심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 바이오 오봇 - 제 2 부

이 연구의 전반적인 목표는 미세 가공 장치에 심장 근육 세포를 채우고 이러한 장치에 있는 세포의 생화학적 및 생체역학적 특성과 시간 경과에 따른 성능을 특성화하는 것입니다. 여기에 설명된 물질은 미세 가공 장치에서 고밀도 세포 추가를 필요로 하는 다른 실험을 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 이 비디오에서 개발된 바이오액추에이터의 주요 장점은 다른 세포 유형의 세포 수축력을 정량화하는 데 쉽게 채택할 수 있다는 것입니다.

또한 줄기세포가 분화를 겪을 때 줄기세포의 생체역학적 특성의 변화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 시각적 시연은 텍스트 설명으로 세포 파종 단계를 배우기 어렵기 때문에 매우 중요합니다. 적절한 생물학적 기능에 필수적인 캔틸레버 암에 합류 세포 부착을 보장하기 위해 적절하게 수행되어야 합니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 Neerajha Nagarajan이 맡을 것입니다. 바이오로봇과 함께 T25 플라스크에서 시작하세요. 자석을 사용하여 플라스크 바닥에 고정합니다.

자석은 바닥에있는 유리 구슬의 무게로 인해 움직이지 않기 때문에 생물학적 액추에이터에 필요하지 않습니다. 깔때기로 사용할 작은 사각형 플라스틱 시트를 굴리고 멸균 깔때기를 바이오 로봇의 액추에이터 위에 놓습니다. 플라스크 상단을 조일 때 꼭 맞도록 장치와 높이에 맞게 넓은 끝의 직경을 조정합니다.

별도의 플라스크를 사용하여 깔때기의 핏을 테스트하고 조정합니다. 깔때기가 꼭 맞도록 하면 언급된 바와 같이 세포가 나머지 매체로 누출되지 않습니다. 이것은 캔틸레버 암의 합류 범위를 제공하는 데 필수적입니다.

깔때기가 제자리에 있는 상태에서 심근세포를 밀리리터당 1,600만 개의 세포 밀도로 완전한 DMEM으로 재현탁시키고 각 깔때기를 통해 장치에 400마이크로리터의 현탁액을 천천히 떨어뜨립니다. 그런 다음 장치나 내부의 깔때기를 방해하지 않고 플라스크를 인큐베이터로 천천히 다시 이동합니다. 세포가 섭씨 37도에서 24시간 동안 부착되도록 합니다.

잠복기가 끝나면 깔때기를 천천히 제거합니다. PBS로 샘플을 부드럽게 세척하고 각 플라스크에 10ml의 새 DMEM을 완전히 채웁니다. 그런 다음 바이오 로봇에서 자석을 제거하여 떠 있게 하고 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

인큐베이터에 줌 렌즈가 장착된 카메라를 장착하여 배양 중인 장치를 시각화합니다. 그런 다음 광원으로 사용할 LED 조명 스트립을 추가합니다. 그런 다음 카메라를 컴퓨터에 연결하고 이미징 프로그램을 엽니다.

프로그램에 들어가면 파일 탭에서 카메라 이미지를 클릭하여 모든 카메라 옵션을 열고 연결된 카메라를 선택합니다. 탭 목록에서 Live(라이브)를 선택하고 렌즈 다이얼을 조정하여 이미지에 수동으로 초점을 맞춥니다. 그런 다음 상단 패널에서 관심 영역의 자르기를 선택합니다.

그런 다음 생물학적 액추에이터 장치와 캔틸레버 암을 둘러싸는 비디오 프레임에 사각형을 수동으로 그려 관심 영역을 표시합니다. 바이오 로봇의 경우 장치의 수영 동작을 기록하기 위해 전체 화면을 캡처합니다. 그런 다음 카메라 설정을 선택하고 라이브 이미지의 노출과 픽셀 비율을 조정하여 프레임 속도를 설정합니다.

프레임 속도를 초당 약 30프레임으로 설정합니다. 마지막으로 녹화 버튼을 클릭하여 비디오 녹화를 시작합니다. 아이콘을 클릭하여 프로그래밍 소프트웨어를 엽니다.

로드되면 파일, 열기를 클릭하고 이미지 분석을 실행하기 위한 m 스크립트 파일을 선택합니다. 기록된 TIF 이미지와 해당 AVI 버전이 m 파일과 동일한 폴더에 있는지 확인한 다음 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 재생을 눌러 실제 프로그램을 시작합니다.

실행되면 열기 버튼을 클릭하고 분석할 TIF 또는 AVI 파일을 찾습니다. 그런 다음 기본 버튼을 클릭합니다. 캔틸레버가 맨 위의 베이스에 부착되는 지점을 선택하고 Enter 키를 누릅니다.

이렇게 하면 캔틸레버 베이스의 위치를 나타내기 위해 각 프레임의 이미지에 사각형 마커가 배치됩니다. 그런 다음 scale 버튼을 클릭한 다음 유리 구슬의 한쪽 가장자리를 수동으로 클릭합니다. 마우스 포인터를 유리 구슬의 반대쪽으로 가져오고 Enter 키를 누릅니다.

이렇게 하면 유리 구슬의 지름을 측정하는 선이 그려지고 지름이 표시된 픽셀과 관련됩니다. 분석 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 캔틸레버 베이스를 나타내는 첫 번째 사각형 마커에서 짧은 거리에서 캔틸레버를 따라 클릭합니다.

팁을 포함한 캔틸레버를 따라 계속 클릭하고 완료되면 Enter 키를 누릅니다. 이렇게 하면 캔틸레버에서 클릭된 각 지점에 X가 표시됩니다. 마지막으로 중첩된 원이 캔틸레버 프로파일을 올바르게 추적하는지 확인합니다.

올바르면 다음 프레임 버튼을 클릭합니다. 그러면 TIF 파일의 다음 프레임으로 전환됩니다. 모든 프레임에 대해 이 과정을 반복합니다.

모든 프레임이 처리되면 내보내기 버튼을 클릭합니다. 먼저 이미지 분석 소프트웨어를 열고 수영 바이오로봇 비디오 파일을 로드합니다. 그런 다음 스프레드시트 소프트웨어를 엽니다.

로드된 바이오로봇 비디오에서 유리 구슬과 같은 크기 참조를 찾습니다. 스트레이트 도구를 사용하여 유리 구슬을 가로질러 선을 그립니다. 그런 다음 Analyze(분석)를 클릭하고 Set Scale(배율 설정)을 선택합니다.

Known distance(알려진 거리) 입력란을 3, 000마이크로미터로 설정하고 OK(확인)를 클릭합니다. 장치에서 마커 역할을 할 프레임 간에 흔들리지 않는 지점을 선택하고 이 지점의 X 및 Y 좌표를 스프레드시트에 기록합니다. 이미지 분석 소프트웨어 창으로 다시 전환하고 오른쪽 화살표 키를 눌러 다음 프레임으로 변경합니다. 마커를 다시 가리키고 스프레드시트에 새 X 및 Y 좌표를 기록합니다.

모든 프레임에 대해 이 프로세스를 반복하고 데이터를 사용하여 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 바이오 로봇의 움직임을 분석합니다. 액추에이터의 정적 및 동적 응력은 매일 표면 응력에서 추출되었습니다. 정적 응력은 정지 상태에서 세포가 표면에 나타내는 수축 응력이고 동적 응력은 최대 수축 시 세포에 의해 생성되는 응력입니다.

세포가 배양에서 성숙함에 따라 시간이 지남에 따라 정적 및 동적 응력의 점진적인 증가가 관찰되었습니다. 그들은 6일차에 미터당 50밀리뉴턴의 최대 세포 견인력과 미터당 약 165밀리뉴턴의 최대 수축력을 보여주었습니다. 정적 및 동적 스트레스와 병행하여 심근세포 성숙, 성장 및 확산, 세포 상호 연결성에 대한 마커도 6일째까지 증가합니다.

비디오 분석을 기반으로 서로 다른 수영 프로필을 가진 3개의 바이오로봇에 대한 평균 수영 속도, 박동 빈도 및 스트로크당 이동 거리의 비교가 여기에 나와 있습니다. 수직 바이오 로봇은 박동 빈도가 가장 작지만 가장 높은 수영 속도와 이동 거리를 보여주었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생물학적 액추에이터 및 바이오 로봇으로 작동할 수 있는 미세 가공 장치에 심장 근육 세포를 파종하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 비디오에 설명된 이미지 획득 및 후속 데이터 분석 프로세스는 세포 동작과 장치 성능을 특성화하는 편리한 방법을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 심근세포의 수명은 제한되어 있으며 세포의 활성은 6일째에 최고조에 달한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그 후에는 시간이 지남에 따라 감소합니다.