짧은 꼬리 원숭이의 간 및 장간막 림프절의 시리얼 컬렉션 복강경 기술

이 최소 침습 복강경 시술의 전반적인 목표는 동물 복지를 개선하면서 여러 시점에서 장간막 림프절 및 간 생검을 수집하여 위장관에서 미생물 전좌의 영향에 대한 평가를 개선하는 것입니다. 이 방법은 장간막 림프절과 간에 대한 감염 및 미생물 전좌의 면역학적 결과와 이러한 조직의 병리학에 대한 HIV 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동물 또는 평가 중인 매개변수에 미치는 영향을 최소화하면서 연구의 여러 시점에서 샘플링을 수행할

이 방법은 HIV에 대한 이해를 심화하는 데 중요한 샘플을 제공할 수 있습니다. 위장관 염증과 미생물 전좌가 중요한 다른 모델에도 적용할 수 있습니다. 이 수술은 워싱턴 국립 영장류 연구 센터(Washington National Primate Research Center)의 수의사인 제레미 스메들리(Jeremy Smedley) 박사와 캐시 모츠(Cassie Moats) 박사가 맡게 됩니다.

텍스트 프로토콜에 표시된 대로 수술을 위해 원숭이를 준비한 후 멸균 천공 커튼으로 덮습니다. 그런 다음 멸균 카메라 드레이프를 사용하여 디지털 카메라를 단단히 덮고 타워에 꽂습니다. 견고한 스코프를 카메라 헤드에 연결합니다.

그런 다음 멸균 광 케이블을 견고한 스코프에 연결하고 광원에 연결합니다. 마지막으로 주입기에 멸균 주입 튜브를 장착합니다. 복강경 검사를 시작하려면 15개의 메스 날을 배꼽 왼쪽으로 약 1-2cm 떨어진 곳에 놓고 복부 근육에 도달하는 피부를 약 5mm 찔러 절개합니다.

주로 사용하지 않는 손으로 상처의 두개골 쪽에 있는 복벽을 들어 올립니다. 그런 다음 다른 손을 사용하여 절개 부위를 통해 동물의 머리 쪽으로 기울어진 내반 바늘 끝을 삽입합니다. 내측 바늘의 축을 잡고 딸깍 소리가 나면서 복벽을 통과하고 복강에서 바늘에 대한 저항이 감소할 때까지 단단히 밀어 넣습니다.

그런 다음 CO2 인슐플레이트의 튜브를 바늘에 부착하고 마개를 열어 가스를 복강으로 방출합니다. 최대 10-12mm의 수은 압력에 도달하여 폐복막을 만듭니다. 이제 복부가 완전히 팽창했으므로 15개의 메스 날을 왼쪽 두개골 복부, 마지막 갈비뼈에서 꼬리 방향으로 약 2-4cm에 놓고 약 5-7mm의 피부를 절개합니다.

다음으로, 절단을 통해 5mm 투관침 캐뉼러 어셈블리를 삽입합니다. 어셈블리를 1-2cm 깊이로 도입하고 약 45-60도에서 꼬리 내측으로 향하게 합니다. 그런 다음 회전 동작으로 캐뉼러를 앞으로 밀어 1.5-3cm 깊이에 도달하여 캐뉼라를 복부에 나사로 고정합니다.

그런 다음 투관침을 제거하십시오. 내측 바늘에서 인슬러 튜브를 분리한 후 마개를 끕니다. 튜브를 캐뉼라에 연결하고 스톱콕을 열어 폐복막을 유지합니다.

압력이 성공적으로 유지되고 있는지 확인되면 내측 바늘을 제거합니다. 다음으로, 캐뉼라를 통해 단단한 내시경을 복강에 삽입합니다. 카메라의 제어하에 내반 바늘 제거 후 남은 피부 절개 부위를 깊숙이 절개하여 복부 근육과 복막을 절단합니다.

마지막으로, 발을 머리 위로 약 15-30도 높이로 올려놓는다. 장간막 림프절에서 생검을 채취하려면 준비된 절개 부위를 통해 복강에 견고한 프로브를 삽입합니다. 오멘텀과 장 사이에 프로브를 배치하고 부드럽게 쓸어내는 것과 같은 동작으로 오멘텀에서 장을 노출시켜 아래에 숨겨진 장간막을 시각화합니다.

프로브를 꼬리에서 두개골 방향으로 계속 움직여 오멘텀을 수술장에서 멀리 밀어냅니다. 그런 다음 프로브를 사용하여 하행 결장을 복벽 쪽으로 움직입니다. 프로브로 장간막을 검사하여 결장과 장간막 혈관을 따라 위치한 장간막 림프절을 찾습니다.

림프절이 확인되면 복강에 있는 프로브를 메릴랜드 래칫 겸자로 교체하고 림프절에 인접한 장간막을 잡습니다. 장간막을 절개 부위 쪽으로 당기고 캐뉼라에서 내시경을 제거합니다. 그런 다음 인슬러를 끄고 캐뉼라 스톱콕을 열어 두어 복부에서 가스를 방출하면 장간막 외부화가 완화됩니다.

그런 다음 절개 부위를 통해 장간막을 당깁니다. 절개 부위를 통해 접근할 수 있도록 집게로 바깥쪽의 장간막을 잡습니다. 장간막을 촉진하거나 관찰하여 더 단단한 결절 또는 더 회색 영역으로 나타나야 하는 림프절을 식별합니다.

다음으로, 구부러진 지혈기를 사용하여 결절에 인접한 장간막에 3-5mm의 구멍을 뚫고 조직에 대한 부착물을 뭉툭하게 해부합니다. 필요한 경우 4-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사로 혈관 구조를 접합하고 메스를 사용하여 림프절을 절개합니다. 그런 다음 RPMI 1640 배지에 생검을 얼음 위에 놓습니다.

마지막으로, 장간막을 풀어주고 복부를 다시 한 번 팽창시켜 조직을 복강으로 끌어당길 수 있도록 합니다. 테이블을 수평 위치로 되돌립니다. 간 생검을 채취하려면 림프절 채취에 사용되는 절개를 통해 나사산 캐뉼라를 복강에 삽입합니다.

그런 다음 캐뉼라를 사용하여 두개골 복강을 향하는 단단한 스코프를 밀어 넣어 간을 시각화합니다. 카메라의 제어 하에 이전에 복강을 팽창시키는 데 사용되었던 캐뉼라를 통해 생검 겸자를 도입합니다. 턱이 조직을 향하도록 지정된 간엽 가장자리 아래에 집게를 배치하고 가장자리가 턱 안으로 떨어지도록 집게를 엽니다.

위치를 조정한 후 겸자를 닫고 약 20-30초 동안 압력을 유지합니다. 그런 다음 캐뉼라를 통해 집게를 부드럽게 당겨 샘플을 제거합니다. RPMI 배지에 생검을 얼음 위에 놓습니다.

마지막으로, 생검 부위에 출혈이 관찰되지 않는지 확인하고 절개 부위를 봉합합니다. 여기에 제시된 것은 두 개의 서로 다른 시점에서 두 개의 건강한 여성 메카크에서 수집된 장간막 림프절 및 간 생검에서 얻은 세포 수율입니다. 예상대로, 림프절 생검은 간 생검과 비교했을 때 분리된 세포의 수가 현저히 더 많았습니다.

출처 조직에 관계없이 분리된 세포의 85% 이상이 생존 가능했습니다. 그런 다음 분리된 세포 샘플을 CD45+백혈구 및 CD45+CD3+림프구 집단에 대해 분석했습니다. 장간막 림프절은 간 유래 세포에 비해 CD45+백혈구 및 CD3+림프구의 빈도가 더 높았습니다.

분리된 집단에 대한 상세한 특성 분석은 장간막 림프절이 CD3+T 세포와 CD4+T 세포의 비율이 현저히 높았을 뿐만 아니라 CD8+T 세포의 수가 증가했음을 보여주었습니다. 반대로, 간에는 CD14+백혈구가 현저히 풍부했다. 두 기관 모두 CD20+B 세포의 풍부함이 비슷했다.

이 기술을 숙달하면 30-40분 안에 수행할 수 있습니다. 동물은 일반적으로 마취에서 회복되어 몇 시간 이내에 활동적이고 먹이를 먹으며 절개 부위가 너무 작아서 케이지 쪽을 보기 어려울 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 동물이 성공할 수 있는 신체 상태를 유지하는 것이 중요하다.

상당한 장간막 지방은 마디를 가리고 튀는 능력과 출혈을 증가시키기 때문에 어려운 장애물이 될 수 있습니다. 이 절차에 따라 정맥 절개술, 말초 림프절 생검, 상부 및 하부 위장관 내시경 검사 및 직장 생검과 같은 다른 방법을 수행하여 전신 및 점막 면역 반응, 미생물 및 상피 장벽 상태, 바이러스 부하를 평가할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 우리 연구실의 연구원들이 이전에는 부검을 통해서만 사용할 수 있었던 원숭이 조직에서 염증의 미생물 집단을 종단적으로 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

미생물 전좌는 HIV 발병을 유발하는 염증의 주요 원인이기 때문에 이 기술의 의미는 HIV 치료로 확장됩니다. 이를 순차적으로 평가하면 잠재적인 표적을 제공하고 치료 개입을 평가할 수 있습니다. 바이러스에 감염된 원숭이와 함께 작업하는 것은 매우 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오.

마카케신 헤르페스 바이러스 1을 포함한 생물학적 위험에 대한 적절한 교육, 적절한 개인 보호 장비, 물린 및 긁는 키트, 적절한 의료 후속 조치와 같은 예방 조치를 취할 수 있어야 합니다.