DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

이 절차의 전반적인 목표는 측면 집단 세포의 염료 압출 용량을 기반으로 생물학적 샘플에서 추정되는 암 줄기세포 집단을 검출하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 샘플에서 암 줄기세포를 검출하고 정제하기 위한 신뢰할 수 있는 수단에 관한 암 줄기세포 연구의 핵심 질문을 해결합니다. 이 기술의 주요 장점은 기능 마커를 배포하여 더 나은 해상도를 제공한다는 것입니다.

또한 이러한 ABC 약물 수송체의 발현은 암 줄기 세포에서 고도로 보존되어 있으므로 다양한 암 개체에 이 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술의 의미는 고도로 정제된 암세포에서 유전자 발현 프로파일링 및 표적 검증과 같은 다운스트림 분석을 용이하게 하기 때문에 항암 줄기세포 치료제의 발견으로 확장됩니다. 따라서 이 방법은 암 줄기세포의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

우리는 또한 이 방법을 사용하여 골수와 같은 개체군을 발현하는 ABC 약물 수송체를 포함하는 시스템으로 특성화할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 기술자인 Elisabeth Hoflehner입니다. 먼저 10% FBS, 2mm L-글루타민 및 항생제가 보충된 10-30ml의 RPMI 1640 배지에서 원하는 인간 암 세포주를 섭씨 37도에서 배양합니다.

세포가 약 70-90% 합류점에 도달하면 배지를 제거하고 2밀리리터의 0.05% 트립신-EDTA를 추가하여 배양 접시 표면에서 세포를 분리합니다. 그런 다음 10ml의 배양 배지로 세포를 세척하고 현탁액을 깨끗한 15ml 튜브로 옮긴 다음 섭씨 4도에서 250배 G로 5분 동안 회전시킵니다. 세포가 펠렛화되면 최우수물질을 버리고 펠릿을 1ml의 배양 배지에 재현탁합니다.

세포 현탁액의 작은 부분 표본을 트리판 블루 용액과 혼합하고 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다. 테스트 샘플을 준비하려면 신선한 배양 배지에 세포를 현탁시켜 밀리리터당 6개 세포에서 1회 10개의 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 밀도를 조정한 후 샘플 3ml를 test라고 표시된 15ml 원형 바닥 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 샘플에 10마이크로몰의 보라색 염료를 추가하고 현탁액을 부드럽게 와류로 만듭니다. 다음으로, 세포 현탁액을 함유하는 염료 500마이크로리터를 대조군으로 표시된 두 개의 유세포 분석 튜브로 옮겨 억제 대조군을 준비합니다. 첫 번째 베라파밀 50마이크로몰을 추가합니다.

및 20 마이크로몰의 Fumitremorgin C를 두 번째 튜브에 연결합니다. 그리고 부드럽게 피펫팅하여 용액을 혼합합니다. 모든 튜브를 뚜껑으로 덮고 섭씨 37도의 어둠 속에서 90분 동안 배양합니다.

15분마다 샘플을 부드럽게 저어줍니다. 염색이 완료되면 3-4 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 억제 컨트롤을 세척합니다. 그리고 항체와 후속 costaining을 위해 테스트 샘플의 부분 표본을 준비합니다.

이 부분 표본도 세척하고 70미크론 차단 스트레이너를 통해 모든 샘플을 여과하여 잠재적인 세포 응집체를 제거합니다. 그런 다음 현탁액을 섭씨 4도에서 250배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 생성된 펠릿을 100마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨 후 세포를 빛으로부터 보호된 얼음 위에 유지합니다.

다음으로, 보라색 염료로 염색된 세포에 적절한 flurochrome conjugated antibodies 패널을 추가합니다. 현탁액을 소용돌이치고 20-30분 동안 어둠 속에서 섭씨 4도에서 배양합니다. 배양 후 3-4 밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 세척하고 원하는 경우 샘플을 여과합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 250배 G로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿화된 세포를 100마이크로리터의 PBS에 재현탁합니다. 마지막으로, 보라색 염료로 미리 염색된 세포에 7-AAD를 첨가합니다.

그리고 어둠 속에서 5분에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 유세포분석기를 사용하여 세포를 분석하려면 FSC SSC 점도표에서 적절한 세포 집단을 게이트합니다. 그런 다음 다른 FSC 신호를 사용하여 선택한 모집단에서 모든 세포 응집체를 제외합니다.

생존 가능한 세포의 모집단을 얻기 위해 양성 7-AAD 염색을 나타내는 세포를 제외합니다. 파란색 및 빨간색 염료 방출에 대한 점도표를 만들려면 y축에 파란색 형광 채널을 표시하고 x축에 빨간색 형광 채널을 표시합니다. 두 채널을 모두 선형 모드로 전환하고 사이드 모집단이 플롯의 왼쪽 하단에 위치하도록 검출기 전압을 적절하게 조정합니다.

그런 다음 측면 개체군을 게이트합니다. 그리고 인수를 중단하십시오. 다음으로, 억제 컨트롤을 불러오고 데이터를 수집합니다.

마지막으로, x축에 보라색 염료의 빨간색 형광을 표시하는 점도표를 만들고 로그 모드로 플롯된 y축에 적절한 형광 채널을 표시합니다. 샘플을 로드한 다음 그에 따라 검출기 전압을 조정하고 조사된 표면을 발현하는 측면 집단 세포의 파벌을 식별합니다. 그런 다음 데이터를 기록합니다.

여기에 제시된 것은 인간 난소암 세포에서 수행된 측면 개체군 분석의 대표적인 결과입니다. 청색과 적보라색 방출 분석으로 구별된 측면 개체군은 점도표의 왼쪽 하단 사분면에서 확인되었으며 분석된 전체 개체군의 0.70%를 구성했습니다. 나중에 유출 억제제의 사용은 이전에 확인된 세포에서 관찰된 형광 신호의 소멸을 초래하여 측면 집단 표현형을 확인했습니다.

마지막으로, 인간 난소 세포는 ABCG2 발현 측면에서도 특성화되었습니다. ABCG2 양성 염색은 확인된 측면 모집단에 해당하는 세포의 0.67%에서 관찰되었습니다. 일단 숙달되면 이 절차를 적절하게 수행하면 약 2-3시간 내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도할 때 side population phenotype은 세포 밀도 대비 최적의 염료 농도 비율에 엄격하게 의존한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 실험 전에 두 변수 모두에 대한 수화를 적극 권장합니다. 이 절차에 따라 유전자 발현 프로파일링과 같은 다른 방법을 수행하여 측면 집단 세포를 추가로 특성화하여 향후 약물 개발을 위한 새로운 암 줄기세포 특이적 표적을 식별할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 줄기세포 생물학 분야의 연구자들이 생쥐와 남성 모두에서 조직 줄기세포와 암 줄기세포의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 바이올렛 염료 유발 측면 집단 SA를 수행하는 방법과 자신의 실험실에서 생물학적 샘플에서 추정되는 암 줄기 세포를 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 생물학적 샘플로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행할 때 PPE 및 생물 안전 캐비닛 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.