Name: Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 배우세요 LC3, p62, LAMP1 공동국소화를 이용한 자가소화 유속 평가법을 다중스펙트럼 영상 유세포측정법으로 Jurkat 세포에서 정량적이고 객관적인 자가소화 분석을 수행하는 방법입니다.

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필자는 MilliporeSigma, Philip J. Morrissey 및 Sherree L. Friend의 동료들에게 수년 간 도움과지도를 해주신 것에 대해 감사드립니다. 이 책을 편집하는 데 도움을 준 IDEAS 소프트웨어의 BDC3 기능 , Ryan P. Jessup, 촬영 당일 도움을 준 Raymond Kong 및 특별 감사의 도움을 주신 Vidya Venkatachalam 및 Bryan R. Davidson에게도 감사드립니다. 메이크업 아티스트 Cynthia Xamonthiene.

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저는이 연구에서 사용 된 Amnis 브랜드 ImageStream의 제작자 인 MilliporeSigma에 고용되었습니다.

이 분석을 수행 할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 적절한 컨트롤 샘플을 갖는 것이 중요합니다. 이 실험을 위해 두 개의 다른 컨트롤이 사용되었습니다 : Control + Control + Chloroquine. Control 샘플을 사용하여 영역의 임계 값을 설정했습니다. 그것은 리소좀 분해를 멈추지 않으면 서 autophagy의 기초 수준을 나타내며 Starved 샘플의 컨트롤입니다. 그러나, Control 샘플은 Starved + Chloroquine 샘플의 결과와 비교할 수있는 적절한 컨트롤이 아닙니다. 왜냐하면 클로로퀸 자체가 컨트롤 샘플에 영향을 미치기 때문입니다. 그러므로 Control + Chloroquine 샘플이 필요했습니다. autophagy에 대한 분석을 수행하기 전에 하나 이상의 셀이 있거나 이미지가있는 경우 결과에 영향을 줄 수 있으므로 포커스가있는 단일 셀 ( 즉, 60보다 큰 그래디언트 RMS)에서만 분석 / 게이트를 분석하는 것이 중요합니다. 초점없는. 자궁이 중요하다.es와 lysosome은 적절한 spot count와 BDC3 분석에 초점을 맞추고있다. Apoptotic 세포는 autophagy 분석 전에 제거해야합니다, 그들은 결과를 왜곡 할 수 있으므로 포함되어서는 안됩니다. 세 가지 마커 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1) 모두에 대해 적절한 염색이 있어야합니다. 예를 들어, 3 개의 마커 모두는 세포 내 (intracellular)이며 점선 신호가 있어야합니다. 신호가 점을 찍지 않았거나 세포 표면에 있다면 염색이 적절하지 않아 실험 / 염색을 다시해야합니다. 또한 BDC3가 정확하려면 3 개의 형광 마커 모두에 밝은 셀을 게이트하는 것이 필수적입니다. 비특이적 결합, 이미징 인공물 및 / 또는 소음에 대한 BDC3 측정을 방지하려면 양성 반응에 대한 게이팅이 필요합니다. BDC3은 실제 신호가 아닌 인공물을 증폭시킬 수 있기 때문에 이것은 중요합니다. BDC3은 밝은 양성 반응에서만 수행 할 수 있으므로 많은 세포가 최종 분석에 포함되지 않을 수 있습니다. 이것은 특별하다.LC3, p62 및 / 또는 LAMP1의 축적이없는 대조군 세포에 대해서는 사실이다. 따라서,이 분석법의 한계는 BDC3가 세 가지 마커 모두에 대해 양성인 세포를 검사한다는 것인데, 이는 모든 자동 운동 실험에 적합하지 않을 수 있습니다. 이전에 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26으로 보고 된 BDS와 마찬가지로 BDC3만으로는 공동 위치를 결정하는 autophagy organelles의 수를 고려하지 않았기 때문에 autophagosomes의 수에있는 가변성의. 따라서, Rajan et al. 고용되었다. bivariate plot을 보면, if세포는 LC3, p62 및 LAMP1에 대해 양성이어야합니다. 0 점이있는 셀이 왜 그렇게 많습니까? 이는 LC3 신호가 동일 위치에 충분히 밝을 수 있기 때문에 피크 마스크 (피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4))로 설정된 임계 값을 충족시키지 못하기 때문입니다 자리. 여기에 제시된 프로토콜은 LC3 puncta를 계산하기 위해 MIFC를 사용하였고, autophagic 플럭스를 측정하기 위해 세 개의 autophagy 마커의 co-localization을 사용했습니다. 기초 조건 (Control sample) 하에서,자가 형광체의 수가 적었고, &quot;High Spot&quot;으로 세포가 거의 발견되지 않았다. autophagosome / lysosome 융합을 억제하는 chloroquine의 첨가로 LC3 spot의 수가 증가했다. 리소좀이 autophagosome과 autophagosome에있는 p62를 파괴 할 수 없기 때문에 LC3, p62 및 LAMP1 autolysosome 축적의 공존이 증가합니다. 이 효력은 영양이되는 starvat이온, autophagy를 유도합니다. 그러나 chloroquine을 첨가하지 않으면 autophagosom의 수는 현저히 증가하지 않았고, autophagos turnover의 속도가 증가했기 때문인 것으로 보인다. 세포가 chloroquine의 존재 하에서 굶어 죽었을 때, autophagosomes의 co-localization과 수의 증가가 있었는데, 기아가 autophagic 플럭스를 증가 시킨다는 결론을지지한다. EBSS는 강력한 autophagy 유도제로 알려져 있습니다. 따라서 증가가 클 것으로 예상됩니다. 약물 유도와 같은 다른 방법을 사용하여 autophagy를 유도하는 경우, 대조군과 치료 된 시료의 차이는 미묘합니다. 이 특정 프로토콜은 인간 세포주에서 autophagy를 측정하도록 고안되었지만 특정 종에 대한 항체로 전환하여 다른 종에 적용 할 수 있습니다. 또한, 분석 방법은 공동 지역화를 필요로하는 모든 세포 내 응용에 사용될 수있다3 개의 프로브 / 마커로 구성됩니다.

이후 autophagy라고 불리는 Macroautophagy는 손상되었거나 기능 불능 인 성분, 수명이 긴 단백질 및 세포 소기관이 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 과정입니다 1 . Autophagy는 autophagosome의 형성을 포함하는 동적 인 다단계 프로세스입니다. autophagosome과 lysosome의 융합, autolysosome 형성; 및 autolysosome 2 의 내용의 저하. 포유류 시스템에서 autophagy를 확인하는 데 사용되는 중요한 생물학적 마커는 autophagosomal membrane을 구성하는 미세 소관 관련 단백질 1A / 1B-L 鎖 사슬 3 (LC3)입니다. autophagy 동안, cytosolic LC3-1은 포스파티딜 에탄올 아민에 접합되어 LC3-II를 형성한다; LC3-II는 autophagosomal 막 3에 통합됩니다. autophagic 플럭스에 널리 사용되는 또 다른 마커는 autophagy 수용체 sequestosome 1 (SQSTM1, p62)입니다.autophagic 막에 autophagic화물을 nks 4 , 5 . 전통적으로 자식 작용을 측정하는 데 사용 된 방법은 서양 오 점 및 형광 현미경 (7)이다. 그러나 이들 방법 중 어느 것도이 두 가지 기법과 관련된 문제가 있기 때문에 &quot;황금 표준&quot; 2 , 6 으로 간주되지 않습니다. 웨스턴 블 롯은 균질 샘플을 사용하기 때문에 평균값을 제공하므로 관찰자는 개별 세포에서 일어나는 현상을 볼 수 없습니다. 반면에 형광 현미경 검사는 단일 셀 수준에서 관찰자 정보를 제공하지만 처리량 기능이 부족하여 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가를 얻지 못합니다. 최근 몇 년 동안 multispectral imaging flow cytometry (MIFC, Table of Materials 참조)에 의한 LC3와 p62의 측정이 popu정량 전력, 높은 처리량 기능, 다중화 가능성 및 모든 셀을 이미지화 할 수있는 능력으로 인해 희소성이 희박합니다. (재료의 도표 참조) 컴패니언 분석 소프트웨어와 함께 MIFC를 이용하여 자식 작용을 측정하기 위해 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, LC3의 puncta에 또는 autophagosomes 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14의 스폿 카운트 통해서 , 15 , 16 , 17 . 그러나, autophagosomes의 증가는 autophagy의 증가가 반드시 과정 2 의 봉쇄를 나타낼 수 있음을 의미하지는 않습니다. LC3 - II 회전율은 세포의 존재와 존재를 분석하여 autophagic 유동을 측정하는 데 유용한 매개 변수입니다.클로로퀸과 같은 리소좀 분해 억제제의 부재. 클로로퀸하여 18 발생할 수 리소좀 분해 전에 autophagic 플럭스 체포하여 자식 작용의 정도의 척도로서 autophagosome 형성의 정량을 허용, 리소좀에 autophagosome의 융합을 억제한다. 또한, p62는 주로 autophagy에 의해 분해되며, autophagosome의 lysosomal 분해와 그 내용물이 차단되면 p62의 축적이 예상됩니다 17 , 19 . Autophagy는 다단계 프로세스이며 LC3 또는 p62만으로는 세포에서 일어나는 일을 완벽하게 파악할 수 없습니다. 최근의 논문은 autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 의 동시 형성을 조사 할 필요성을 강조했다. MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - 15 리소좀에 autophagosome의 공동 촬상 지역화하여 autolysosome의 형성을 측정 할 수 의적. 또한, MIFC를 사용하여 p62와 LC3의 co-localization 또한 autophagic 플럭스 5 측정하기 위해 탐험되었습니다. 참조 된 분석 소프트웨어에서 동일 지역화를 측정하는 &quot;특징&quot;은 &quot;밝기 정보 유사성 R3&quot;(BDS)라고하며 두 이미지의 작고 밝은 이미지 세부 정보를 비교하도록 특별히 설계되었습니다. BDS는 로그 변환 된 Pearson의 반지름이 3 픽셀 이하인 지역화 된 밝은 점의 상관 계수입니다. 즉, BDS는 o의 정도를 계산합니다.두 개의 다른 형광 채널에서 픽셀을 verlapping. 밝은 지점은 상호 연관되어 있습니다 ( 즉, 동일한 공간 위치) 또는 비 상관 ( 즉, 다른 공간 위치). 따라서 상관 계수는 0 (상관 없음)과 1 (완전 상관) 사이에서 달라집니다. 계수를 로그 변환하여 범위를 0과 무한대 사이에서 26 , 27 로 증가시킵니다. BDS만으로는 충분하지 않을 수 있습니다. Rajan et al. BDS 만 사용하면 위양성 또는 위음성 결과가 발생할 수 있음을 발견했습니다 21 . BDS는 autophagy의 두 마커의 co-localization 평가하지만 autophagosomes의 수를 고려하지 않습니다. autophagosomes의 수를 설명하기 위해, Rajan et al. LC3 puncta 21 의 spot-counting을 포함합니다. Rajan et al. BDS에 비해 LC3 스폿 카운트의 2 변수 스 캐터 플롯을 사용하여 제안되었습니다. 이 두 변수를 사용하여, 두 집단먼저 확인 된 것은 LC3 스폿이 높은 세포와 LC3 스팟이 낮은 세포가있는 것입니다. 고 -LC3 자리 집단은 두 개의 집단으로 분류되었다 : 낮은 공 - 위치 화 ( 즉, 자가 - 포자충의 축적)를 갖는 세포 및 높은 공 - 위치 화 ( 즉, 오토 리소좀의 축적)를 갖는 세포. 이 2 변이 플롯은 극소수의자가 포식 세포와 autophagosomes 및 / 또는 autolysosome 21이 축적 된 세포를 구분할 수있게합니다. 지금까지 LC3, p62 및 LAMP1 (리소좀 마커)의 동시 공동 위치 화는 MIFC 동반자 분석 소프트웨어의 단일 &quot;피처 유형&quot;을 사용하여 가능하지 않았습니다 ( 재료 표 참조). 그러나 최근에 버전 6.1에서 소개 된 새로운 기능은 Bright Detail Colocalization 3 (BDC3)입니다. BDC3은 3 가지 이미지 각각의 밝은 디테일 이미지를 비교합니다 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)를 측정하고 세 가지 프로브 ( 즉, LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 지역화를 정량화합니다. BDC3 기능은 Pearson의 상관 계수를 수정하여 세 개의 이미지로 확장합니다. 세 이미지의 밝은 점이 상관되었거나 상관 관계가 없기 때문에 상관 계수는 0 (비 상관)과 1 (완벽한 상관) 사이에서 다릅니다. 계수는 0에서 무한대 사이의 동적 범위를 증가 시키도록 로그 변환됩니다. BDC3 기능을 사용하여 BDS 기능을 전환하면 Rajan et al. 동시에 하나의 시스템에서 자동 학습을 측정하기 위해 가장 많이 사용되는 3 개의 마커를 통합 할 수 있습니다. autophagy의 이러한 3 개의 마커를 단일 분석으로 공동 위치시킬 수있는 능력은 autophagy의 유도와 조절에 대한 새로운 통찰력을 이끌어 낼 수 있습니다. 다음 프로토콜은 Jurkat 세포에서 autophagy를 유도하는 단계를 개략적으로 보여줍니다. LC3, p62 및 LAMP1 항체로 세포를 표지하십시오. 멀티 스피어에서 데이터를 얻다.외과 적 이미징 유동 세포 계측기; autophagic 플럭스를 평가하기 위해 데이터를 분석 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>AF647 라벨링 동키 안티-마우스 - IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>당나귀 안티-마우스 IgG (H+L) 2차 항체, Alexa Fluor 647. Concntration 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td></tr><tr><td>안티 휴먼 CD107a-PE (LAMP1)</td> <td>BioLegend</td><td>328607</td><td>클론 H4A3. 농도 400 & 마이크로; g/mL입니다. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td></tr><tr><td>반인간 CD45- AF488</td><td>BioLegend</td><td>304017</td><td>클론 HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td></tr><tr><td>반인간 CD45- PE&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304008</td><td>클론 HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td></tr><tr><td>안티-휴먼 CD45-AF647&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>304018</td><td>클론 HI30.&nbsp; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td></tr><tr><td>Anti-LC3 (Human) mAb 클론 4E12</td><td>MBL International Corporation</td><td>M152-3</td><td>클론 4E+12.&nbsp; 농도 2 mg/mL.&nbsp; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td></tr><tr><td>Anti-SQSTM1 / p62 항체 [EPR4844] - 자가포식솜 마커 (Alexa Fluor 488)</td><td>abcam</td><td>ab185015</td><td>클론 EPR4844.&nbsp; 농도 0.5 mg/mL.&nbsp; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td></tr><tr><td>클로로퀸 디포스페이트 솔트</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6628-25G</td><td></td></tr><tr><td>클렌저 - 쿨터 클렌츠&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546931</td><td>200 mL의 클렌저가 담긴 용기를 채웁니다. https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td></tr> <tr><td>DAPI 염색제 5 mg/mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>508741 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td><td></td></tr><tr><td>Debubbler - 70% 이소프로판올</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.3704</td><td>Debubbler 200 mL로 용기를 채웁니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F Dulbecco의 인산염 완충 식염수 10x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-2010-B</td><td>&nbsp; Ca++Mg++ 무료&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 1x</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>PBS Ca++Mg++ 무료&nbsp;</td></tr><tr><td>Earle's Balanced Salt Solution 1x</td><td>Gibco</td><td>14155</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 10%, 메탄올 무함유, Ultra Pure</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>04018</td><td>이것은 4% 및 1% 포르말린에 사용되는 것입니다. 주의: 포르말린/포름알데히드는 흡입 및 삼키면 독성이 있습니다.&nbsp; 눈, 호흡기 및 피부에 자극적입니다. 흡입 또는 피부 접촉에 의해 과민반응을 일으킬 수 있음. 눈에 심각한 손상의 위험이 있습니다. 잠재적인 암 위험.&nbsp; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td></tr> <tr><td>행크스 밸런스드 솔트 솔루션 1x</td><td>Gibco</td><td>14175</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat, 클론 E6-1 (ATCC TIB-152)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 100x</td><td>HyClone</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>MIFC - ImageStreamX Mark II</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>405nm, 488nm 및 642nm 레이저로 설계된 2 카메라 ImageStreamX Mark II가 사용되었습니다. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td></tr><tr><td>MIFC 분석 소프트웨어 - IDEAS 6.2</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>MIFC(ImageStreamX MKII)의 동반 소프트웨어.&nbsp; IDEAS 버전 6.2</td></tr><tr><td>MIFC 소프트웨어 - INSPIRE</td><td>MilliporeSigma</td><td>100220</td><td>이것은 MIFC (ImageStreamX MKII)를 실행하는 소프트웨어입니다. INSPIRE 버전 200.1.388.0</td></tr><tr><td>PE anti-human CD107a (LAMP-1) 항체 클론 H4A3</td><td>BioLegend</td><td>328608</td><td></td></tr><tr><td>http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html Penicllin/Streptomycin/Glutamine 용액 100x</td><td>HyClone</td><td>SV30082.1</td><td></td></tr><tr><td>헹굼 - 초순수 또는 탈이온수</td><td>NA</td><td></td><td>초순수 또는 탈이온수를 사용할 수 있습니다.&nbsp; 용기에 헹굼 900mL를 채웁니다.</td></tr><tr><td>RPMI-1640 중간 1x</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>칼집 - PBS</td><td>MilliporeSigma</td><td>BSS-1006-B</td><td>이것은 Dulbecco의 Phosphate Buffered Saline 1X와 동일합니다. Ca++MG++ 무료.&nbsp; 용기에 칼집 900mL를 채웁니다.</td></tr><tr><td>실리콘 폴리프로필렌 미세 원심분리기 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td>Fisherbran 실리콘 저잔류 미세 원심분리기 튜브 1.5mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 용액(100mM)</td><td>HyClone</td><td>SH30239.01</td><td></td></tr><tr><td>살균기 - 0.4 - 0.7% 차아염소산염</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td>이것은 Clorox 표백제를 물로 희석하여 만들 수 있는 10% Clorox 표백제입니다.&nbsp; 용기에 200mL의 멸균제를 채웁니다.</td></tr><tr><td>시스템 검량 시약 - SpeedBead</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>400041 각 튜브는 ~10 mL를 담을 수 있습니다.&nbsp; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&nbsp;</td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>팔콘</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>TRITON X-100, 단백질 등급 세제, 10% 용액, 멸균 여과</td><td>MilliporeSigma</td><td>648463-50ML</td><td></td></tr><tr><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463 물, 세포 배양 등급&nbsp;</td><td>하이클론</td><td>SH30529.03</td><td></td></tr></tbody></table>

multispectral imaging flow cytometry를 사용하여 lc3, p62 및 lamp1 co-localization 측정을 통한 autophagic flux 평가

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Autophagy는 성장 및 분화 과정에서 축적되는 정상 또는 기능 장애 세포 구성 요소가 리소좀을 통해 분해되어 재활용되는 이화 경로입니다. autophagy 동안, cytoplasmic LC3 단백질은 지방화되고 autophagosomal membranes에 보충된다. autophagosome은 lysosome과 융합하여 autolysosome을 형성하는데, autophagosome 소포와 그 내용물의 분해가 일어난다. LC3에 결합하는 유비퀴틴 관련 단백질 p62는 또한 autophagic 플럭스를 모니터하는 데 사용됩니다. autophagy를 수행하는 세포는 p62, LC3 및 리소좀 마커의 동일 지역화를 입증해야합니다. Immunofluorescence 현미경 검사는 세포 단위로 LC3 puncta, p62 및 / 또는 lysosomes를 시각적으로 확인하는 데 사용되었습니다. 그러나 객관적이고 통계적으로 엄격한 평가는 얻기가 어려울 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 multispectral imaging flow cytometry와 함께 밝은 de3 개의 autophagy 마커 (LC3, p62 및 lysosomal LAMP1)로부터 꼬리 이미지를 추출하고 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 자동 계수를 측정하기 위해 LC3 스폿 카운팅과 함께 공동 위치를 정량화합니다.

이 분석 방법은 autophagic 플럭스를 분석하기 위해 여러 기능을 사용합니다. 최종 2 변량 플롯을 완전히 이해하려면 개별 분석 기능을 먼저 조사해야합니다. autophagosomes의 계산은 autophagy를 측정하는 논리적 인 방법입니다; 그러나 LC3 puncta의 크기 / 모양 / 밝기는 세포간에 크게 다를 수 있습니다. 변이로 인해 자동자가 염색체를 수동으로 계산하거나 분석 소프트웨어의 스폿 카운트 기능을 사용하기가 어려울 수 있습니다. 따라서, autophagosomes의 큰 변화 때문에 spot-count 기능은 완벽하지 않습니다. 그러나, 좋은 장소 카운트 기능은 대부분의 세포 (26)에 작동합니다. 도 3 은 상이한 스폿 마스크를 사용하여 Jurkat 셀에서 LC3 점을 스팟 마스킹하는 예를 도시한다. 이 데이터 세트에 대해 선택된 스폿 카운트 기능은 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4입니다. 즉, 스폿 카운트 기능이spot-to-cell 배경 비율이 4 (Bright, 4) 인 채널 11 (Ch11-LC3-AF647)의 기본 채널 11 마스크 (M11) 내에서 식별 된 마스크. 그림 4 는 대조군, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 평균 스팟 카운트에 대한 스폿 카운트 히스토그램과 대표 이미지를 보여줍니다 (anti-LC3-AF647로 표시). 대조군과 굶주린 평균 자리 수는 크게 다르지 않습니다. chloroquine을 첨가하면 Starved + Chloroquine에 비해 Control + Chloroquine의 평균값에 큰 차이가 있습니다. 조사 할 다음 기능은 BDC3입니다. BDC3은 세 개의 마커 / 프로브 (이 경우 LC3, p62 및 LAMP1)의 동일 위치 측정 값입니다. 그림 5A - 5D 는 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 BDC3 히스토그램을 보여줍니다. anti-p62-AF488, 항 -LAMP1-PE 및 항 -LC3-AF647을 포함한다. Control + Chloroquine은 Starved + Chloroquine 평균을 의미합니다. 그러나, 그림 5E - 5H 의 평균 BDC3 점수에서 세포의 이미지를 보면, 히스토그램이 믿을 수있는 것보다 더 큰 차이가 있습니다. 이것은 BDC3가 동일한 BDC3 점수에 대해자가 염색체의 수에 큰 변동성을 초래하는 동시에 공동 위치하는자가 작용 세포 소기관의 수를 고려하지 않기 때문입니다. 대부분의 경우, 기초 수준 에서조차, p62, LAMP1 및 LC3은 어느 정도까지는 세포의 유사한 영역에 공동 위치하거나 상주해야하기 때문에 세 가지 프로브 사이에 중첩이 존재합니다. 대조적으로, 그림 6 과 같이 Starved + Chloroquine 샘플에 대해 anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 및 DAPI 핵 염료가 공존하지 않아야하는 세 가지 프로브의 예 &lt;/ p&gt; 스폿 카운트 기능과 BDC3 기능이 결합되면 다양한 샘플 / 조건을 구별하는 기능을 향상시키는 하위 모집단의 존재가 분명합니다. 그림 7 은 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 네 가지 샘플에 대한 LC3 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 스팟 카운트의 이변 변수 플롯을 보여줍니다. Control 샘플은 Low Spots, High Spots / Low BDC3 및 High Spots / High BDC3의 세 가지 집단에 대한 게이팅 전략을 설정하는 데 사용되었습니다. 대조군 샘플은 세포의 98 % 이상이 1 개 이하의 반점을 갖는 것으로 나타났다. High Spots / Low BDC3과 High Spots / High BDC3 사이의 경계는 대조 샘플의 91 % 이상이 1 미만의 BDC3 스코어를 가졌기 때문에 BDC3 스코어가 1로 설정되었습니다. bivariate 플롯에 대한 결과 요약 표 1 에 나타냈다 . age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> 그림 1 : MIFC 악기 설정. 이 실험에 사용 된 MIFC 기기 설정의 스크린 샷으로 프로토콜의 8 단계에 설명되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> 그림 2 : 분석 소프트웨어 게이팅 전략. 프로토콜 9 단계에서 설명한 분석 소프트웨어 게이팅 구성표의 스크린 샷입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : LC3 스폿 마스킹. 스폿 카운트 기능을 만드는 데 사용되는 Jurkat 셀 이미지 및 마스크. BrightField (BF), LC3-AF647, 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 2), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4), 피크 (M11, Ch11-LC3-AF647 Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) 및 Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1) 표시된 모든 셀에서 가장 잘 작동하는 마스크는 Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> 그림 4 : LC3 스폿 카운트 히스토그램. 컨트롤 ( A , 연한 파란색), 스팟 카운트 기능 Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, 밝기, 4) _4 및 LC3-AF647 스폿 카운트 히스토그램을 사용하여 Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색) 및 Starved + Chloroquine ( D , 빨간색). Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 스팟 카운트는 각각 0.07, 1.13, 0.10 및 2.77입니다. (spot) 수에 대한 대표적인 세포의 LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 복합체 인 BF, LC3-AF647 (적색), DAPI 핵 염료 (청색) 및 대조군 ( E , 0 스팟), 대조 + 클로로퀸 F , 1 지점), Starved ( G , 0 지점), Starved + Chloroquine ( H 지점, 3 지점). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> 그림 5 : p62 / LAMP1 / LC3의 BDC3 히스토그램. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 히스토그램 fo( A , 연한 파란색), Control + Chloroquine ( B , 파란색), Starved ( C , 분홍색), Starved + Chloroquine ( D , 빨간색 Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine의 평균 BDC3 점수는 각각 0.57, 0.82, 0.74 및 0.98입니다. BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Control ( E ), Control + Chloroquine ( F ), Starved ( G ), 및 Starved + Chloroquine에 대한 대표적인 세포의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3- H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> 그림 6 : p62 / L의 BDC3 히스토그램굶주린 + 클로로퀸 시료의 경우 C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine 샘플에 대한 BDC3 p62 / LC3 / DAPI 히스토그램이 표시됩니다. 평균 BDC3 점수는 0.07입니다. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LC3-AF647 (적색); DAPI (파란색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 평균 BDC3에 대한 대표 세포의 p62-AF488, LC3-AF647 및 DAPI 이미지의 합성이 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> 그림 7 : LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved 및 Starved + Chloroquine Jurkat 세포에 대한 LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3의 2 변이 플롯. ( B ) BF; p62-AF488 (녹색); LAMP1-PE (황색); LC3-AF647 (적색); Starved + Chloroquine 샘플의 경우 3 개 영역 ( 즉, 낮은 스폿, 하이 스팟 / 로우 BDC3 및 하이 스팟 / 하이 BDC3)의 p62-AF488, LAMP1-PE 및 LC3-AF647 이미지가 합성되어 표시됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 세포 수 </td><td> 밝은 세부 Colocalization 3 평균 </td><td> 스팟 카운트 LC3 평균 </td><td> 낮은 곳 (%) </td><td> 높음 높음 / 낮음 BDC3 </td><td> 높은 반점 / 높음 BDC3 </td></tr><tr><td> 제어 </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> 대조 + 클로로퀸 </td><td> 1432 년 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> 굶주린 </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> 굶주린 + Chloroquine </td><td> 1811 년 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> 표 1 : Jurkat LC3 스팟 카운트 대 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 2 변량 플롯의 요약

여기에 LC3 spot counting과 함께 3 개의 autophagy marker의 밝은 디테일 이미지를 비교하고 co-localization을 정량화하는 분석적인 특징을 가진 multispectral imaging flow cytometry가 객관적이고 정량적이며 통계적으로 강력한 방식으로 autophagy를 측정하는 데 사용되었습니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

본 실험의 전체적인 목표는 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 오토파지를 측정하기 위해, LC3 펀크타 정량 분석과 병행하여 세 가지 오토파지 마커의 공국소화(colocalization)를 정량화하는 것입니다. 이 방법은 단일 분석으로 세 가지 오토파지 마커의 공국소화를 측정할 수 있게 하여, 오토파지의 유도 및 조절에 대한 새로운 통찰을 제공할 잠재력이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세 가지 오토파지 마커를 객관적이고 정량적이며 통계적으로 견고한 방식으로 동시에 측정할 수 있다는 점입니다.먼저 적절한 샘플 이름이 표시된 개별 15 milliliter 원심분리 튜브에 2 × 10⁶개의 Jurkat cells를 넣습니다. 다음으로, 각 튜브에 세척 완충액을 추가하여 각 샘플의 최종 부피를 15 milliliters로 맞춘 후 원심분리를 통해 샘플을 침전시킵니다. 침전물을 100 µL의 4% formalin에 재현탁한 다음, 라벨이 부착된 실리콘 처리된 폴리프로필렌 마이크로원심분리 튜브로 샘플을 옮깁니다.실온에서 10분 후, 1mL의 신선한 세척 완충액으로 샘플을 세척합니다. 펠렛을 투과화 완충액에 희석한 첫 번째 표적 항체 100µL에 재현탁하고, 빛이 차단된 실온의 암소에서 30분 동안 배양합니다. 라벨링 및 투과화된 세포를 1mL의 신선한 투과화 완충액으로 세척하고, 앞서 시연한 것과 같이 다음 표적 항체로 라벨링합니다.모든 시료에 최종 항체 표지를 마친 후, 펠렛을 1% formalin 용액에 재현탁하고 10x DAPI 핵 염색 시약 10 µL를 추가합니다. 가벼운 볼텍싱으로 세포를 혼합한 다음, 빛이 차단된 실온에서 10분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 다중 스펙트럼 이미징 유세포 분석기(multispectral imaging flow cytometer)에 기본 템플릿을 불러오고 적절한 레이저를 선택합니다.각 레이저 버튼 옆의 창에 원하는 레이저 출력을 입력한 다음, 로드 버튼을 클릭하여 1.5 milliliter 튜브를 장비에 로드하십시오. 전체 모집단에 대해 area M01 대 aspect ratio M01 도트 플롯을 생성하고, 세포 주변에 영역을 지정하십시오. 이 영역의 이름을 Cell로 지정하십시오.획득 파라미터를 설정합니다. 대상 폴더와 파일 이름을 지정하고 이벤트 수를 5,000개로 변경한 다음, 세포군을 선택하고 acquire를 클릭하여 파일을 획득하며, 앞서 시연한 것과 동일한 레이저 설정 하에서 나머지 샘플들을 실행합니다. 파일 수집이 완료되면 return을 클릭하여 샘플 튜브를 회수합니다.다분광 이미징 유세포 분석 데이터를 분석하려면, 이미징 분석 소프트웨어에서 '분석 시작(start analysis)'을 클릭하여 오픈 파일 마법사를 실행한 다음, '세포 사멸 마법사(apoptosis wizard)' 아이콘과 '마법사 선택(select wizard)' 버튼을 클릭하여 세포 사멸 마법사를 엽니다. 분석에서 모든 세포 사멸 세포가 제거되면, 비사멸 세포 주변에 영역을 지정하고 이 세포군을 'cells'로 라벨링합니다. 다음으로, '빌딩 블록(building blocks)' 아이콘을 클릭하십시오.형광 양성 단일 색상을 선택하고, 세포군과 강도 MC 채널 3을 선택하십시오. X축 레이블을 intensity lamp 1로 설정하고, 강도가 10,000보다 큰 세포들을 포함하는 영역을 지정하십시오. 이 영역의 레이블을 lamp 1 positive로 지정하십시오.동일한 방식으로 P62 및 LC3 양성 세포를 게이팅한 후, 분석(analysis) 탭을 클릭하고 마스크(mask)를 선택하십시오. '새로 만들기(new)'를 클릭한 다음 '함수(function)'를 선택하십시오. 함수 항목에서 '피크(peak)'를 선택하십시오.마스크에서 M11을 선택하십시오. 채널에서 채널 11을 선택하십시오. 스팟 대 세포 배경 비율을 4로 설정하십시오.그런 다음 확인을 클릭하여 정의된 마스크 기능 창을 닫고, 이어서 확인을 클릭하여 마스크 목록에 마스크를 추가합니다. 닫기를 클릭하여 마스크 관리자를 종료한 후, 분석 탭을 다시 클릭하고 기능을 선택합니다. 새로 만들기를 클릭합니다.특징 유형(feature type)에서 스팟 수(spot count)를 선택하고 방금 생성한 피크 마스크(peak mask)를 선택하십시오. 이름에 spot count LC3를 입력하고 확인을 클릭하십시오. 다시 새로 만들기(new)를 클릭하십시오.특징 유형(feature type)에서 bright detail colocalization three 또는 BDC3를 선택하십시오. 마스크(mask)에서는 MC를 선택하십시오. 이미지 1(image one)에서는 P62에 해당하는 채널 2를 선택하십시오. 이미지 2(image two)에서는 lamp 1에 해당하는 채널 3을 선택하십시오.이미지 3 아래에서 LC3에 해당하는 채널 11을 선택하십시오. 이름에 BDC3p62/LAMP1/LC3를 입력한 후, 확인 및 닫기를 클릭하여 피처 매니저(feature manager)를 종료합니다. 새 산점도 아이콘을 클릭하고 LAMP1 양성, p62 양성, LC3 양성 집단을 선택하십시오.X축으로는 BDC3/p62/LAMP1/LC3를, Y축으로는 spot count LC3 기능을 선택하고 확인을 클릭합니다. 파일 메뉴에서 데이터 분석 파일 저장을 선택한 후, 저장과 예(yes)를 클릭하여 starved plus chloroquine 데이터를 데이터 분석 파일로 저장하고 이전 버전의 파일을 대체합니다. 이제 컨트롤 파일을 열고 적절한 보정 매트릭스와 템플릿으로서 starved plus chloroquine 데이터 분석 파일을 선택합니다.확인을 클릭하십시오. 오토파고솜(autophagosome) 축적 및 오토라이소좀(autolysosome) 축적 영역을 생성하려면, 대조군 샘플을 열고 X축 좌표 0.1에서 3까지, Y축 좌표 1.5에서 0.3까지 직사각형 영역을 그리십시오. 이 영역의 이름을 low spots로 지정하십시오.다음으로, X축 좌표 0.1에서 1까지, Y축 좌표 17.5에서 1.5까지 영역을 지정하고 이 영역의 이름을 high spot low BDC3로 설정합니다. 이어서 X축 좌표 1에서 3까지, Y축 좌표 17.5에서 1.5까지 영역을 지정하고 이 영역의 이름을 high spots/high BDC3로 설정합니다. 컨트롤 파일을 저장하여 템플릿으로 사용할 수 있게 한 다음, 앞서 시연한 방식대로 컨트롤 파일을 템플릿으로 사용하여 starved plus chloroquine 파일을 포함한 다른 파일들을 엽니다. 서로 다른 스팟 마스크를 사용하여 Jurkat 세포의 LC3 puncta를 스팟 마스킹한 결과에서 관찰되는 것처럼, LC3 puncta의 크기, 모양 및 밝기는 세포마다 크게 다를 수 있습니다.본 실험에서 가장 효과적이었던 마스크는 세포 배경 대비 반점 비율이 4인 피크(peak) 마스크였습니다. anti-LC3가 표지된 Jurkat 세포의 대표적인 반점 수 측정 결과, 대조군과 기아 상태의 평균 반점 수는 유의미한 차이를 보이지 않았습니다. 하지만 클로로퀸을 처리했을 때, 대조군에 클로로퀸을 추가한 군과 기아 상태에 클로로퀸을 추가한 군의 평균값 사이에 큰 차이가 관찰되었습니다.본 실험에서는 측정된 대조군 BDC3 공국소화 평균과 기아 상태의 평균 사이, 그리고 대조군 및 클로로퀸 처리군의 평균과 기아 상태 및 클로로퀸 처리군의 평균 사이에 변화가 있었습니다. BDC3는 공국소화되는 자가포식 소기관의 수를 고려하지 않으므로, 동일한 BDC3 점수에서도 오토파고좀 수의 변동성이 크게 나타납니다. 실제로 대부분의 경우 세 가지 프로브 모두에서 중첩이 발생하는데, 이는 Beyza 수준에서도 p62, LAMP1 및 LC3가 어느 정도 세포 내 유사한 영역에서 공국소화되어야 하기 때문입니다.대조적으로, 공국소화되지 않아야 하는 세 가지 프로브인 P62, LC3 및 DAPI에서 BDC3 기능의 예시를 보여줍니다. 스팟 수와 BDC3 기능이 결합되면, 다양한 샘플과 조건 간의 구별 능력을 향상시킨 서로 다른 하위 집단의 존재가 분명해집니다.이 기법을 숙달하면 적절히 수행했을 때 약 8시간 만에 완료할 수 있습니다. 하지만 다른 반점 수 측정(spot count) 기능이 필요한 경우에는 추가적인 분석 시간이 소요됩니다. 이 절차를 시도할 때는 적절한 대조군을 사용하는 것이 중요하다는 점을 유의하십시오.예를 들어, 대조군 샘플을 사용하여 Beyza 수준 임계값을 설정하고, 클로로퀸을 추가한 대조군 샘플을 기아 상태에서 클로로퀸을 추가한 샘플의 대조군으로 사용하십시오. 이 절차는 관심 있는 적절한 항체로 변경함으로써 세 가지 서로 다른 마커의 공동 국소화가 필요한 다른 세포 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 오토파지 마커로 세포를 표지하고, 다색 이미징 유세포 분석기에서 데이터를 획득하며, 오토파지 흐름을 평가하기 위해 데이터를 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.포르말린을 이용한 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행하는 동안에는 항상 적절한 개인 보호 장구를 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

assessing-autophagic-flux-measuring-lc3-p62-lamp1-co-localization

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

자식 작용은 세포가 단백질과 세포 소기관을 분해하고 재활용 할 수있는 유비쿼터스 프로세스입니다. 우리는 시각화하고 작은 정량화 고급 형광 현미경을 적용하지만, autolysosomes로 형성과 autophagosomes와 리소좀의 배포, 자신의 융합 등 자식 작용의 유도와 관련된 필수, 물리적 변화.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

찬란 autophagy에 마커의 시간 경과 현미경은 높은 시간적 해상도로 동적 autophagy에 응답을 모니터링 할 수 있습니다. 3 가지 색상의 조합으로 특정 자식 작용과 세포 기관 마커를 사용하여, 우리는 강력한 공간과 시간적 맥락에서 autophagosome 형성 단백질의 기여를 볼 수 있습니다.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

활성 autophagy는 근육 줄기 세포 (MuSC) 활성화에 필수적인 생산적인 근육 재생과 관련이 있습니다. 여기, 우리는 LC3의 현장 검출을위한 프로토콜을 제공합니다. LC3는 대조군과 손상된 쥐의 근육 조직 절편의 MyoD- 양성 MuSC에서의자가 작용 마커입니다.

근육 줄기 세포에서 Autophagy의 원위치 Immunofluorescent 얼룩

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

우리는 autophagy및 마우스 간에서 proteasome를 통해 단백질 이화 작용에 있는 생물학 리듬을 측정하기 위한 우리의 프로토콜을 기술합니다.

자동 및 프로테아소말 플럭스에서 일주 리듬 측정

미토파지는 미토콘드리아 품질 관리의 주요 메커니즘입니다. 그러나, 생체 내 미토파지의 평가는 신뢰할 수 있는 정량적 분석의 부족으로 인해 방해를 받는다. 여기에 제시된 것은 세포 투과성 녹색 형광 미토콘드리아 염료와 적색 형광 리소좀 염료를 사용하여 살아있는 세포에서 미토파지를 관찰하기위한 프로토콜입니다.

미토콘드리아와 리소좀을 위한 형광 염료로 미토파지 시각화

이 프로토콜의 목표는 LC3 면역형광 및 LC3 도트 정량화를 통해 췌장암 및 췌장 전초 세포의 자가포식 수준을 결정하는 것입니다.

LC3 면역형광법을 사용하여 두 가지 다른 췌장 세포 모델에서 자가포식 수준 평가

여기서는 세포 초미세 구조와 관련된 희귀 단백질의 국소화를 조사하기 위한 도구로서 내인성 형광 표지를 기반으로 하는 최적화된 절편 상관 광전자 현미경을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법의 힘은 바필로마이신 처리 없이 굶주린 세포에서 내인성 LC3의 초구조적 국소화에 의해 입증되었습니다.

On-Section Correlative Light-Electron Microscopy를 통한 내인성 LC3의 초구조적 국소화

여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

유전 공학 또는 큰 샘플 크기를 요구하지 않고, 고유의 단백질 - 단백질 상호 작용의 구분, 강력하고, 생화학 평가를 허용하는 IP - FCM 방식은 제공됩니다.

IP - FCM : 유동세포계측법에 의해 감지 Immunoprecipitation

배우세요 LC3, p62, LAMP1 공동국소화를 이용한 자가소화 유속 평가법을 다중스펙트럼 영상 유세포측정법으로 Jurkat 세포에서 정량적이고 객관적인 자가소화 분석을 수행하는 방법입니다.

Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

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