라이트 시트 기반의 형광 생활의 현미경 또는 고정 및 스테인드

이 프로토콜의 전체적인 목표는 Tribolium castaneum 배아의 발달 과정을 매우 오랜 기간 동안 비침습적으로 관찰하는 것입니다. 라이트 시트 기반 형광 현미경법은 새로운 곤충 모델 생물인 Tribolium castaneum의 초기 포배기부터 근육 운동의 시작까지 세포 이동 및 증식 패턴을 다룸으로써 형태 발생과 관련된 질문에 답하는 데 도움을 줍니다. 이 방법의 주요 장점은 배아를 수일 동안 관찰할 때에도 광퇴색 및 광독성과 같은 결정적인 요인들을 최소한으로 유지할 수 있다는 점입니다.

Agarose Column을 사용하여 배아를 샘플 챔버에 장착하려면, 먼저 1mm 주사기에 증류수를 채우고 작은 고무 호스를 사용하여 주사기를 유리 모세관에 연결합니다. 모세관의 절반까지 증류수를 채운 다음, 페인트 브러시를 사용하여 배아를 유리 모세관 개구부 안쪽으로 옮깁니다. 그 후 모세관을 액체 agarose에 넣고 배아와 함께 agarose 몇 µL를 모세관 안으로 천천히 빨아들입니다. 배아가 적절한 위치에 놓이면 배아의 위아래로 각각 몇 µL의 agarose가 있어야 합니다.

아가로스가 굳으면 모세관을 약 5mm 길이로 짧게 자릅니다. 남은 파편은 아가로스로 완전히 채워져 있어야 하며, 배아는 두 번째 4분위 영역 내에 위치해야 합니다. 그런 다음 핀이 달린 스틸 실린더를 시료 챔버에 삽입하고, 핀 위에 모세관 파편을 고정합니다. 아가로스 컬럼은 배아가 포함된 모세관 파편 영역으로부터 몇 mm 정도 돌출되어야 합니다.

아가로스 반구를 사용하여 배아를 시료 챔버에 장착하려면, 먼저 1mm 주사기로 액상 아가로스 200 µL를 취한 다음, 시료 챔버가 있는 강철 파이프 상단부터 아가로스를 채워 파이프 하단 개구부에 반구가 형성되도록 합니다. 아가로스가 응고되면 붓 끝으로 배아를 집어 들어 전단(anterior end)이 노출되도록 위치를 조정합니다. 아가로스 반구를 액상 아가로스에 담가 반구 표면을 얇은 막으로 덮은 후, 배아의 전단이 위를 향하도록 아가로스 반구의 꼭대기에 배치합니다.

강철 파이프를 돌리고 브러시를 사용하여 필요에 따라 배아의 위치를 조정합니다. 이상적으로는 배아 표면의 절반 미만이 아가로스로 덮여야 하며, 측면 경사는 가능한 한 가파르게 형성되어야 합니다. 배아 표면에 아가로스가 너무 많이 덮이면 기계적 압박이 가해지고 가스 및 이온 교환이 감소하여 배아의 생존율에 심각한 영향을 미칩니다.

그런 다음 강철 파이프를 샘플 챔버에 천천히 삽입하십시오. Cobweb Holder를 사용하여 배아를 샘플 챔버에 장착하려면, 먼저 페인트 붓으로 배아를 선택한 다음 페인트 붓을 옆으로 치워둡니다. 다음으로 cobweb holder의 슬롯 구멍을 5~8 µL의 액상 아가로스로 덮은 후, 얇은 아가로스 막만 남을 때까지 아가로스의 대부분을 제거하십시오.

배아를 아가로스 필름 위에 놓고, 배아를 슬롯 구멍의 x축 중심으로 이동시켜 조심스럽게 위치를 조정한 뒤, 길게 늘어난 전후축을 슬롯 구멍의 장축과 일치시킵니다. 아가로스가 여전히 액체 상태인 도포 후 10-15초 이내에 배아를 아가로스 필름 위에 배치해야 하며, 그렇지 않으면 제대로 부착되지 않습니다. 그런 다음 Cobweb 홀더를 샘플 챔버에 천천히 삽입하되, 홀더가 여기광 및 방출광을 방해하지 않도록 위치를 잡습니다.

라이브 이미징 분석을 위해 먼저 타임랩스를 설정한 다음, 투과광 모드에서 배아가 레이저에 노출되지 않도록 주의하며 X축과 Y축을 따라 배아를 시야 중심에 위치시킵니다. 배아를 90도 단계별로 360도 회전시켜 마운팅 과정 중 조직 손상이 발생했는지 확인합니다. 형광 모드에서 각 방향에 대한 Z-Stack을 정의하되, 배아의 앞뒤로 25~50 µm의 공간적 버퍼를 추가하고 Z 간격을 정의합니다.

장기 이미징을 위해 샘플 챔버에 충분한 이미징 버퍼가 채워져 있는지 확인하고 샘플 챔버 입구를 덮으십시오. 그런 다음 이미징 프로세스를 시작하여 모든 배아의 모든 채널에서 모든 방향으로 정확한 획득이 이루어지는지 모니터링하십시오. 이미징 기간이 끝나면 샘플 홀더를 샘플 챔버에서 제거하고 배아를 객관 슬라이드로 옮기십시오.

아가로스 컬럼을 사용한 경우, 날카로운 칼날을 사용하여 주변 아가로스에서 배아를 추출하십시오. 아가로스 반구를 사용한 경우, 평평한 면이 아래로 향하도록 반구를 객체 슬라이드로 옮기십시오. 거미줄 홀더 방법을 사용하는 경우, 페인트 브러시를 이용하여 아가로스 필름에서 배아를 조심스럽게 분리하십시오.

그 다음, 배아가 로드된 객체 슬라이드를 소형 유리 접시에 담아 유충이 부화할 때까지 표준 조건의 포화 습도 환경에서 배양하십시오. 관찰된 배아의 데이터를 처리하려면 해당 이미지 분석 소프트웨어에서 관심 파일을 열고, 필요에 따라 Z-Stack을 회전시켜 배아의 전후축(anterior posterior axis)을 Y축과 일치하도록 맞춥니다. 배경이 최소한으로 남도록 X축과 Y축을 따라 Z-Stack을 크롭한 후, 각 Z-Stack에 대해 Z 최대 투영(Z Maximum Projection) 값을 계산하십시오.

그 후, 형질전환 라인 및 이미징 방식에 따라 시간별 스택의 동적 강도를 적절히 조정하여 광퇴색이나 발현 변동을 필요에 따라 보정합니다. alpha-tubulin one 프로모터의 제어 하에 Histone 2B M-Emerald 융합 단백질을 발현하는 형질전환 라인을 사용하여, 실온에서 배아 발달 66시간 동안 germ band retraction부터 dorsal closure까지 기록하였습니다. 이 enhancer trap-line은 머리 부속기관 내의 신경절 군집과 dorsal closure 동안의 cirrosa 이동 역학을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.

동일한 트랜스유전자를 가지고 있으나 게놈 상의 위치가 다른 유사한 형질전환 라인을 촬영하면, 배아 형성(gastrulation)에서 배엽대 신장(germ band elongation)으로 전이되는 과정의 광학 단면을 통해 생성되는 배엽대의 내부 세포 배열을 확인할 수 있습니다. glia-blue 형질전환 라인을 사용하여 시료 회전을 통해 여러 방향으로 Z-Stack을 획득함으로써, 동일한 배아 내에서 복측 신경삭을 따라 그리고 그 주변에서 일어나는 글리아 세포의 재배열뿐만 아니라 머리 엽의 등측에서 나타나는 증식 역동성을 관찰할 수 있습니다. 또한, 소형 형광 염료를 사용하여 세포 간 구조를 특이적으로 표지함으로써 cirrhosis gar, 후방 복측 cirrhosis 세포, 또는 serosa 윈도우 폐쇄 중에 나타나는 serosa amnion 배엽 조직 삼층 구조와 같은 특정 배아 특징들을 강조할 수 있습니다.

이중 색상 형광 염색을 통해 동일한 배아 내에서 두 가지 세포 간 구조를 추가로 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 액틴 세포골격과 핵막이 이에 해당합니다. 녹화가 완료되면, 실험의 품질 관리를 위해 배아를 회수하여 건강하고 생식 능력이 있는 성체로 성장시키는 것이 중요합니다.

이 절차는 넉다운 표현형을 분석하기 위해 Parental RNA Difference와 같은 다른 기술과 결합하여 사용할 수 있습니다.