평가 기본 폭발 효과 체 외에

이 방법의 전반적인 목표는 폭발 이벤트 중에 발생할 수 있는 대표적인 충격파를 생성하고 이러한 기계적 충격이 배양에서 일차 세포의 생존력에 미치는 영향을 평가하는 것입니다. 이 방법은 충격파 노출과 같은 고에너지 이벤트에 대한 개별 세포 유형의 반응과 관련된 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 조직 또는 장기 수준의 반응이 아닌 단일 충격파에 대한 뚜렷한 세포 반응을 평가할 수 있다는 것입니다.

이 기술의 의미는 충격파에 대한 노출로 인해 발생하는 1차 폭발 부상의 결과로 변경된 세포 메커니즘을 식별하는 것으로 확장됩니다. 이 방법은 특정 관심 세포 유형을 대상으로 시연되고 있지만, 충격파에 대한 세포 특이적 반응을 평가하기 위해 모든 세포를 배양하고 테스트 설정 내에 배치할 수 있습니다. 먼저 표준 배양에서 80% confluence에 도달할 때까지 관심 세포주를 배양합니다.

그런 다음 매체를 흡입합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 트립신-EDTA 2ml를 첨가합니다. 표준 배양 조건에서 5분 동안 배양합니다.

세포가 플라스크에서 성공적으로 해리되었는지 간단히 확인합니다. 그런 다음 트립신을 중화하고 세포를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기기 위해 배양 배지가 들어있는 FBS 4 밀리리터를 플라스크에 첨가합니다. 세포를 200배 g으로 4분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.

그런 다음 펠릿이 제거되지 않도록 주의하면서 상등액을 천천히 흡인합니다. 그리고 펠릿을 5 밀리리터의 배지에 재현탁시킵니다. 90ml 접시 안에 35ml 접시 3개를 넣습니다.

그런 다음 각 접시에 2ml의 배지를 넣고 각각 70,000개의 세포를 심습니다. 충격파에 노출되기 전에 적절한 세포 부착을 허용하기 위해 밤새 세포를 배양합니다. 쇼크 튜브 조립을 시작하기 전에 강철 발가락 작업 부츠와 실험실 코트를 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.

출구 플랜지의 수평면에 있는 볼트 구멍을 통해 두 개의 정렬 막대를 삽입하여 시작합니다. 그런 다음 니트릴 고무 개스킷 시트를 정렬 막대 끝 부분에 놓아 배출구 플랜지와 생체 외 장기 배양 장비 사이에 놓이도록 합니다. 고정 장치를 정렬 막대 위로 밀어 EVOC 리그를 쇼크 튜브의 배출구 플랜지에 부착합니다.

페트리 접시를 담고 있는 부분이 바닥에 위치하도록 방향이 올바른지 확인하십시오. 그런 다음 나머지 구멍에 4개의 M24 볼트와 와셔를 삽입하고 너트와 볼트를 대각선 대칭으로 순차적으로 단단히 조이면서 EVOC 리그와 쇼크 튜브가 성공적으로 정렬되었는지 육안으로 확인합니다. 그런 다음 압력 변환기를 EVOC 리그에 연결하고 센서 케이블을 사용하여 전류 소스에 연결합니다.

또한 BNC 케이블을 사용하여 전류 소스를 오실로스코프에 연결합니다. 쇼크 튜브의 모든 해제 밸브와 유량 제어 장치가 닫혀 있는지 확인하십시오. 그런 다음 내장된 외부 압축 에어라인을 열고 압력 조절기를 시계 방향으로 수동으로 돌려 솔레노이드를 2.5bar로 충전합니다.

압축 공기 실린더를 연 다음 압력 조절기를 시계 방향으로 천천히 돌려 압력을 약 15bar로 높입니다. 다음으로 0.125ml 두께의 플라스틱 시트를 10cm x 10cm 정사각형으로 잘라 다이어프램을 준비합니다. 테이프로 핸들을 만들고 다이어프램의 상단과 하단에 고정합니다.

그것들을 사용하여 브리치 챔버 옆의 전면 작은 플랜지 옆에 다이어프램을 조심스럽게 배치하십시오. 브리치를 닫기 전에 다이어프램이 직선이고 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. 그런 다음 4개의 M24 볼트와 너트를 사용하여 제자리에 고정합니다.

멸균 후드 내부에 접착 가스 투과성 멤브레인을 준비하여 각 멤브레인이 35ml 페트리 접시 하나의 상단을 덮을 수 있을 만큼 충분히 커지도록 합니다. 그런 다음 3개의 실험 샘플이 들어 있는 90ml 페트리 접시를 후드로 옮깁니다. 접시 중 하나에서 매체를 흡인하고 두 개의 멤브레인 섹션으로 덮어 멤브레인과 접시 가장자리 사이에 단단히 밀봉되어 있는지 확인합니다.

s를 옮기십시오.ample을 EVOC 리그로 보내고 접시 상단이 쇼크 튜브의 내부 바닥과 정렬되도록 고정 장치 바닥에 고정합니다. 이 시점에서 귀마개, 눈 고글, 안전화 및 실험실 가운을 착용하십시오. 조절기의 유량 조절 손잡이를 시계 방향으로 돌려 쇼크 튜브 시스템에 압력을 가합니다.

제어판 하단에서 짧은 지속 시간의 충격파를 위한 이중 브리치 흡입구 또는 증가된 파동 지속 시간을 위한 드라이버 튜브 흡입구를 선택합니다. 그런 다음 DC 전원과 오실로스코프를 켜서 파형 데이터를 요구합니다. 다음으로, 쇼크 튜브가 충전 중일 때 다른 연구원에게 방에 들어오지 않도록 알리기 위해 제어판 맞은편 벽에 있는 스위치를 사용하여 안전 조명을 켭니다.

솔레노이드 컨트롤 박스에서 스위치를 눌러 솔레노이드를 닫습니다. 그런 다음 제어판에서 손잡이를 시계 반대 방향으로 돌려 흐름 제어 장치를 천천히 열어 압축 챔버 내의 압력을 점차적으로 높입니다. 다이어프램 파열 압력에 도달하면 다이어프램이 파열되고 쾅 소리가 들립니다.

이 소음이 들리면 흐름 조절 손잡이를 빠르게 닫으십시오. 그런 다음 솔레노이드 컨트롤 박스의 스위치를 꺼서 솔레노이드를 열고 안전 조명을 끕니다. 세포 샘플을 멸균 후드로 옮깁니다.

거기에서 접착 가스 투과성 멤브레인을 제거하고 접시에 2 밀리리터의 신선한 성장 배지를 채 웁니다. 200마이크로리터의 산화 환원 지시약 시약을 2ml의 신선한 성장 배지로 다시 채운 후 각 실험 접시에 바로 추가합니다. 그런 다음 접시를 표준 인큐베이터로 4시간 동안 옮깁니다.

배양 후 각 접시에서 100마이크로리터 분취액 2개를 적절한 96웰 플레이트로 옮깁니다. 형광 플레이트 리더에서 플레이트를 읽은 다음 데이터를 내보내고 저장합니다. 살아 있는 세포와 죽은 세포의 형광 이미징을 위해서는 초기에 35ml 배양 플레이트 내부의 유리 커버 슬립에 세포를 도금해야 합니다.

충격파 처리 후 배지를 흡인하고 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 이미징 키트에서 100마이크로리터의 살아있는 시약을 각 샘플로 옮깁니다. 그리고 세포와 시약을 실온에서 배양하고 15 분 동안 빛으로부터 보호하십시오.

배양 후 시약을 제거하고 PBS 1ml를 사용하여 세포를 한 번 세척합니다. 가는 집게를 사용하여 35ml 접시에서 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 유리 현미경 슬라이드에 앞면이 아래를 향하게 놓습니다. 개구수가 0.25인 5X 대물 렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 각 샘플에 대한 이미지를 획득합니다.

그런 다음 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 각 이미지에서 살아있는 녹색 세포와 적색 사체 세포의 수를 수동 또는 자동으로 계산합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하여 단층에서 성장한 세포를 충격관으로 생성된 충격파에 노출시켰습니다. 쇼크 튜브의 센서는 튜브를 따라 여러 위치에서 관찰된 압력 프로파일을 표시합니다.

산화환원 적응증 분석을 사용하여 127킬로파스칼 충격파를 적용하면 배양 24시간 후 대조군에 비해 진피 유두 세포의 생존력을 크게 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다. 충격파의 72킬로파스칼 이하를 적용해도 생존 가능성이 감소하지 않았습니다. 이러한 관찰을 뒷받침하기 위해 살아있는 죽은 분석은 대조군과 비교할 때 127킬로파스칼 충격파에 노출된 사람들의 세포 생존율이 감소하는 것도 입증했습니다.

이 기법을 마스터하면 시간당 60개 샘플의 속도로 가변적으로 빠르게 수행할 수 있습니다. 쇼크 튜브는 충격파를 생성하여 다양한 1차 폭발 부상을 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 blast lung에서 heterotopic ossification에 이르기까지 다양할 수 있으며, 이는 신체의 연조직 내에서 뼈가 부적절하게 형성되는 것입니다.

이 절차를 시도하는 동안 압축 가스 및 고에너지 충격파로 작업할 때 수반되는 위험을 기억하고 항상 올바른 안전 지침을 따르는 것이 중요합니다. 쇼크 튜브를 약간만 수정하면 충격파를 변경할 수 있습니다. 그런 다음 다양한 폭발 시나리오를 나타내는 다양한 압력 프로필과 강도에 대한 세포 반응을 평가할 수 있습니다.

이 절차에 따라 차세대 염기서열분석을 수행하여 '충격파에 노출되면 세포 내 자연적인 비문이 어떻게 변경되는가?'와 같은 추가 연구 질문에 답할 수 있습니다.