크라이오스탯을 20 °C에서 22 °C 사이로 사전 냉각하십시오. 기존의 마이크로톰 칼날을 제거하여 폐기하고, 크라이오스탯 내의 나이프 홀더와 안티롤 플레이트를 닦아냅니다. 그런 다음, 크라이오스탯에 새 마이크로톰 칼날을 장착하고 절편 두께를 8 µm로 설정하십시오.근육 샘플이 들어있는 극저온 보관 용기를 액체 질소 저장 탱크 또는 -80°C 냉동고에서 꺼내어 액체 질소 또는 드라이아이스 위에 둡니다. 그 다음 샘플을 크라이오스탯(cryostat)으로 옮기고, 검체가 크라이오스탯의 온도와 평형을 이룰 때까지 30분 동안 기다립니다. OCT를 사용하여 샘플을 포매한 후, 검체 홀더에 샘플을 장착합니다.그 후, 8µm 두께로 절편을 제작합니다. 상온의 마이크로 슬라이드 중앙 부분에 절편을 부착합니다. 슬라이드를 즉시 슬라이드 보관함에 넣습니다.그런 다음, 슬라이드 상자를 -80 °C 냉동고에 넣습니다. 슬라이드가 상온에서 마르지 않도록 하십시오. 여기에서 볼 수 있듯이, 돼지의 longissimus dorsi 근육 샘플을 -80 °C 냉동고에 직접 넣었을 때 얼음 결정이 형성되었으며, 이는 근육 냉동 절편에서 잘 알려진 스위스 치즈 효과(Swiss cheese effect)를 유발했습니다.근육 조직을 액체 질소에 직접 담갔을 때도 얼음 결정이 형성되었습니다. 다른 방법을 사용하여 조직을 적절한 방향으로 OCT 매립제에 담근 후 이소펜탄 슬러리로 급속 냉동시켰을 때, 근섬유의 세포질 구획에서 많은 바늘 모양의 얼음 결정이 형성되었습니다. 다공성 크라이오바이알(multi-hole cryovial)에 조직을 냉동하면 세포질 구획이 뚜렷하게 보이고 근섬유가 주변 조직에 밀착되어 표본의 무결성이 매우 우수하게 유지됩니다.이 방법을 사용하여 속근 및 지근 섬유의 ATPase 활성을 분석하였습니다. 동일한 시간 동안 반응시켰을 때, 속근 섬유는 2단계의 밝은 색으로 나타나며, 지근 섬유는 검은색으로 나타납니다. 여기에 제시된 표준 동결법에서는 근육 조직을 OCT 마운팅 매질과 직접 접촉하지 않은 상태에서 이소펜탄 슬러리에 침지시켰으나, 이소펜탄의 고체-액체 슬러리 상태를 1시간 이상 유지하기는 어려우며 이소펜탄을 항상 사용할 수 있는 것도 아닙니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 생물학적 시료를 보존하기 위한 초고속 극저온 유리화(cryo vitrification) 방법을 보여줍니다. 이 방법은 세포 내 얼음 결정 형성을 방지하여 생물학적 조직을 동결 손상으로부터 보호하기 위해 동결 보호제의 조합을 사용하는 것을 수반합니다.

유리화(Vitrification-based cryopreservation): 장기 보관을 위해 매우 낮은 온도에서 생물학적 시료를 보존하는 초고속 냉각 기술

이 비디오는 근육 조직을 스냅 동결하고 얇은 부분을 얻는 절차를 설명합니다. 이 기술은 대장암 마우스 모델에서 암 관련 악액질을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

절편을 위한 근육 조직의 스냅 동결: 급속 동결된 쥐 근육 조직의 초박형 절편을 얻기 위한 프로토콜

구조적, 기능적, 생화학적 특성을 결정하기 위한 골격근 조직의 분석은 적절한 준비에 의해 크게 촉진됩니다.  이 프로토콜은 광범위한 표현형 연구를 위해 골격근 조직을 준비하는 적절한 방법을 설명합니다.

조직의 우선 순위 구분과 골격근 질환 모델에 대한 동결

고품질 투과 전자 현미경 이미지를 얻는 것은 특히 물이 채워진 큰 액포와 폭기 공간이 풍부한 식물 세포의 경우 어렵습니다. 직렬 고압 동결 및 급속 동결 대체는 TEM을 위한 식물 샘플의 준비 시간을 크게 단축하는 동시에 탁월한 초구조 보존력을 가진 샘플을 생성합니다.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

여기에서는 인공물 동결을 피하기 위해 근육 생검을 동결, 포매팅, 동결 절제 및 염색하는 가장 효율적인 방법을 보여줍니다.

조직 학적 분석을위한 근육 저온부의 준비의 것과하지 말아야을 수행

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

연속 크라이 섹션은 단일 마우스 골격근에서 인접 영역을 이용한 유전자 발현 측정 학적 어플리케이션 및 RNA의 농축을 가능하게 수집된다. 직접 애플리케이션에서 비교 풀링 저온부 및 측정 30mg을 - 고품질 RNA를 (20)로부터 얻어진다.

유전자 발현 및 조직 학적 분석을위한 단일 마우스 골격근의 연속 지역의 냉동 절편

여기에 제시된 것은 동결된 시료를 동적 핵 편광(DNP) 매직 앵글 방적(MAS) 핵자기 공명(NMR) 프로브로 전송하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜에는 실험 전의 로터 저장 방향과 실험 전후의 생존 가능성 측정을 위한 방향이 포함됩니다.

셀룰러 생존력을 보존하는 마법의 각도 회전 핵 자기 공명 분광기에 극저온 샘플 로딩

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

이 프로토콜은 티라민 결합 히알루로난 하이드로겔을 사용하여 마우스 난소에서 전방의 여포를 캡슐화하고 배양하는 새로운 3차원(3-D) 배양 모델을 설명합니다. 또한 유리화(vitrification)에 의한 난소 여포 동결 보존에 대한 두 가지 접근 방식에 대해서도 자세히 설명합니다.

3차원 난포 배양을 위한 새로운 히알루로난 하이드로겔의 응용 및 마우스 난포 동결 보존을 위한 방법론

학습하세요 근육 조직을 액체 질소에 직접 침지하여 결빙 인공물을 제거하는 방법을. 다중 홀 크라이오바이알을 사용하면 질소 가스의 담요 효과를 방지하여 생물학적 샘플 보존을 개선할 수 있습니다.

근육 조직이 직접 액체 질소에 몰입 할 때 이슈 결빙 멀티 홀 Cryovial 제거

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