DNA 염료에 의한 측면 집단 표현형을 활용하여 생물학적 샘플에서 암 줄기 세포를 검출하고 정제

이 실험 절차의 전체적인 목표는 side population 세포의 염료 배출 능력을 기반으로 생물학적 샘플 내의 추정 암 줄기세포 집단을 검출하는 것입니다. 이 방법은 생물학적 샘플로부터 암 줄기세포를 검출하고 정제하기 위한 신뢰할 수 있는 수단이라는 암 줄기세포 연구의 핵심 질문을 다룹니다. 이 기술의 주요 장점은 기능적 마커를 활용하므로 더 높은 해상도를 제공한다는 점입니다.

또한, 이러한 ABC 약물 수송체의 발현은 암 줄기세포 간에 매우 잘 보존되어 있으므로, 이 기술을 다양한 암 종에 적용할 수 있습니다. 이 기술의 효용성은 고도로 정제된 암세포에서 유전자 발현 프로파일링 및 표적 검증과 같은 후속 분석을 용이하게 하여, 항암 줄기세포 치료제 발견으로까지 확장됩니다. 따라서 이 방법은 암 줄기세포의 특성에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다.

우리는 또한 이 방법을 사용하여 골수와 같이 ABC 약물 수송체를 발현하는 세포 집단으로 구성된 시스템의 특성을 분석할 수 있습니다. 실험 절차 시연은 제 실험실의 테크니션인 Elisabeth Hoflehner가 맡아 진행하겠습니다. 먼저, 10% FBS, 2 mM L-glutamine 및 항생제가 첨가된 10~30 mL의 RPMI 1640 배지에서 원하는 인간 암 세포주를 37 °C로 배양하십시오.

세포가 약 70~90%의 합류도(confluence)에 도달하면, 배지를 제거하고 0.05% trypsin-EDTA 2 mL를 첨가하여 세포를 배양 접시 표면에서 분리합니다. 그다음, 10 mL의 배지로 세포를 세척하고, 현탁액을 깨끗한 15 mL 튜브로 옮겨 4 °C에서 250 ×g로 5분간 원심분리합니다. 세포가 펠렛으로 형성되면 상층액을 버리고, 펠렛을 1 mL의 배지로 다시 현탁합니다.

세포 현탁액의 소량 분취액을 트립판 블루 용액과 혼합하고 헤모사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 테스트 시료를 준비하려면, 신선한 배양 배지에 세포를 부유시켜 mL당 1×10⁶개의 세포 농도를 가진 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 밀도를 조절한 후, 시료 3 mL를 'test'라고 표시된 15 mL 라운드 바텀 튜브로 옮깁니다.

그 다음, 샘플에 10 µM의 바이올렛 염료를 첨가하고 현탁액을 가볍게 볼텍싱합니다. 이어서, 염료가 포함된 세포 현탁액 500 µL를 대조군으로 표시된 두 개의 유세포 분석 튜브에 옮겨 억제 대조군을 준비합니다. 첫 번째 튜브에 50 µM의 Verapamil을 첨가합니다.

두 번째 튜브에 20 µM의 Fumitremorgin C를 추가합니다. 그리고 파이펫팅을 통해 용액을 부드럽게 혼합합니다. 모든 튜브의 캡을 닫고 37 °C의 암소에서 90분 동안 배양합니다.

15분마다 샘플을 부드럽게 흔들어 섞어줍니다. 염색이 완료되면, 3~4 mL의 얼음처럼 차가운 PBS로 억제 대조군을 세척합니다. 그런 다음, 항체와 함께 진행할 후속 공동 염색을 위해 테스트 샘플을 분주하여 준비합니다.

이 분주액들도 마찬가지로 세척하고, 모든 샘플을 70 micron 컷오프 스트레이너로 여과하여 잠재적인 세포 응집물을 제거합니다. 그런 다음 현탁액을 4 °C에서 250 ×g로 5분 동안 원심 분리합니다. 결과물인 펠렛을 100 µL의 PBS에 재현탁시킨 후, 세포를 빛이 차단된 상태로 얼음 위에 보관합니다.

다음으로, 보라색 염료로 사전 염색된 세포에 적절한 형광 색소 결합 항체 패널을 추가합니다. 현탁액을 볼텍싱하고 4 °C의 암소에서 20~30분 동안 배양합니다. 배양 후, 3~4 mL의 차가운 PBS로 세포를 세척하며, 필요한 경우 샘플을 필터링합니다.

그런 다음 4 °C에서 250 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 펠릿 형태의 세포를 100 µL의 PBS에 재부유시킵니다. 마지막으로, violet dye로 사전 염색된 세포에 7-AAD를 첨가합니다.

그리고 샘플을 암소에서 5~10분 동안 배양합니다. 유세포 분석기로 세포를 분석하려면, FSC SSC 도트 플롯에서 적절한 세포군을 게이팅하십시오. 그런 다음, 서로 다른 FSC 신호를 사용하여 선택된 세포군에서 모든 세포 응집체를 제외합니다.

생존 세포 집단을 얻기 위해 7-AAD 염색 양성 반응을 보이는 세포를 제외합니다. 청색 및 적색 염료 방출에 대한 도트 플롯(dot plot)을 생성하려면 y축에 청색 형광 채널을, x축에 적색 형광 채널을 표시합니다. 두 채널을 모두 선형 모드(linear mode)로 전환하고, 사이드 포퓰레이션(side population)이 플롯의 왼쪽 하단에 위치하도록 검출기 전압을 적절히 조정합니다.

그 다음, side population을 게이팅합니다. 그리고 데이터 수집을 중단하십시오. 이어서 억제 대조군(inhibition controls)을 로드하고 데이터를 수집합니다.

마지막으로, x축에는 violet dye의 적색 형광을, y-axis에는 로그 모드로 설정된 적절한 형광 채널을 표시하는 도트 플롯(dot plot)을 생성합니다. 샘플을 로드한 후 검출기 전압을 적절히 조정하고, 조사 대상 표면을 발현하는 side population 세포의 분획을 확인합니다. 그 후, 데이터를 기록합니다.

여기 제시된 내용은 인간 난소암 세포를 대상으로 수행한 사이드 팝퓰레이션(side population) 분석의 대표적인 결과입니다. 청색 및 적자색 방출 분석을 통해 구별된 사이드 팝퓰레이션은 도트 플롯의 왼쪽 하단 사분면에서 확인되었으며, 분석된 전체 세포군의 0.70%를 차지했습니다. 이후 유출 억제제(efflux inhibitors)를 사용한 결과, 이전에 확인된 세포들에서 관찰되었던 형광 신호가 사라졌으며, 이를 통해 해당 세포들의 사이드 팝퓰레이션 표현형이 확인되었습니다.

마지막으로, 인간 난소 세포의 ABCG2 발현 특성을 분석하였습니다. 확인된 side population에 해당하는 세포의 0.67%에서 ABCG2 양성 염색이 관찰되었습니다. 이 절차에 숙달되면, 적절하게 수행했을 때 약 2~3시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, side population 표현형은 염료 농도와 세포 밀도 비율의 최적화 여부에 엄격하게 의존한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 실험 전에 이 두 변수에 대한 최적화 과정을 거칠 것을 강력히 권장합니다. 본 절차 이후에는 유전자 발현 프로파일링과 같은 다른 방법들을 수행하여 side population 세포의 특성을 추가로 규명함으로써, 향후 약물 개발을 위한 새로운 암줄기세포 특이적 표적을 식별할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 줄기세포 생물학 분야의 연구자들은 마우스와 인간 모두에서 조직 줄기세포와 암 줄기세포의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 바이올렛 염료 유도 사이드 파퓰레이션(SA) 수행 방법과 자신의 실험실에서 생물학적 샘플 내의 추정 암 줄기세포를 검출하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 생물학적 샘플을 다루는 것은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 개인 보호 장비(PPE) 착용 및 생물안전작업대 사용과 같은 예방 조치를 반드시 취해야 함을 잊지 마십시오.