Name: 닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 학습하세요 닭 청각 뇌간에서 유전자 발현을 시공간적으로 제어하는 in ovo 전기영동법을 통해 청각 신경 발달을 연구하는 방법을. 이 기술은 청각 관련 질환의 병태생리학적 이해에 기여합니다.

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우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다. 1. 계란 취급 <ol><li> 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다. </li><li> 인큐베이터에 세팅하기 전에 70 % 에탄올로 각 알을 닦으십시오. </li><li> ~ 50 % 습도에서 38 ° C로 설정된 온도의 인큐베이터에서 양 옆에 1-2 개의 달걀을 놓습니다. 이것은 electroporation과 최적의 생존 능력을위한 적절한 배아 위치를 보장합니다. 참고 : 배양 48-52 시간 후, 계란은 햄버거 - 해밀턴 (HH) 단계 ~ 12-13 일에 electroporation 준비가 될 것입니다. </li></ol> 2. 준비 <ol><li> 플라스미드 Mi싱 <ol><li> DNA 혼합물 7 μL 당 0.1 μL의 빠른 녹색 1 μL (18 MΩ 탈 이온 및 증류수 H 2 O [ddH 2 O] 0.1 %)를 첨가하십시오. </li><li> 여러 플라스미드의 공동 electroporation, 1 : 1 비율로 플라스미드를 섞는다. 최종 DNA 농도는 5-8 μg / μL이어야합니다. </li></ol></li><li> 필 주입 피펫 <ol><li> micropipette 끌어 당기는 사람에 pipettes를 당겨. 28G 주사기 바늘을 사용하여 1-2 μL 플라스미드로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 포 셉을 사용하여 10 - 20 μm의 피펫 팁을 끊으십시오. 깨진 피펫 팁의 크기를 결정하는 데 도움이 현미경을 사용하십시오. 피코 스피 쳐의 피펫 홀더에 피펫을 부착하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 윈도우 잉 참고 : 윈도우 절차는 13 전에 게시되었습니다. 추가적인 시각적 정보는 참고 자료 13을 참조하십시오. <ol><li> 모든 악기와 작업 영역을 70 %에탄올. </li><li> 인큐베이터 (6-10 사이)에서 원하는 달걀 세트 계란을 꺼내 실온에서 놔두고 70 % 에탄올로 달걀을 따로 따로 닦아냅니다. 계란은 인큐베이터 제거 후 적어도 2 시간 동안 실행 가능합니다. </li><li> 배아의 위치를 ​​확인하기 위해 빛 조명 장치 위에 계란을 놓습니다. 어두운 영역의 중심 ( 즉 , 배아)에 연필로 동그라미를 치십시오. </li><li> 19G 바늘을 사용하여 알의 둔한 끝 부분에 구멍을 뚫습니다. </li><li> 계란의 뾰족한면에 그려진 원 근처에 다른 구멍을 뚫습니다. 19G 바늘로 외부 알 껍질 (약 16mm 2 )의 작은 조각을 제거한 다음 포 셉를 사용하여 내부 달걀 껍질 (약 8mm 2 )의 작은 조각을 제거합니다. </li><li> 19G 바늘이 장착 된 3mL 주사기를 사용하여 무딘 말단 구멍을 통해 알에서 1.5-2.5mL의 알부민을 빼냅니다. 바늘을 45 °로 기울여야합니다. </li><li> 커팅 된 구멍을 작은 테이프 조각 (1cm x 1cm)으로 덮으십시오. 그려진 원을d 테이프로 두 번째 구멍 (2.5 cm x 4 cm). </li><li> 굽은 가위 (절삭 날 = 2.5cm)를 사용하여 원 안에 창을 자릅니다. 가위는 달걀 껍질과 평행해야하며 창문의 지름은 2cm 미만이어야합니다. </li></ol> 4. 플라스마 주입 <ol><li> 피코 스피처를 켜십시오. 압력을 18 psi로 설정하고 지속 시간을 5 μs로 설정하십시오. 해부 현미경에 대한 공기 탱크와 램프를 켭니다. </li><li> 멸균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 혼합 된 매장에서 구입 한 인도 잉크 1 : 10 희석액 30 mL 원액을 만드십시오. 4 ° C에서 보관하십시오. 인도 잉크의 주입은 닭 배아의보다 나은 시각화를 얻는 중요한 단계입니다. <ol><li> 희석 된 인도 잉크 용액으로 1 mL 주사기를 채 웁니다. 27G 바늘을 부착하고 주사기에있는 모든 거품을 뽑아 내십시오. </li><li> 배아에서 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 배아 아래에 약 0.2mL의 인도 잉크를 주입합니다. 해야 할 것배아 생존을 감소시킬 수 있으므로 인도어 잉크 0.5 mL 이상을 주입하지 마십시오. </li></ol></li><li> 해부 현미경 아래 계란 홀더에 창 계란을 놓습니다. 플라스미드 주사 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 가장 높은 배율을 사용하십시오. </li><li> 집게를 사용하여 주입 영역 위로 막을 제거하십시오. 관심의 청각 brainstem 지역 ( 즉 , NM과 NL) Rhombomeres 5와 6 (R5 / R6)에서 발생합니다. R5 / R6은 R5 / R6 플라스미드 주사의 지표가되는 otocysts (척수 동물의 내이에 발생하는 배아 구조)에 인접 해 있습니다. </li><li> R5 / R6 지역과 otocysts 사이에있는 신경 튜브에 micromanipulator를 사용하여 DNA 채워진 피펫을 낮추십시오. 이상적인 배치의 개략도가 그림 1A 에 나와 있습니다. </li><li> picospritzer에서 공기 압력 (18 psi, 5 μs duration)을 적용하여 신경 튜브의 DNA를 추출합니다. </li></ol> 5. 일렉트로 포 레이션 <ol><li> t를 켜십시오.그는 전류 / 전압 자극기입니다. </li><li> PBS와 3 ML 주사기를 채우고 주사기 필터를 첨부하십시오. 배아에 PBS 1-2 방울을 추가합니다. </li><li> 주사 사이트 (내측) 위의 음전극과 R5 / R6 ( 그림 1A )의 양극 측면과 micromanipulator를 사용하여 배아에 양극 전극을 낮추십시오. 배아와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 전극 재료가 백금 이리듐 인 경우 양극 전극을 사용하십시오. 팁 사이의 간격을 집게로 0.5mm로 조정하십시오. </li><li> 전류 / 전압 자극기를 사용하여 50V에서 1 초 간격으로 20 회 펄스를 1 초 간격으로 펄스합니다. </li><li> electroporation 후 노출 영역 위에 PBS 한 방울을 추가합니다. 부드럽게 전극을 제거하고 실험실 조직과 70 % 에탄올로 청소하십시오. 배아를 테이프로 노출시키는 창을 닫습니다. </li><li> 주입 된 플라스미드 유형 및 해치 날짜로 달걀 껍질에 라벨을 붙입니다. </li><li> 창 측면과 함께 인큐베이터에 계란을 다시 넣으십시오. 38 ° C에서 50 °원하는 발달 단계에 도달 할 때까지 습도 %. </li><li> 유전자 발현의 일시적인 조절을 위해 tet-on vector를 일렉트로 포 레이션하면 24 시간마다 Doxycycline (Dox)을 적용하여 유전자 발현을 유도한다 (6 절 참조). </li></ol> 6. 유전자 발현의 시간 제어를위한 Tet-on 시스템 <ol><li> 다음과 같은 플라스미드를 사용하십시오 : pCAGGS-T2TP : 플라스미드를 발현하는 트랜스포 아제. pT2K-CAGGS-rtTA-M2 : Dox 결합 단백질을 안정적으로 발현하는 플라스미드. pT2K-BI-TRE-EGFP : EGFP 리포터와 관심 두 번째 유전자의 양방향 tet-on promoter (TRE) 구동 구동을 포함하는 플라스미드. 참고 : 위의 세 가지 플라스미드는 1 : 1 : 1의 비율로 공동 electroporated해야합니다. </li><li> 재고 솔루션 준비 : <ol><li> Dox를 멸균 PBS에 녹여 1 mg / mL 저장 용액을 만듭니다. -20 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> Dox 응용 프로그램 : <ol><li> 표현을 유도하려면특정 발달 단계에서 관심 유전자의 n은 24 시간마다 Dox를 적용한다. </li><li> Dox를 적용 할 때, 계란을 꺼내 창을 열고, chorioallointoic 막에 50 μL Dox를 피펫, 창문을 닫고 인큐베이터에 다시 계란을 넣어. </li></ol></li></ol> 7. 뇌간 절편을위한 해부 영역의 준비 참고 : 다음 섹션 (7-9) 및 절차는 14 전에 게시되었습니다. 추가 시각적 정보는이 참조 자료를 참조하십시오. <ol><li> 한천 솔루션 (40mg / ML 아가로 오스, 즉 ddH 2 O 4 %)을 준비합니다. 한천 용액을 페트리 접시에 붓고 실온에서 응고되게하십시오. 조직을 뇌간 절단하는 동안 미래의 사용을 위해 냉장고에 한천 플레이트를 덮습니다. </li><li> 95 % O 2 및 5 % CO 2 (pH 7.2-7.4 및 삼투압 : 295-310 mOsm / L) 인 인공 대뇌 척수액 (ACSF)을 지속적으로 버블 링합니다.</li><li> 작업 영역과 vibratome을 70 % EtOH로 세척하고 칼날을 증류수로 헹구십시오. </li><li> 적절한 절개 공구로 작업 영역에 깨끗한 유체 흡수 패드를 놓습니다. </li><li> 한천 플레이트를 냉장고에서 꺼내고 작은 한천 큐브 (10mm x 10mm x 8mm)를 자릅니다. 시판되는 슈퍼 접착제를 사용하여 vibratome-slicing chamber의 한천 블록을 접착하십시오. </li></ol> 8. 치킨 청각 Brainstem의 격리 <ol><li> 녹화 된 창 사이트에서 알을 엽니 다. 메스로 멤브레인 낭을 찔러서 닭 배아의 머리를 제거하십시오. </li><li> 날카로운 가위로 닭고기를 처치하십시오. </li><li> 면도날 끝을 눈의 약간 뒤로 배치하십시오. 사타구니에서 꼬리 중간 선에서 두개골을 통해 절개하십시오. 배아의 나이에 따라 약간의 압력을가하십시오. 오래된 배아는 더 많은 압력을 필요로합니다. </li><li> 부드럽게 피부와 깃털을 옆으로 밀어서 두개골을 노출시키고 정중선 절단을 확인하십시오. </li><li> 적용뾰족한 압력, 면도날로 두개골의 주둥이 부분을 자릅니다. 즉시 눈 뒤쪽에 블레이드를 놓고 전체 두개골과 뇌 조직을 잘라냅니다. </li><li> 두개골의 꼬리 부분에있는 가위로 정중선 - 절개를 만들고 머리 양쪽에있는 목 근육의 약간 앞쪽에 위치시킨다. 두개골과 과잉 조직을 당겨 뇌와 소뇌를 노출시킨다. </li><li> 가위로 brainstem에 첨부 된 조직을 잘라 버리고 두개골에서 자유롭게 분리 brainstem를 제거하십시오. </li></ol> 생체 내 전기 생리학 또는 영상화를위한 뇌간 절편 준비 <ol><li> 광학 현미경을 통해 뇌간을 고정하십시오. </li><li> 가위로 peduncles를 절단하여 소뇌를 제거하고 넷째 뇌실 바닥을 드러내십시오. </li><li> 핀셋을 사용하여 막 조직 표면에서 멤브레인 모양의 조직과 혈관을 제거합니다. </li><li> 뇌간을 막으려면 4 층 바닥의 가장 주둥이 끝 부분을 수평으로 자릅니다.대뇌 피질에 바로 꼬리 인 심실. brainstem을 격리하기 위해 시신경을 통해 수직으로 측면 절단을하십시오. </li><li> 한천 블록 앞에 직접 vibratome 무대에 슈퍼 접착제의 소량을 놓으십시오. </li><li> 족집게를 사용하여 척수에서 뇌간을 들어 올리고 비듬면이 아래쪽이고 진동 면도날쪽으로 등 쪽의 슈퍼 접착제 위에 놓습니다. 실험실 조직이나 여과지로 과량의 접착제를 제거하십시오. </li><li> 산소가 공급 된 ACSF를 vibratome 단계에 붓는다. vibratome 블레이드를 20-22 ° 각도로 설정하십시오. 진동 진폭을 최대 진폭으로 시작하십시오. 조직의 상단이 날과 평행하도록 날을 향해 스테이지를 위로 이동하십시오. </li><li> 신속하게 뇌간 조직쪽으로 움직입니다. 블레이드가 조직과 접촉하기 전에 블레이드를 상당히 천천히 감속하십시오. </li><li> 가능한 한 가장 느린 전진 속도로 조직을 슬라이스하십시오. 블레이드가 전체 관상 조직 섹션을 통과하면, 전송 피펫을 사용하여 슬라이스를 부드럽게 제거하십시오./ li&gt; <li> 200-300 μm의 단계를 낮추고 다시 슬라이스. 청각 핵의 해부학 적 랜드 마크가 눈에 보일 때까지 반복하십시오 (예 : NL의 뚜렷한 지느러미 / 복부 뉴로 필 영역 및 NL과 관련된 NM의 중간 위치). </li><li> ACFS에서 슬라이스를 조심스럽게 유지 관리하십시오. 이는 온수 욕조를 사용하여 실온 (22 ° C) 또는 생리 조건 (~ 41 ° C)에서 수행 할 수 있습니다. 슬라이스 순서에 유의하십시오. 첫 번째 슬라이스는 조직의 가장 꼬리 부분에 해당하고 마지막 슬라이스는 가장 주둥이 영역에 해당합니다. 이것은 대략 저주파수에서 고주파 인코딩 영역까지의 청각 뇌간 구조의 톤토 피스크 구성을 대략적으로 나타냅니다. </li></ol>

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비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 수있는 배아를 주입. otocysts가 보이지 않는 경우 배아는 electroporation에 대한 올바른 발달 단계에 있지 않습니다. 둘째, 작은 피펫 팁을 사용하면 신경 튜브에 쉽게 침투하여 조직 손상을 줄일 수 있습니다. 그러나 깨진 팁은 DNA를 배출하기에 충분히 커야합니다. 셋째, R5 / R6 위에있는 전체 신경관 영역을 DNA로 채 웁니다 (빠른 녹색 솔루션의 확산으로 시각화 됨). 마지막...

소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발. 개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.

<table><tbody><tr><td>수정 화이트 레그혼 치킨 달걀</td><td>Sunnyside Inc. (위스콘신주</td><td></td><td></td> 비버 댐)</tr> <tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, 단일 또는 이중 채널</td></tr><tr><td>전류/전압 자극기</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil 주사기 바늘</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 게이지, 67 mm 길이, (5개 팩)</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP 시리즈: 비전기적 압력 응용 프로그램</td></tr><tr><td>미세 전극 자극</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>공기 탱크/조절기</td><td>NU 실험실 서비스</td><td></td><td>공기 건조 300 CF</td></tr><tr><td>패스트 그린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>투명 플라스틱 테이프</td><td>스카치</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>계란 냉장고</td><td>Vissani 와인 냉장고</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &deg; C (56-61&deg; F)</td></tr> <tr><td>인큐베이터</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &deg; C (100 &deg; F), ~50% 습도</td></tr><tr><td>해부 스코프</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 현미경, 50.4X</td></tr><tr><td>냉광원</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>모델: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>두꺼운 벽의 붕규산염(치수)</td></tr><tr><td>주사기</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>바늘</td><td>BD Precision Glide&nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>펜치</td><td>스톨팅</td><td></td><td>No. 5 슈퍼 파인 Dumont</td></tr><tr><td>알 홀더</td><td>맞춤형</td><td></td><td>점토 베이스도 작동합니다</td></tr>. <tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>모델 P-97</td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &mu; 중</td></tr></tbody></table>

닭 오라클 brainstem의 ovo electroporation에서

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.

우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporation 후 24 H 확인하고 그림 1B에 표시 됩니다. R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 플라스미드를 표적으로 주입하면 특정 청각 뇌간 영역, 즉 NM 및 NL (11) 에서 발현이 가능합니다. 그림 1C 는 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 조명 하에서 E12 태아의 체외 뇌간 슬라이스를 보여줍니다. 청각 영역은 윤곽이 그려져 있습니다. 형광 조명 ( ...

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

이 절차의 전반적인 목표는 닭 청각 뇌간에서 유전자 발현을 공간적, 시간적으로 제어하는 것입니다. in ovo electroporation의 활용은 청각 뉴런 발달 및 관련 병태 생리학적 현상을 연구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다. 이 절차는 유전자 발현 조절이 정상적인 청각 뇌간 발달에 필요한 표현형의 획득 또는 손실을 어떻게 촉진하는지와 같은 청각 신경 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Ting Lu 박사입니다. 먼저 DNA 혼합물 7마이크로리터당 1마이크로리터의 Fast Green 용액을 추가하여 플라스미드 용액을 준비합니다. 다음으로, 여러 플라스미드의 동시 전기천공을 위해 DNA 용액을 1:1 비율로 혼합합니다.플라스미드 용액이 준비되면 마이크로피펫 풀러로 피펫을 제작합니다. 그런 다음 28게이지 주사기 바늘을 사용하여 피펫에 1-2마이크로리터의 플라스미드 용액을 채웁니다. 겸자를 사용하여 피펫 팁을 10-20미크론으로 끊고 현미경으로 부러진 팁의 크기를 확인한 다음 피펫 홀더를 통해 피코스프릿처에 피펫을 연결합니다.시술 전에 현지 공급업체에서 구입한 계란은 섭씨 13도의 냉장고에 5일 이상 보관하지 마십시오. 시작하려면 난자를 70% 에탄올로 소독한 다음 적절한 배아 위치를 얻으려면 최적의 생존력을 보장하기 위해 섭씨 38도, 습도 약 50%에서 난자를 옆으로 부화합니다. 48-52시간의 배양 후 알이 약 12-13시간 동안 햄버거-해밀턴 단계에 도달하면 작업 영역과 모든 기구를 70% 에탄올로 소독합니다.그런 다음 인큐베이터에서 계란을 꺼내 실온에 두고 70% 에탄올로 두 번 닦습니다. 조명 장치를 사용하여 어두운 영역으로 보이는 배아의 위치를 확인하고 연필로 중심 주위에 원을 그려 표시합니다. 19게이지 바늘로 달걀의 뭉툭한 끝을 찔러서 달걀의 뾰족한 끝 부분에 그려진 원 근처에 두 번째 구멍을 뚫습니다.19게이지 바늘을 사용하여 바깥쪽 달걀 껍질의 작은 조각을 제거하고 집게로 내부 달걀 껍질 막의 작은 조각을 제거합니다. 다음으로, 3밀리리터 주사기에 부착된 19게이지 바늘을 난자의 뭉툭한 끝 부분에 있는 구멍을 통해 넣고 1.5-2.5밀리리터의 알부민을 빼냅니다. 달걀의 뭉툭한 끝 부분에 있는 구멍을 1cm x 1cm 크기의 테이프로 덮고, 그려진 원과 두 번째 구멍을 2.5cm x 4cm 크기의 테이프로 덮습니다.절삭 날이 2.5cm인 구부러진 가위를 사용하여 달걀 껍질과 평행하게 유지하면서 표시된 원 안의 창을 절제합니다. 플라스미드를 주입하려면 피코스프리처를 켜고 5마이크로초 동안 18PSI의 압력을 가하도록 기기 설정을 조정한 다음 공기 탱크와 해부 현미경용 램프를 켭니다. 다음으로, 시중에서 판매되는 India Ink의 원액 30ml를 멸균 PBS로 준비합니다.India Ink 용액을 1ml 주사기에 흡인시킨 다음 27게이지 바늘을 부착하고 주사기에 나타나는 기포를 제거합니다. 배아를 시각화하려면 배아에서 약 2-3mm 떨어진 난황 막 바로 아래에 바늘을 삽입하고 약 0.2ml의 India Ink를 주입합니다. 그런 다음 창문이 있는 난자를 해부 현미경 아래에 있는 난자 홀더로 옮기고 플라스미드 주입 부위를 가장 잘 볼 수 있도록 최고 배율로 전환합니다.집게로 주입 부위를 덮고 있는 멤브레인을 제거합니다. 이낭종을 찾아 근처에 위치한 능형체 5호선과 6호능선을 식별하기 위한 표식으로 사용하여 목세포핵(nucleus magnocellularis)과 층상핵(nucleus laminaris)이 발생합니다. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 이낭종 사이의 R5-R6 영역 위에 있는 신경관에 DNA가 포함된 피펫을 배치합니다.피코스프리처로 DNA를 신경관으로 배출합니다. 전기천공을 시작하려면 전압 자극기를 켠 다음 PBS가 미리 채워진 3ml 주사기에 0.22미크론 주사기 필터를 부착하고 여과된 PBS를 배아에 1-2방울 떨어뜨립니다. 그런 다음 미세 조작기를 사용하여 양극을 배아 쪽으로 이동하고 양극을 주입 부위 위에 배치하고 양극을 R5-R6 측면으로 유지합니다.전압 자극기를 사용하여 1초 간격으로 1밀리초 동안 50볼트의 펄스 20개를 적용합니다. 전극 끝 근처에 거품이 보일 것입니다. 전기천공법 후에, 노출된 지역에 PBS의 1개의 하락을 추가하고, 온화하게 전극을 제거하고 실험실 조직 및 70%에타놀로 청소하고, 그 후에 테이프로 배아 위에 창을 덮으십시오.마지막으로, 주입된 플라스미드 유형과 달걀 껍질의 부화 날짜를 기록하고 창면이 위를 향하도록 하여 알을 인큐베이터에 넣습니다. 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 섭씨 38도에서 습도 50%로 알을 부화시킵니다. 전기천공법 24시간 후 인큐베이터에서 난자를 꺼내 창을 열고 실체 현미경을 사용하여 표적 플라스미드 주입의 정확한 위치를 확인합니다.tet-on 벡터를 사용한 경우 50마이크로리터의 Doxycycline을 융모막막에 피펫으로 넣고 창을 닫은 다음 난자를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 여기에 제시된 것은 배아 12일째 닭에서 준비한 뇌간 절편의 사진으로, 차등 간섭 대비 조명과 형광 조명 하에서 촬영한 것입니다. 목세포핵(nucleus magnocellularis)과 층상핵(nucleus laminaris)은 뇌간 절편 내에서 인식될 수 있습니다.형광등 조명에서 두 구조 모두 노란색 형광 단백질의 발현을 나타내어 전기천공된 유전자의 효율적인 공간 발현을 확인합니다. 전기천공된 유전자의 발현은 또한 배아 day-18 닭에서 얻은 목세포핵(nucleus magnocellularis)을 포함하는 뇌간 절편에서 관찰될 수 있습니다. 80배 확대하면 고전적인 adendritic 세포체가 미분 간섭 대비 조명 아래에서 볼 수 있습니다.부치열 세포체는 노란색 형광 단백질 발현을 나타내며, 이는 청각 뉴런 발달에 대한 연구를 위해 난자 전기천공법이 특정 청각 뇌간 영역에서 유전자 발현을 유도할 수 있음을 추가로 보여줍니다. 일단 숙달되고 제대로 수행된다면, 이 기술은 약 12개의 생존 가능한 알에 대해 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 유전자 발현 표현형이 정상적인 청각 뇌간 발달을 조절하는 방법에 대한 추가 질문에 답하기 위해 생화학적, 약리학적 및 체외 생체 내 기능 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 닭 청각 뇌간에서 유전자 발현을 공간적, 시간적으로 제어하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. In ovo electroporation은 해부학적 및 생리학적 전문화의 유전적 제어와 청각 뇌간 발달의 잘 정의된 기간을 허용합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

비켜 electroporation의 여자는 조류 배아의 유전자 조작을 허용하는 기법입니다. 이 기법의 일반적인 응용 프로그램은 유전자와 putative 향상제 요소의 기능 분석을 포함합니다. 이 동영상은 HH 10 여자는 배아에서 신경 튜브 electroporation을 보여줍니다. 사출 기술과 적절한 계란 처리는 설명합니다.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

이 동영상은 이용 배아 여자 척수에서 뉴런의 유전자 정의된 그룹의 axonal 경로를 시각화하는 방법을...

활용 칙 신경 튜브에서 뉴런의 유전 정의된 그룹 Axonal 경로를 벗기기 비켜에서 Electroporation

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치킨 청각 Brainstem 슬라이스의 준비 및 문화

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배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

기능과 midbrain dopaminergic 뉴런의 발달 동안 유전자의 규정을 평가하기 위해 관련된 방법을...

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

청각 기관은 청각을 중재합니다. 여기에서는 발달 중인 닭 청각 기관에서 청각 전구 세포 증식 및 분화를 연구하기 위해 최적화된 수정된 in ovo micro-electroporation 방법을 제시합니다.

치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

여기서 우리는 하나의 뇌간 조각 내에서 긴장성 특성과 발달 궤적을 조사하기 위해 닭 배아의 비관상 청각 뇌간 조각을 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 슬라이스는 시상, 수평 및 수평/횡단면을 포함하며, 이는 전통적인 관상 섹션보다 개별 슬라이스 평면 내에서 더 큰 토노토픽 영역을 포함한다.

긴장성 구배와 미세 회로를 평가하기 위해 배아 닭 청각 뇌간 절단

우리는 표준 청각 뇌간 반응 (ABR) 기술을 사용하여 청각 기능을위한 조숙 한 조류 모델 인 부화 닭에 적용했습니다. 이 프로토콜은 동물 준비 및 ABR 획득 기술을 자세히 설명하고 다른 조류 또는 설치류 모델로 번역 할 수있는 단계를 설명합니다.

치킨 부화의 청각 뇌간 반응 평가

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

난자 전기천공을 사용하여 닭 배아의 청각 내이와 달팽이관 핵을 선택적으로 형질감염시켜 회로 조립의 개별 기간 동안 깨지기 쉬운 X 정신 지체 단백질의 세포 그룹 특이적 녹다운을 달성하는 방법을 고안했습니다.

In ovo 전기천공에 의한 청각회로에서 깨지기 쉬운 X 정신지체 단백질의 세포 자율 기능 해부

학습하세요 닭 청각 뇌간에서 유전자 발현을 시공간적으로 제어하는 in ovo 전기영동법을 통해 청각 신경 발달을 연구하는 방법을. 이 기술은 청각 관련 질환의 병태생리학적 이해에 기여합니다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

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