Name: 단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays N 6 -threonylcarbamoyladenosine TcdA 기능 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 TcdA와 tRNA(UUU)의 상호작용을 아가로즈 겔 지연 분석으로 연구하는 방법을. 이 기술은 RNA 결합 단백질 특성화와 RNA 생물학 연구에 유용합니다.

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주의 : 사용하기 전에 관련된 모든 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성과 부식성이 있습니다. 흄 후드 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발 등 )의 사용을 포함하여 페놀을 사용하여 tRNA 추출을 수행 할 때 적절한 방법을 사용하십시오. 이 프로토콜은 무독성 핵산 얼룩을 사용합니다. 대체 얼룩의 사용은 독성 및 / 또는 발암 성 ( 예 : ethidium bromide)이있는 경우 염색제의 추가 예방 조치 및 특수 처분이 필요할 수 있습니다. 1. 아가로 오스 겔의 제조 <ol><li> 아가로 오스 2g을 달아 유리 병에 넣고 2 % w / v 아가 로스 겔을 만든다. </li><li> 아가로 오스 함유 병에 1X 트리스 - 보레이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TBE) 러닝 버퍼 100 ML을 추가합니다. 전자 레인지에서 가열하여 녹입니다. 30 초 간격으로 내용물을 혼합하여 혼합하십시오아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지이 단계를 반복하십시오. 아가 로스 용액을 약 50-60 ° C로 식힌다. </li><li> 겔 쟁반의 열린 가장자리를 테이프로 곰팡이를 만들고 적절한 빗을 넣어 우물을 만들고 용융 된 아가로 오스를 넣습니다. 거품 형성을 피하고 실온에서 응고 시키십시오. </li><li> 응고되면 겔 트레이를 전기 영동 장치에 넣고 겔이 완전히 덮일 때까지 TBE 완충액으로 채 웁니다. </li></ol> 2. tRNA의 제조 <ol><li> 대장균 에서 Express tRNA (UUU) <ol><li> 아침에 낮은 염 Luria Broth (LB)를 줄기 위해 발현 벡터 pET23d-EcUUU 2 ( 대장균 tRNA (UUU)를 코딩하는 유전자가 있음)로 형질 전환 된 냉동 E. coli BL21 (DE3) 100 μg / mL 암피실린을 보충 한 플레이트. 식민지가 나타날 때까지 접시를 뒤집고 37 ° C 배양기에 넣으십시오 (늦은 오후oon). </li><li> 5 ML LB + 100 μg / ML 암피실린에 잘 자란 단일 식민지를 접종하고 37 220 ML에서 밤새 성장 ° C. </li><li> 다음날 아침에 펠렛 세포 (4 ℃에서 10 분 동안 6,500 xg)를 5 ㎖ 신선한 LB + 100 ㎍ / mL 암피실린으로 재현 탁하고 재현 탁한다. 이 현탁액을 사용하여 200 mL LB와 100 μg / mL 암피실린을 접종하십시오. 37 ℃에서 220 rpm으로 5 시간 동안 성장시킨다. </li><li> 590 nm (OD 590 )에서 배양 물의 광학 밀도가 0.6 - 0.8에 도달 할 때, 1 mM IPTG를 배양 물에 첨가하여 tRNA (UUU) 유전자의 발현을 촉발시켰다. 37 ° C에서 3 시간 동안 배양하십시오. </li><li> 4 ° C에서 10 분 동안 6,500 xg에서 문화를 centrifuging하여 세포를 수확. </li></ol></li><li> 용해 및 추출 <ol><li> 5 ML의 용해 버퍼 (0.3 M 나트륨 아세테이트, 10 MM EDTA)에 세포 펠렛을 Resuspend. 이 시점부터 오토 클레이브 된 완충액을 사용하고 4 ℃에서 모든 tRNA- 함유 시료를 유지하여 tRNA 분해. </li><li> 흄 후드에 resuspended 세포 펠렛에 산성 페놀 (산도 4.3) 1 볼륨을 추가합니다. inversion에 의해 1 분간 혼합하여 세포를 용해시키고 10,000 xg (10 분, 4 ℃)에서 원심 분리한다. </li><li> 유기 (바닥) 단계를 대기음하지 않도록주의하면서 피펫을 사용하여 가용성 tRNA (UUU) (그리고 다른 tRNA 풀의 작은 농도)를 포함하는 상단 수성 단계를 수집하십시오. 유기층과 세포 잔해로 구성된 펠렛을 적절한 용기에 버리십시오. </li><li> 4 ° C에서 1 시간 동안 inversion하여 2.5 volume 100 % v / v 에탄올로 용해성 (수성) 상을 완전히 혼합하여 tRNA를 침전시킨다. 혼합물을 15,000 xg (30 분, 4 ° C)에서 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 조심스럽게 버리고 4 ML 겔 여과 버퍼 (20 MM 인산 나트륨 또는 인산 칼륨, 산도 7.4, 0.1 MM EDTA)에 tRNA가 풍부한 펠렛을 resuspend. 2 % w / v 아가로 오스 젤에 resuspended tRNA 풀 5 μL를 실행합니다. 노트:좋은 품질의 tRNA는 단일 밴드 (50-100 bp 사이의 분자 크기)로 나타납니다. </li></ol></li><li> tRNA (UUU)의 정제 <ol><li> 표준 크로마토 그래피 실습 12 에 따라 겔 여과 버퍼에서 미리 평형화 된 고해상도 분 취용 겔 여과 컬럼 (크기 : 16 x 600 mm, 베드 용적 : 120 mL, 분해능 범위 : 1,000 - 70,000 Da)에 재현 탁된 tRNA (UUU) (이동상). 샘플을 용리시키기 위해 유속을 1 mL / min으로 설정하십시오. 참고 : tRNA (UUU) 피크는 대략 75.5 mL에서 용리됩니다. 전형적으로, 배양 물의 0.5 내지 1.0 mg / L 수율의 tRNA가 수득 될 수있다. </li><li> 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 각 시료 5 - 10 μL를 전기 영동하여 대표 용리 부피에서 시료를 분석하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 샘플 준비 <ol><li> Lopez-Estepa et al .에 따라 TcdA를 표현하고 정제하십시오. 2 . 참고 : 최대 250 μMTcdA는 연구에 사용될 수 있습니다. </li><li> 표 1 에 따라 TcdA의 해당 양을 적절하게 표시된 1.5 mL 원심 분리 튜브에 피펫 팅합니다. 1.6 MM 트리스 (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) (최종 농도)을 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 뚜껑을 닫고 5 분 동안 실온에서 혼합물을 품어. </li><li> 10 μM의 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)와 50 mM MgCl 2 (최종 농도)를 첨가한다. 피펫과 혼합하고 실온에서 5 분 동안 혼합물을 품어. </li><li> 표 1에 따라 정제 tRNA (UUU) (섹션 2.3)를 추가하고 피펫과 섞은 다음 5 분 동안 실온에서 배양하십시오. </li><li> 최종 볼륨 100 μL까지 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 제대로 혼합하고 10 % v / v의 최종 농도에 글리세롤을 첨가하십시오. </li><li> 시료를 보텍스하고 튜브의 내용물을 잠깐 스핀 다운하십시오 (10,000 xg, 1 분, 4 ° C). </li></ol> 4. 겔 적재 및 전기 영동 개발<ol><li> 전기 영동을 수행하는 동안 챔버를 4 ° C로 유지하기 위해 분쇄 얼음으로 채워진 트레이에 전기 영동 장치를 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 각 샘플 5 μL를 해당 우물에 피펫 팅합니다. 적합한 DNA 크기 마커를 추가하십시오. </li><li> 전극을 전원 공급 장치의 해당 슬롯에 꽂습니다. 전원 공급 장치를 켜고 전압을 100V로 설정하고 90 분 동안 젤을 실행하십시오. </li></ol> 5. tRNA- 단백질 상호 작용을 관찰하기위한 젤 염색 <ol><li> TBE 50 ML과 적절한 DNA 얼룩 1X를 혼합하여 얼룩 솔루션을 준비합니다. 얼룩이있는 용기를 알루미늄 호일로 가려서 햇빛에 염색 용액을 노출시키지 마십시오. 참고 : DNA 얼룩은 일반적으로 10,000 또는 20,000 배 농축 주식으로 저장됩니다. </li><li> 전기 영동 90 분 후 조심스럽게 쟁반에서 젤을 제거하고 얼룩 솔루션과 컨테이너에 넣으십시오. 실내 온도에서 낮은 흔들림 속도로 로커에 올려 놓으십시오.30 분간 방치한다. </li><li> 염색 용기에서 아가로 오스 겔을 꺼내어 셀룰로오스 조직이나 여과지에주의하여 가볍게 두드려 과잉 액을 제거하고 직접 투광기 위에 놓습니다. 자외선을 켜고 tRNA가 포함 된 밴드를 시각화하십시오. 젤의 사진을 찍으십시오. </li><li> 단백질 염색 (선택). <ol><li> DNA 염색 용액을 안전하게 폐기하고 (안전 절차에 따라) 50 mL의 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 용액으로 대체하십시오. 트레이를 실온에서 로커에 놓고 밤새 얼룩이 져야합니다 (&gt; 12 시간). 과도한 염료를 제거 CBB 얼룩 솔루션을 폐기하고 50 ML PBS로 교체하십시오. 로커에서 1 시간 동안 처치하십시오. </li></ol></li><li> 가벼운 transilluminator에서 단백질 함유 tRNA 복합체를 시각화하고 젤의 사진을 찍어 tRNA UV 젤 그림과 비교하십시오. </li></ol>

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</ol>

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본원에 기술 된 단백질 -tRNA 아가로 오스 겔 지연 분석법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 첫째, 젤에서 아가로 오스의 비율은 여기 분석 (120 kDa)보다 훨씬 큰 단백질 - tRNA 복합체의 분리 및 시각화를 허용하기 위해 줄일 수 있습니다. 둘째, 목표 단백질이 열 안정성이있는 경우, 전기 영동 장치를 차가운 방으로 옮기거나 전기 영동 챔버 내부의 얼음 팩을 사용하여 생성 된 열을 즉시 소산시킴으로써 온도가 최대 허용 온도 이하로 유지되도록하는 추가 예방 조치가 취해 져야합니다 달리는 동안. 필요에 따라 또는 샘플 11에서 허용되는 경우 실행 시간을 단축하기 위해 다른 버퍼 조성물 ( 예 : 0.5X TB, 트리스 - 보레이트) 및 작동 매개 변수 (&gt; 20V / cm)를 수정할 수 있습니다. 제안 된 MgCl 2 농도는 시료 준비 단계에서 RNA 분해가 관찰되면 감소 될 수 있는데, 이는 2가 cati잠재적으로 핵산의 절단을...

<html> 겔 지연 분석 1 (전기 이동성 이동 분석, EMSA라고도 함)은 단백질 - 핵산 상호 작용을 연구하고 특성화하기 위해 고안된 전기 영동 방법입니다. 단백질 - RNA 상호 작용뿐 아니라 정제 된 성분 또는 단백질 ( 예 : 세포 용 해물) 또는 핵산 ( 예 : tRNA)의 복잡한 혼합물을 사용하여 tRNA와 tRNA 결합 단백질 간의 상호 작용뿐만 아니라 단백질 -DNA의 분석도 가능합니다 수영장). 우리는 정제 된 tRNA (UUU)와 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 threonylcarbamoyl 측쇄를 고리 화하는 N 6 - threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) 탈수 효소 인 TcdA 사이의 상호 작용 연구에 겔 지연 분석을 적용했습니다. tRNA의 cyclic t 6 (ct 6 A) 2 , 3 로의 전환. TcdA는 또한 CsdL 3 ,tcdA / csdL 유전자는 csdA 와 csdE 유전자를 갖는 클러스터를 형성하는데, 시스테인 탈황 효소와 시스테인 술핀 데스 탈 루핀 (CSD) 시스템의 황 수용체를 암호화하고 생체 내에서 TcdA 기능을 유지해야한다. 겔 지연 분석법의 근거는 유리 핵산 분자가 큰 음전하 때문에 아크릴 아마이드 또는 아가로 오스 겔의 앞쪽으로 빠르게 이동하지만 동일한 핵산의 단백질 복합체의 전기 영동 이동도가 크게 감소한다는 것입니다. 이동성의 감소는 핵산 - 단백질 복합체에서 &quot;이동&quot;으로 시각화되어 개별 밴드로 분해됩니다. 양전하를 띠고 큰 핵산 - 단백질 복합체는 겔상에서보다 큰 이동도 또는 이동도 감소를 나타낸다. 복합체의 전하 중화는 보편적 인 현상이므로단백질 - 핵산 복합체의 경우, 겔 지연 분석은 광범위한 복합체 및 핵산 유형에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 최소한의 장비로 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 소량의 단백질과 tRNA 만 있으면됩니다. 이것은 대체로 더 많은 양의 표본을 소비하는 대체 생물 물리 기술보다 유리합니다. 겔 지연 분석은 전사 인자 연구에 널리 사용되었습니다. 이 분석법은 많은 다른 DNA 서열에 대한 전사 인자의 결합 동역학, 강도 및 특이성을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 분야에서 실제로 EMSA가 처음 개발 된 것은 6 , 7 이었다. RNA 8 , 9 , 10 , 11 및 tRNA 분자를 이용한 겔 지연 분석도 리보솜 연구에 사용되었습니다우리가 여기에서와 같이 전사 후 tRNA 뉴 클레오 시드를 변형시키는 효소를 분석 할 수 있습니다. 다양한 매개 변수가 온도, 단백질 및 tRNA 샘플의 품질, 결합 강도와 같은 겔 지연 분석의 결과에 영향을 미칩니다. 실험의 신중한 계획과 실행은 유리 핵산과 단백질 결합 종의 결과 해석에 중요합니다. 여기에서, 프로모터가 Shine-Dalgarno 리보솜 결합 부위가 결여 된 발현 벡터에 클로닝 된 tRNA (UUU)를 코딩하는 합성 유전자를 사용하여 다량의 tRNA 2 의 합성을 유도 하였다. 이 상세한 프로토콜은 일반적인 실수를 피하면서 tRNA 겔 지연 실험을 수행하기위한 명확한 안내서를 제공하기위한 것입니다.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Novagen</td><td>70235</td><td>DE3 lysogen은 IPTG 유도 시 T7 중합효소를 함유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>pET23d</td><td>Novagen</td><td>69748-3</td><td>pET23d는 암피실린에 대한 내성을 부여합니다. T7 프로모터.</td></tr><tr><td>LB 육수, 저염 (Lennox L Broth), 과립</td><td>Melford</td><td>GL1703</td><td>기존 LB 육수, 고염도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10419313</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커 (온도조절 가능)</td><td>NBS</td><td>Excella E24&nbsp;</td><td>온도 조절 기능이 있는 모든 쉐이커 인큐베이터를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG), >=99%</td><td>아크로스 오가닉스</td><td>BP1755</td><td></td></tr><tr><td>소듐 아세테이트, 무수, >99%</td><td>멜포드</td><td>B4017</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디소듐 염, >99%</td><td>아크로스 유기물</td><td>AC327205000</td><td>흡입하면 유해합니다.</td></tr><tr><td>원심분리기(냉장)</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(냉장) 로터</td><td>Eppendorf</td><td>5430/5430P</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Sorvall</td><td>RC5C</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 로터</td><td>Sorvall</td><td>SLA-3000</td><td></td></tr><tr><td>페놀 용액, 0.1 M 구연산염 완충액으로 포화, pH 4.3 & 플러스 0.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4682</td><td>급성 독성 (경구, 진피, 흡입),</td></tr><tr><td>분석을위한 부식성 에탄올 절대, 100 % v / v</td><td>Merck Millipore</td><td></td> 100983 <td></td></tr><tr><td>인산 나트륨 이염기성 이수화물, Na2HPO4, > = 99 %</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>인산 이수소 칼륨, KH2PO4</td><td>Merck</td><td>48,730,250</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex 75&nbsp;</td><td>GE 헬스케어</td><td>28989333</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Melford</td><td>MB1200</td><td></td></tr><tr><td>Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td><td>Melford</td><td>T1513</td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Melford</td><td>B0503</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td></td><td>Haier HDA-2070M</td><td></td></tr><tr><td>TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706</td><td>금속과 피부를 부식시킵니다.</td></tr><tr><td>ATP[아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물], 등급 I, >=99%</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2), 무수, >=98%</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl), >99%</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl), >99%</td><td>멜포드</td><td>P0515</td><td></td></tr><tr><td>NZYDNA Ladder VI</td><td>NZYtech</td><td>MB8901</td><td></td></tr><tr><td>전원 공급 장치</td><td>Consort</td><td>EV261</td><td></td></tr><tr><td>전기 영동 장치</td><td>Real Laboratory</td><td>RELSMINI10</td><td></td></tr><tr><td>Real Safe 핵산 염색</td><td>Real Laboratory</td><td>RBMSAFE</td><td>20,000X 재고</td></tr><tr><td>UV Transilluminator (G : Box / EF)</td> <td>Syngene</td><td>2216498</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>록커 (자이로-록커)</td><td>스튜어트</td><td>SSL3</td><td></td></tr><tr><td>믹서 Vortex&nbsp;</td><td>피셔 브랜드</td><td>13214789</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 분석을위한 protein-trna agarose gel retardation assays<em&gt; n</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine tcda 기능

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

우리는 Escherichia coli 에서 tRNA (UUU)의 발현과 정제를위한 방법과 tRNA (UUU)와 N6- threonylcarbamoyladenosine (t6 A) 탈수 효소 인 TcdA의 결합에 대한 겔 지연 분석에 의한 분석을 시연한다. threonylcarbamoyl cyclic t6 A (ct6 A)에 tRNA의 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 측쇄. tRNA (UUU)를 암호화하는 합성 유전자의 전사는 1 ​​mM 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 갖는 대장균 에서 유도되고 tRNA를 함유하는 세포는 유도 후 24 시간에 수확된다. RNA 분획은 산성 페놀 추출법을 사용하여 정제한다. 순수한 tRNA는 소형 tRNA 분자를 더 큰 손상되지 않은 핵산 또는 조각난 핵산에서 효율적으로 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 얻어집니다. tRNA (UUU)에 대한 TcdA 결합을 분석하기 위해 TcdA를 tRNA (UUU)와 혼합하고 4 ℃에서 천연 아가 로스 겔로 분리한다.TcdA-tRNA (UUU) 복합체는 젤의 염색시 관찰 할 수있는 이동성 지연을 겪는 반면, 자유 tRNA (UUU)는 더 빠르게 이동합니다. 우리는 TcdA가 tRNA (UUU) 결합 효소임을 입증합니다. 이 겔 지연 분석은 TcdA 돌연변이 체와 첨가제 및 기타 단백질이 결합에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

강력한 유도 성 T7 프로모터의 제어하에 대장균 에서 tRNA 유전자를 발현시킴으로써 대량의 tRNA (UUU)를 얻을 수있다. 발현 된 tRNA (UUU)는 세포질에 축적되며 자연적으로 풍부한 tRNA 풀을 풍부하게합니다. 포획 / 추출 단계 및 겔 여과 / 연마 단계로 이루어진 2 단계 정제 공정을 이용하여 EMSA 급 tRNA를 수득 하였다. 포획 / 추출 단계는 단백질, 세포 파편, DNA 및 tRNA (및 기타 RNA 분자) 추출의 동시 침전을 달성하기 위해 pH 4.3 페놀을 사용합니다. 이 단계에서 총 tRNA 풀의 양은 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 전기 영동으로 평가할 수 있습니다. 두 번째 단계는 RNA 종류를 분자 크기에 따라 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피를 통합합니다. 254 nm의 UV 추적을 사용하여 분리를 모니터하고 주요 용리 피크를 확인합니다 ( 그림 1상단)....

프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA 기능

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 RNA 결합 단백질의 발견 및 특성 분석을 위해 설계된 RNA 겔 지연 분석법(RNA gel retardation assay)을 시연하는 것입니다. 이 분석법을 적용하여 TcdA와 운반 RNA(transfer RNA) 사이의 상호작용을 조사합니다. 아가로스 겔 지연 방법은 RNA 생물학 분야의 핵심 질문들에 대한 해답을 제공할 수 있습니다.예를 들어, 특정 단백질이 RNA와 상호작용하는지 여부, 해당 상호작용이 서열 특이적인지 여부, 그리고 상호작용의 강도 등이 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 적은 양의 단백질 및 RNA 샘플을 사용하며, 단백질-RNA 상호작용에 관한 매우 유익한 결과를 상당히 빠르게 얻을 수 있다는 점입니다. 이 방법은 단백질-tRNA 복합체에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 리보솜 RNA, messenger RNA 및 기타 모든 종류의 RNA 분자와 같은 많은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다.오전에 발현 벡터 pET-23D EC triple-U가 형질전환된 냉동 E coli BL21 DE3 바이알을 꺼냅니다. 100 \mu g/mL의 ampicillin이 첨가된 저염 luria broth 또는 LB 플레이트에 스트리킹합니다. 플레이트를 뒤집어 37 °C 인큐베이터에 넣고 늦은 오후에 콜로니가 나타날 때까지 배양합니다.잘 성장한 단일 콜로니 하나를 100 µg/mL의 ampicillin이 첨가된 LB 배지 5 mL에 접종하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 세포를 펠렛화합니다. 원심분리 후, 기존 배지를 100 µg/mL의 ampicillin이 첨가된 신선한 LB 배지 5 mL로 교체하고 재현탁합니다.이 현탁액을 사용하여 100 µg/mL의 ampicillin이 첨가된 200 mL LB 배지에 접종하십시오. 220 RPM, 37 °C 조건에서 5시간 동안 세포를 배양합니다. 590 nm에서의 배양액 광학 밀도가 0.6에서 0.8에 도달하면, tRNA triple-U 유전자의 발현을 유도하기 위해 배양액에 1 mM IPTG를 첨가하십시오.세포를 37°C에서 3시간 동안 배양한 후, 4°C에서 6500 ×g로 10분간 원심분리하여 세포를 수확합니다. 용해를 수행하려면, 먼저 세포 펠릿을 5 mL의 용해 버퍼에 다시 현탁합니다. 흄 후드 내에서 현탁된 세포 펠릿에 동일한 부피의 산성 페놀을 첨가하고, 1분간 도립 혼합하여 세포를 용해합니다.

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<em&gt; 체외</em&gt; 효소 분석은 갈륨 (III) 및 H에 의해 전사 억제를 측정하기 위해<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15 트리스 (펜타 플루오로 페닐) corroles

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핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

학습하세요 TcdA와 tRNA(UUU)의 상호작용을 아가로즈 겔 지연 분석으로 연구하는 방법을. 이 기술은 RNA 결합 단백질 특성화와 RNA 생물학 연구에 유용합니다.

단백질 분석을위한 Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays

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