2017년 4월 28일
광 시트 계 형광 현미경으로 곤충 배아의 형태 형성을 묘화하는 것은 당 업계의 상태가되었다. 이 프로토콜의 외곽선 Tribolium castaneum 배아 적합한 세 실장 기술을 비교, 실시간 이미징에 매우 적합 개의 신규 주문품 트랜스 제닉 라인들을 도입, 필수적인 품질 관리를 다루고 있으며, 현재 실험적인 한계를 나타낸다.
이 프로토콜의 전반적인 목표는 매우 오랜 기간에 걸쳐 Tribolium castaneum 배아의 발달을 비침습적으로 관찰하는 것입니다. 광시트 기반 형광 현미경은 초기 배배엽에서 근육 운동의 시작에 이르기까지 세포 이동 및 증식 패턴을 다루는 새로운 곤충 모델 유기체인 Tribolium castaneum의 형태 형성 관련 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 광표백 및 광독성과 같은 중요한 요소가 배아를 며칠 동안 관찰하더라도 최소한으로 유지된다는 것입니다.
아가로스 컬럼을 사용하여 배아를 시료 챔버에 장착하려면 먼저 1mm 주사기에 증류수를 채우고 작은 고무 호스를 사용하여 주사기를 유리 모세관에 부착합니다. 모세관에 증류수를 반쯤 채운 다음 페인트 브러시를 사용하여 배아를 유리 모세관 구멍의 안쪽으로 옮기고 모세관을 액체 아가로스에 천천히 붙여서 배아와 함께 몇 마이크로리터의 아가로스를 모세혈관으로 끌어들입니다. 배아가 제자리에 있을 때 배아 위와 아래에 몇 마이크로리터의 아가로스가 있어야 합니다.
아가로스가 굳으면 모세혈관을 약 5mm 길이로 줄입니다. 나머지 단편은 아가로스로 완전히 채워져야 하며 배아는 두 번째 사분위수 내에서 발견되어야 합니다. 그런 다음 핀이 있는 강철 실린더를 샘플 챔버에 삽입하고 핀 위에 모세관 조각을 붙이면 아가로스 기둥은 배아를 포함하는 모세관 조각 영역에서 몇 밀리미터 돌출되어야 합니다.
아가로스 반구를 사용하여 배아를 샘플 챔버에 장착하려면 먼저 200마이크로리터의 액체 아가로스를 1mm 주사기에 주입하고 주사기를 사용하여 파이프 상단에서 하단 개구부에 반구가 형성될 때까지 샘플 챔버가 있는 강관을 아가로스로 채웁니다. 아가로스가 굳어지면 페인트 브러시 끝으로 배아를 집어 들고 배아를 재배열하여 앞쪽 끝에 접근할 수 있도록 합니다. 아가로스 반구를 액체 아가로스에 담그어 반구를 얇은 필름으로 덮고 배아의 앞쪽 끝이 수직으로 세워진 배아를 아가로스 반구의 극에 놓습니다.
강관을 돌리고 브러시를 사용하여 필요에 따라 배아의 위치를 수정합니다. 이상적으로는 배아 표면의 절반 미만이 아가로스로 덮여 있어야 하며 옆구리는 가능한 한 가파르야 합니다. 배아 표면에 아가로스가 너무 많으면 기계적 수축이 발생하고 가스 및 이온 교환이 감소하여 배아의 생존율에 극적인 영향을 미칩니다.
그런 다음 강관을 샘플 챔버에 천천히 삽입합니다. 거미줄 홀더를 사용하여 배아를 시료 챔버에 장착하려면 먼저 페인트 브러시로 배아를 선택하고 페인트 브러시를 한쪽에 둡니다. 다음으로, 거미줄 홀더의 홈이 있는 구멍을 5-8마이크로리터의 액체 아가로스로 덮은 다음 얇은 아가로스 필름만 남을 때까지 대부분의 아가로스를 제거합니다.
배아를 아가로스 필름에 놓고 배아를 슬롯형 구멍의 x축 중심으로 조심스럽게 이동하고 길쭉한 전방 후축을 슬롯형 구멍의 길쭉한 축에 정렬하여 위치를 조정합니다. 배아를 아가로스 필름에 적용한 후 10-15초 이내, 즉 아가로스가 아직 액체일 때 배아를 놓아야 하며, 그렇지 않으면 배아가 제대로 부착되지 않습니다. 그런 다음 거미줄 홀더를 샘플 챔버에 천천히 삽입하고 여기 및 방출광을 방해하지 않도록 홀더를 배치합니다.
실시간 이미징 분석의 경우 먼저 타임 랩스를 구성한 다음 투과광 모드에서 배아를 레이저에 노출시키지 않고 X축과 Y축을 따라 배아를 시야의 중앙에 배치합니다. 배아를 90도 단위로 360도 회전하여 장착 과정에서 발생할 수 있는 손상이 있는지 조직을 검사합니다. 형광 모드에서 각 방향에 대한 Z-Stack을 정의하고 배아 앞과 뒤에 25-50마이크로미터 공간 버퍼를 추가하고 Z 간격을 정의합니다.
장기 이미징을 위해 샘플 챔버가 충분한 이미징 버퍼로 채워져 있는지 확인하고 샘플 챔버 입구를 덮습니다. 그런 다음 이미징 프로세스를 시작하여 모든 배아에 대한 모든 채널의 모든 방향을 따라 올바른 획득을 모니터링합니다. 이미징 기간이 끝나면 샘플 챔버에서 샘플 홀더를 제거하고 배아를 개체 슬라이드로 옮깁니다.
아가로스 기둥을 사용한 경우 날카로운 칼날을 사용하여 주변 아가로스에서 배아를 추출합니다. 아가로스 반구를 사용한 경우 평평한 면이 있는 반구를 개체 슬라이드로 이동합니다. 거미줄 홀더 방법의 경우 페인트 브러시를 사용하여 아가로스 필름에서 배아를 부드럽게 분리합니다.
그런 다음 배아가 부화할 때까지 표준 조건에서 포화 습도 분위기의 작은 유리 접시에 넣은 배아를 배양합니다. 관찰된 배아의 데이터를 처리하려면 적절한 이미징 분석 소프트웨어에서 관심 파일을 열고 필요에 따라 배아의 전방 후방 축을 Y축과 정렬하도록 Z-스택을 회전합니다. 최소한의 배경만 남도록 X 및 Y축을 따라 Z-스택을 자른 다음 각 Z-스택에 대한 Z 최대 투영을 계산합니다.
그런 다음 형질전환 라인 및 이미징 양식에 따라 시간 스택의 적절한 동적 강도를 조정하여 필요에 따라 발현 변동에 대한 광표백 또는 식물군을 보정합니다. 알파-튜부블린 one promoter의 제어 하에 히스톤 2B, M-에메랄드 융합 단백질을 발현하는 형질전환 계통을 사용하여 생식대 수축에서 등쪽 폐쇄까지 실온에서 66시간의 배아 발달을 기록했습니다. 이 인핸서 트랩 라인은 머리 부속기 내의 신경 클러스터와 등쪽 폐쇄 중 권암 이동의 역학을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다.
동일한 전이유전자를 가지고 있지만 다른 게놈 위치에서 유사한 형질전환 세포주를 이미징하면 gastrulation에서 germ band elongation으로의 전이의 광학 단면은 신흥 생식 밴드의 내부 세포 배열을 보여줍니다. glia-blue 형질전환 계통을 사용하여 샘플 회전을 통해 여러 방향을 따라 Z-Stack을 획득하면 동일한 배아에서 복부 신경삭스를 따라 및 그 주변의 신경교세포 재편성과 동일한 배아에서 두엽의 등쪽 증식 역학을 관찰할 수 있습니다. 작은 형광 염료는 또한 간경변 gar, 후방 복부 간경변 세포 또는 serosa window closure 동안 나타나는 serosa 양막 생식 밴드 조직 삼중층과 같은 특정 배아 특징을 강조하기 위해 세포 간 구조의 특정 라벨링에 사용할 수 있습니다.
이중 색상 형광 염료 염색을 통해 동일한 배아에 있는 두 개의 세포 간 구조를 추가로 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 핵막(nuclear envelope)이 있습니다. 기록이 완료되면 배아를 채취하여 건강한 가임 성인으로 키우는 것이 실험의 품질 관리를 위해 중요합니다.
이 절차는 Parental RNA Difference와 같은 다른 기술과 결합하여 knocked down 표현형을 분석할 수 있습니다.
전체 스크립트를 보고 수천 개의 과학 동영상에 액세스하세요
이 프로토콜은 빛 시트 기반의 형광 현미경을 사용하여 Tribolium castaneum 배아의 형태형성을 관찰하는 방법을 상세히 설명합니다. 세 가지 장착 기술을 비교하고 생체 영상을 위한 새로운 형질전환 계통을 소개합니다.
Light sheet-based fluorescence microscopy enables long-term, noninvasive observation of insect embryogenesis with reduced phototoxicity and photobleaching, supporting mechanistic de-risking in target validation studies. This approach provides quantitative, reproducible imaging data that enhances predictive confidence in developmental biology models relevant to translational research. The protocol establishes standardized mounting techniques and transgenic tools that improve assay reproducibility and scalability for cross-functional R&D workflows.
The method supports the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to preclinical validation by enabling quantitative, reproducible imaging of developmental processes in a disease-relevant system.