두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

이 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화에 대한 유전자 및 단백질 마커의 발현과 생산을 각각 분석하는 것입니다. 이 방법은 DPA의 원시 연령에 따른 신경 분화 억제를 담당하는 메커니즘을 결정하는 데 도움이 될 수 있으며, 치료 목적으로 줄기세포를 뉴런으로 분화하는 더 나은 프로토콜로 이어질 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 광학 현미경 검사를 포함하여 에메린 및 단백질 수준에서 신경 분화 과정을 쉽게 추적할 수 있다는 것입니다.

연은 제 연구실의 연구원인 Dr.Junning Yang이 시연할 것입니다. 0.25%트립신-EDTA가 포함된 배아 줄기세포를 섭씨 37도에서 5분, 이산화탄소 5%에서 2-5분 동안 채취하여 배아체 형성을 시작합니다. 15% FBS를 함유한 새로운 Iscove의 Modified Dulbecco's Medium(IMDM)을 분리하는 셀에 추가하고 셀 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다.

160 x G에서 실온에서 5분간 원심분리기. 그런 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수하고 0.5 마이크로몰 레티노산이 있는 IMDM에서 밀리리터당 5번째 세포 현탁액에 5 x 10을 준비합니다. 다음으로, 8채널 피펫과 200마이크로리터 팁을 사용하여 100mm 페트리 접시당 120마이크로리터 방울을 도금합니다.

접시를 뒤집고 거꾸로 된 뚜껑에 PBS를 채워 매달린 방울이 마르는 것을 방지합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 3-4일 동안 배양합니다. 200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 3일 동안 성장한 매달린 방울 배아체를 수확합니다.

피펫 팁으로 배아 본체를 만지고 24웰 플레이트의 파이버넥틴 코팅 커버 슬립으로 옮깁니다. 2-3일마다 배양액의 배지를 교체하십시오. 배지를 변경할 때 단백질 분비 분석에 사용된 배지를 필요에 따라 수집합니다.

매체에 있는 분비한 단백질을 검출하기 위하여는, 10 kilodalton 커트오프 원심 여과기에 배아 몸 매체의 500 마이크로리터를 옮기고, 4 섭씨 온도에 20, 000 x G에 회전시킨다. 과도한 농축을 방지하기 위해 15-20분마다 원심 필터 내부에 남아 있는 매체를 검사합니다. 나머지 매체의 부피가 25마이크로리터로 떨어지면 원심분리를 중지합니다.

필터를 뒤집고 섭씨 4도에서 160 x G로 회전한 다음 제조업체의 지침에 따라 나머지 농축 매체를 수집합니다. 3D 배양의 경우, 이전과 같이 200마이크로리터 피펫 팁이 있는 행잉 드롭으로 4일 동안 성장한 배아체를 수확합니다. 30개의 배아체를 1.5ml 원심분리 튜브에 옮긴 다음 적절한 양의 콜라겐 용액과 5X DMEM을 희석하고 중화 용액을 첨가한 후 즉시 잘 혼합하여 콜라겐 겔 용액을 준비합니다.

얼음 위에 콜라겐 젤을 놓습니다. 다음으로, 적절한 양의 냉각된 콜라겐 용액을 배아체가 들어 있는 튜브에 피펫으로 주입한 다음, 기포를 생성하지 않고 6웰 플레이트의 웰에 배아체 현탁액을 부드럽게 피펫으로 주입합니다. 즉시 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 60분 동안 옮겨 콜라겐 중합을 시작합니다.

60분 후, 배아체가 들어 있는 플레이트를 IMDM으로 오버레이합니다. 배아체 해리를 위해 200마이크로리터 피펫 팁으로 4일 동안 매달린 낙하 배아체를 다시 수집합니다. 이번에는 FBS 15%의 IMDM이 함유된 비접착 세균 페트리 접시에 옮기고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4일 더 배양합니다.

배아체가 바닥에 부착되지 않았는지 하루에 두 번 확인합니다. 배아체가 부착되지 않도록 접시를 부드럽게 흔듭니다. 4일 후, 배아체를 원심분리 튜브에 옮기고 실온에서 5분 동안 185 x G로 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 제거합니다. 팔레트 부피는 100마이크로리터를 초과해서는 안 됩니다. 다음으로, 0.25% I형 콜라겐분해효소 1밀리리터를 피펫으로 주입하고, PBS에 20% FBS를 보충하여 배아체의 튜브에 주입합니다.

혼합물을 섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소에서 1 시간 동안 배양합니다. 20분마다 1ml 피펫 팁을 사용하여 서스펜션을 부드럽게 피펫팅합니다. 배양 후 PBS로 세포를 세 번 부드럽게 씻습니다.

세포 응집체가 있는 경우 100미크론 메쉬가 있는 세포 여과기를 사용하여 제거합니다. IMDM에서 젤라틴으로 코팅된 커버 슬립에 세포를 플레이트한 다음 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양합니다. 2D 또는 해리된 3D 배아체를 PBS로 세척합니다.

그런 다음 4%의 파라포름알데히드와 PBS를 실온에서 30분 동안 고정합니다. 고정된 세포를 PBS로 3회 세척하여 부유 세포 파편을 제거한 후 PBS에 1%triton X-100을 첨가하여 실온에서 20분 동안 세포를 투과시킵니다. 이전과 같이 세척한 후 마지막 세척을 제거하고 PBS에서 5% BSA로 30분 동안 차단합니다.

배양이 끝날 무렵, 0.03%triton X-100이 보충된 PBS에서 1%BSA의 1차 항체 딜루션을 준비합니다. 30분이 경과하면 차단 용액을 1차 항체 용액으로 교체합니다. 실온에서 3시간 동안 배양하거나 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다.

세척 후 PBS에 2차 항체를 바르고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 광학 현미경을 위한 페이드 방지 매체로 유리 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 이 이미지는 배아줄기세포에서 생성된 배아체에서 새싹이 출현하는 것을 보여주며, GTPase RhoA를 활성화하는 구아닌(guanine) 교환 인자를 암호화하는 Syx 유전자의 두 사본에 대해 양성입니다.

이 이미지는 3D 배양에서 6일 후에 촬영되었습니다. Syx KnockOut ESC로 형성된 이 배아체는 배양에서 같은 시간 후에 발아가 증가했음을 보여줍니다. 여기서, 2D 배아체 가장자리의 위상 이미지는 세포가 Syx 야생형보다 Syx KnockOuts에서 더 빠르게 확장되었음을 보여줍니다.

이러한 면역형광 이미지는 빨간색으로 표시된 신경 분화 마커인 Nestin이 Syx 야생형 배아체보다 6일 2D6 KnockOut 배아체에서 증식하는 세포에서 더 풍부하다는 것을 보여줍니다. 여기에서 면역형광 이미지는 신경 분화 마커 Nesten과 beta III Tubulin이 Syx 야생형 배아체보다 13일 3D6 KnockOut 배아체에서 해리된 세포에서 더 풍부하다는 것을 보여줍니다. 이것은 배아체의 성장과 분화가 지속되기 때문에 시간이 많이 걸리는 절차입니다.

최소 8일이 소요될 뿐만 아니라 경우에 따라 최대 24일까지 차별화를 따릅니다. 이 절차를 시도하는 동안, 배아체를 따라 유사한 분화율을 보장하기 위해 배아체 직경의 생존 가능성을 제한하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.