Name: 생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준 고정밀 FRET을 이용해 NMDA 수용체 리간드 결합 영역의 세 가지 구형 상태를 식별하는 방법을. 이 기법은 생체 분자 구조 모델링에 필수적인 정밀 거리 측정을 가능하게 합니다.

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VJ와 HS는 NIH R01 GM094246에서 VJ 로의 지원을 인정합니다. HS는 Clemson University 창의적 탐구 프로그램 및 Clemson University의 광학 재료 과학 및 엔지니어링 기술 센터로부터 창업 자금을 인정합니다. 이 프로젝트는 걸프 코스트 컨소시엄의 학제 간 생물 과학 교육 센터 (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05)의 켁 센터 (Keck Center)와 일반적인 인간 질병의 번역 연구를위한 시스 손 재단 파운데이션 (Schissler Foundation Fellowship)의 연수 프로그램도 지원했다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 나타내는 것은 아닙니다.

모든 저자는이 기사의 내용과 경쟁 관계가 없다고 선언합니다.

이 연구에서는 PIE-MFD 단일 분자 FRET 실험을 사용하여 interdye distance를 고정밀 도로 정렬, 교정 및 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 모든 기기 파라미터를 신중하게 교정하여 측정 된 거리의 정확도를 높이고 Angstrom 정확도에 도달 할 수 있습니다. 이를 위해 다양한 다차원 히스토그램을 사용하여 추가 특성 분석을위한 모집단을 분석하고 식별합니다. 측정 된 샘플의 안정성을 확인하기 위해 평균 매크로 시간을 사용하여, 공여체 및 수용체 광 표백을 보정하고 화학량 론적 매개 변수를 기반으로 FRET 모집단을 선택할 수 있습니다. 그러나, 수용체의 광 물리 특성은 라벨의 위치에 따라 변할 수있다. 따라서, 억 셉터 양자 수율을 적절히 보정하기 위해 S PIE 분포를 사용할 수 있습니다. 감마 인자 (ƴ)를 결정하기 위해서는 적절한 광 물리 특성 분석이 필요하며, 이는 다른 보정 사실ors (누화에 대해서는 α, 도너 레이저로는 acceptor 여기에 대해 β)는 측정 된...

구조 생물학 연구의 근본적인 목표는 생체 분자 기계의 구조와 기능 사이의 관계를 밝히는 것입니다. 생체 분자 ( 예 : 단백질 및 핵산)의 첫 번째 시각적 인상은 1950 년대에 X 선 결정학 (X-Ray Crystallography) 1 , 2 를 통해 발생했습니다. X 선 결정학은 결정 포장에 의해 제약 된 고해상도 정적 구조 정보를 제공합니다. 따라서 X- 선 구조 모델의 내재적 부동성은 생체 분자의 동적 인 특성을 회피하며 이는 대부분의 생물학적 기능에 영향을 미칩니다 3 , 4 , 5 . 핵 자기 공명 (NMR) 6 , 7 , 8 은 수용액에서 구조 모델을 분석함으로써이 문제에 대한 대안적인 해결책을 제시했습니다. 큰 이점NMR은 구조, 동역학 및 기능 3 , 4 , 5 사이의 본질적인 관계를 명확히하는 데 도움이되는 생체 분자 및 구조적 앙상블의 본질적인 동적 특성을 회복 할 수있는 능력입니다. 그럼에도 불구하고 시료 크기와 많은 양의 시료에 의해 제한되는 NMR은 대형 시스템에 대한 복잡한 표지 전략을 필요로합니다. 그러므로 구조 생물학에서 대안적인 방법을 개발할 긴급한 필요가있다. 역사적으로 FRET가 낮은 정확도 거리 측정을 제공한다는 오해 때문에 Fösterster 공명 에너지 전달 (FRET) 9 는 구조 생물학에서 중요한 역할을하지 못했습니다. 이 프로토콜의 목적은 FRET가 나노 미터 규모의 거리를 결정하는 능력을 재검토하여 이러한 거리가 생체 분자의 구조 모델을 구축하는 데 사용될 수 있도록하는 것입니다. 첫 번째 실험적 검증FRET 효율에 대한 R - 6 의존성은 1967 년 Stryer가 &quot;분광적 인 통치자&quot;로서 다양한 길이의 폴리 프롤린을 측정함으로써 행해졌 다. 유사한 실험이 2005 년에 단일 분자 수준에서 이루어졌다. Polyproline 분자는 이상적이지 않은 것으로 밝혀졌고, 따라서 이중 가닥의 DNA 분자는 나중에 사용되었다. 이것은 정확한 거리 측정을위한 창을 열었고 FRET을 사용하여 생체 분자의 구조적 특성을 확인했습니다. FRET은 interdye 거리 범위가 ~ 0.6-1.3 R 0 인 경우 최적입니다. 여기서 R 0 은 Förster 거리입니다. 단일 분자 FRET 실험에 사용 된 일반적인 형광체의 경우 R 0 은 ~ 50Å입니다. 일반적으로 FRET은 다른 방법보다 구조 및 역학을 해결하고 차별화 할 수있는 많은 장점을 제공합니다.(i) 형광의 궁극적 인 민감성 때문에, 단일 분자 FRET 실험 13 , 14 , 15 , 16 은 개별 구성원의 구조를 직접 세고 동시에 특성화함으로써 이질적인 앙상블을 해결할 수있다. (ii) 앙상블의 동기화가 필요 없기 때문에 단일 분자 FRET 연구에서 복잡한 반응 경로를 직접 해독 할 수 있습니다. (ⅲ) FRET는 생물학적으로 관련된 다양한 역학 관계를 다루면서 10 년 이상 시간 영역의 넓은 영역에 접근 할 수있다. (iv) FRET 실험은 in vitro 및 in vivo의 모든 용액 조건에서 수행 될 수있다. FRET와 형광 현미경의 조합은 생체 내 세포에서 직접적으로 분자 구조와 상호 작용을 연구 할 수있게합니다 15 , 16 , </<html> 17 , 18 , 19 , 고정밀도 20 . (v) FRET은 거의 모든 크기의 시스템 ( 예 : 폴리 프롤린 올리고머 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , HIV 역전사 효소 26 및 리보솜 27 )에 적용 할 수 있습니다. (vi) 마지막으로, 생체 분자의 모든 차원을 포함하는 거리의 네트워크는 정적 또는 동적 분자 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35의 구조 모델을 도출하는데 사용될 수있다 .ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . 따라서 단일 분자 FRET 분광기를 사용하여 거리가 구속 된 구조 모델링에 사용하기에 충분히 정확한 거리를 유도 할 수 있습니다 26 . 이것은 8 개 차원의 형광 정보 ( 즉, 여기 스펙트럼, 형광 스펙트럼, 이방성, 형광 수명, 형광 양자 수율, 형광 양자 효율 등)를 이용하는 다중 매개 형광 검출 (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 거시적 인 시간, 형광 강도 및 형광체 사이의 거리)를 정확하고 정확하게 거리 제한을 제공합니다. 또한, 펄스 인터리빙 된 여기 (PIE)는 MFD(PIE-MFD) (42) 를 사용하여 직접 여기 수용체 형광을 모니터하고 1 : 1 공여체 - 수용체 화학 양롞을 포함하는 샘플에서 발생하는 단일 분자 이벤트를 선택합니다. 일반적인 PIE-MFD 설정은 공 초점 현미경 몸체에 연결된 2 개의 펄스 인터리빙 된 여기 레이저를 사용합니다.이 광자 검출은 서로 다른 스펙트럼 창과 편광 특성의 4 가지 채널로 분할됩니다. 자세한 내용은 그림 1을 참조하십시오. FRET 결과와 일치하는 원자 론적 구조 모델을 얻기 위해 FRET가 계산 방법과 결합되어야한다는 점에 유의해야한다. FRET에서 유도 된 거리를 가진 구조 모델을 구축하는 것은 관련된 방법론을 검토하는 것이 현재의 프로토콜의 목표는 아니다. 그러나 이러한 접근법은 다른 기술 ( 예 : 소각 X 선 산란ing 또는 전자 paramagnetic 공명), 통합 구조 생물학 43 , 44 , 45 , 46 의 분야를 낳았다. 현재의 목표는 구조 생물학에서 정량적 도구로서 FRET의 길을 열어주는 것입니다. 예를 들어,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인 (LBD)에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용되었다. 궁극적 인 목표는 앞서 언급 한 한계점을 극복하고 고정밀 도로 측정 된 거리를 제공함으로써 생체 분자의 구조적 결정에 사용되는 통합 방법 가운데 FRET를 가져 오는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>charcoal</td><td>Merck KGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>크기: 0.20 &마이크로; m</td></tr><tr><td>챔버 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>1.5 붕규산 유리, 8</td></tr>웰 <tr><td>현미경 커버 글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>063014-9</td><td>크기: 24 x 60-1.5</td></tr><tr><td>뉴클레아제 프리 워터</td><td>Fisher Scientific</td><td>148859</td><td>뉴클레아제 프리</td></tr><tr><td>트윈-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td><td>폴리소르베이트 20</td></tr><tr><td>수용체 DNA 가닥 10% 용액( High FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>178124895</td><td>5&acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>수용체 DNA 가닥 (Low FRET)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>177956424</td><td>5&acute;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)공</td></tr><tr><td>여체 DNA 가닥</td><td>통합 DNA 기술</td><td>177951437</td><td>5&acute; -d(GCA, ATA, CTT, GGA, CTA, GTC, TAG, GCG, AAC, GTT, TAA, GGC, GAT, CTC, TGT, TT(Alexa488)A, CAA, CTC, CGA, AAT, AGG, CCG</td></tr><tr><td>)DNA 가닥(FRET 없음),</td> <td>통합 DNA 기술</td><td></td>, <td>5&acute; -d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TTG, TAA, ACA GAG, AGC, TCC</td></tr>, TAT, TGC)<tr><td>열 순환기</td>, <td>Eppendorf</td><td>E6331000025</td><td>nexus gradient</td></tr><tr><td>알렉사 플루어 488 C5&nbsp; Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td>는 원<td>고에서 cyan-green fluorophore라고 명명</td></tr>됨 <tr><td>Alexa Fluor 647 C2&nbsp; Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20347</td>은 원<td>고에서 원적외선으로 명명됨</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>E. coli</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>100 &micro에 사용하는; 플라스미드 선택을 유지하기 위한 선택적 LB 배지의 g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Tetracyline&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>12.5 &micro에서 사용; 이황화 결합 산화를 촉진하기 위해 종이 접기 B (DE3) 균주에서 gor (flutathione reductase) 돌연변이를 유지하기 위해 선택적 LB 배지의 g / mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>15 &micro에서 사용; 이황화 결합 산화를 촉진하기 위해 B(DE3) 염색에서 trxB(rhioredoxin reductase) 돌연변이를 유지하기 위한 선택적 LB 배지의 g/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>종이접기 B(DE3) 유능 세포</td><td>Millipore</td><td>70837-3</td><td>이황화 다리를 가진 단백질 발현을 위한 유능한 E. coli 세포</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>E. coli 단백질 발현 유도를 위해</td></tr><tr><td>HiTrap Chelating HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>His-tagged 단백질</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td>의 대규모 FPLC 정제를 위해&nbsp;<td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 탈염 컬럼</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Life Sciences</td><td>28406264</td><td>FPLC 기기</td></tr><tr><td>투석 튜브</td><td>스펙트럼 실험실</td><td>132562</td><td>15 kD MWCO 24 mm Flath 너비, 10 미터/롤</td></tr><tr><td>Dichroics</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50 빔 스플리터 편광판</td><td>Qioptiq Linos&nbsp;</td><td>G33 5743 000</td><td>10 x 10 필름 편광판</td></tr><tr><td>그린 패스 파일러</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m 25mm 직경 마운트</td></tr><tr><td>레드 패스 필터</td><td>Chroma</td><td>ET720/150m</td><td>ET720/150m 25mm 직경 마운트</td></tr><tr><td>파워 미터</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 형광계</td><td>Horiba</td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Fluorohub TCSPC 컨트롤러</td><td>Horiba</td><td>Fluorohub-B</td><td>TCSPC 전자 앙상블 측정 NanoLed</td></tr><tr><td>485L</td><td>Horiba</td><td>485L</td><td>블루 다이오드 레이저</td></tr><tr><td>NanoLed 635L</td><td>Horiba</td><td>635L</td><td>레드 다이오드 레이저</td></tr><tr><td>올림푸스 IX73 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX73P2F</td><td>현미경 프레임</td></tr><tr><td>PMA 40 하이브리드 검출기</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>친환경 검출에 최적화</td></tr><tr><td>PMA 50 하이브리드 검출기</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>ed 시프터 감도에 최적화</td></tr><tr><td>485nm 레이저</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>640nm 레이저</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Hydraharp 400 및 TTTR 수집 소프트웨어</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>피코초 이벤트 타이머 및 시간 상관 단일 광자 출력 장치, TTTR 수집 소프트웨어</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828 및 SEPIA 소프트웨어</td><td>PicoQuant</td><td>910028</td><td>피코초 펄스용 레이저 드라이버, SEPIA 소프트웨어 컨트롤러 포함.</td></tr><tr><td>컴퓨터</td><td>Dell</td><td>optiplex 7010</td><td>cpu : i7-3770 ram : 16GB</td></tr><tr><td>FRET 포지셔닝 및 스크리닝 (FPS) 소프트웨어</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>MFD 제품군</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>에서 사용할 수있는 Accesibel Volume clacualtor http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html 포함합니다.여기에는 BIFL 소프트웨어 패키지 Paris가 포함됩니다. 다중 파라미터 히소트람의 시각화를 위한 Margarita와 http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html 에서 사용할 수 있는 확률 분포 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 fret

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

다중 매개 변수 형광 검출 (MFD) 모드에서 단일 분자 수준에서 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)을 사용하여 고정밀 interdye 거리 측정을 수행하는 방법에 대한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. MFD는 광 물리 및 실험 결과물을 줄이기 위해 형광의 모든 &quot;차원&quot;의 사용을 극대화하고 단단한 생체 분자에서 ~ 1Å까지의 정확도로 interdye 거리를 측정 할 수 있습니다. 이 방법은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 - 결합 도메인의 3 개의 구조 상태를 확인하여 리간드 결합시 수용체의 활성화를 설명하는데 사용되었다. 알려진 결정학 구조를 실험 측정과 비교할 때, 그들은 더 동적 인 생체 분자에 대해 3Å 미만으로 동의했다. 생체 분자의 전체 차원을 커버하는 일련의 거리 구속을 모으면 동적 생체 분자의 구조 모델을 제공 할 수 있습니다es.

MFD 설정 (레이저 라인 : 60 μW에서 485 nm, 23 μW에서 640 nm, 섹션 5.1)을 사용하는 전형적인 smFRET 실험에서 형광 샘플을 낮은 피코 몰 농도 (10 -12 M = 1 pM)로 희석하고 공진 현미경 (sub-nanosecond laser pulse)은 여기 볼륨 (excitation volume)을 통해 자유롭게 확산되는 라벨 분자를 여기시킨다. 일반적인 공 초점 부피는 &lt;4 펨토텔 (fL)입니다. 그러한 저농도에서는 한 번에 하나의 분자 만 하나씩 검출됩니다. 표지 된 분자에서 방출 된 형광은 대물 렌즈를 통해 수집되고 핀 홀을 사용하여 공간적으로 필터링됩니다. 이 단계는 효과적인 공 초점 감지 볼륨을 정의합니다. 그런 다음 신호는 두 개 (또는 그 이상)의 다른 스펙트럼 창 ( 예 : &quot;녹색&quot;및 &quot;적색&quot;)에서 평행 및 수직 구성 요소로 분리됩니다. 각각의 광...

단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 F의 다중 매개변수 형광 검출을 사용하여 고정밀 염료 간 거리 측정을 수행하는 것입니다

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

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연구

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Biochemistry

생화학

이 문서에서는 우리가 자동 스캔 공촛점 현미경을 사용하여 표면에 고정화 각 DNA 분자의 흔적을 걱정 얻는 방법에 대해 설명합니다.

표면 고정화 Biomolecules의 단일 분자 형광 측정을위한 자동화된 시스템

단일 형광체는 피오나를 사용하여 나노 미터 정밀도로 지역화 할 수 있습니다. 여기에 FIONA 기술의 요약보고, 어떻게 FIONA 실험을 수행하는 기술이다.

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

TIRF 현미경을 사용하여 대규모 공여체-수용체 네트워크에서 smFRET 데이터를 얻기 위한 설정 및 실험 절차를 제시합니다. 베이지안 추론 소프트웨어인 Fast-NPS를 사용한 이러한 측정의 단계별 분석은 적응된 염료 모델의 적용을 통해 고분해능 구조 정보를 산출합니다.

단일 분자의 구조 정보는 고속 나노 측위 시스템을 사용하여 실험을 FRET

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

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오픈 소스 smfBox를 사용하여 정확하고 정확한 단일 분자 FRET 측정

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

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이 연구는 라벨링 사이트 선택, 염료 선택, 수집 및 데이터 분석을 포함한 FRET 매핑의 방법론을 자세히 설명합니다. 이 방법론은 단백질 시스템에서 결합 부위, 형태 변화 및 동적 운동을 결정하는 데 효과적이며 기존 3-D 구조 정보와 함께 수행 할 때 가장 유용합니다.

Förster 공명 에너지 전달 매핑: 글로벌 구조적 특징을 밝히기 위한 새로운 방법론

여기에서는 컨포칼 현미경 모드에서 단일 분자 수준에서 시간 분해 형광 이방성을 사용하여 생체 분자의 국소 유연성과 역학을 연구하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

생체 분자의 국소 유연성 특성화를 위한 단일 분자의 시간 분해 형광 이방성(Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules)

학습하세요 단일 분자 수준 고정밀 FRET을 이용해 NMDA 수용체 리간드 결합 영역의 세 가지 구형 상태를 식별하는 방법을. 이 기법은 생체 분자 구조 모델링에 필수적인 정밀 거리 측정을 가능하게 합니다.

생체 분자 구조 결정을위한 단일 분자 수준의 고정밀 FRET

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