Name: 노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 배우세요 다양한 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질을 분리하여 노화 관련 번역 후 수정을 연구하는 방법을. 자동화된 조직 분쇄 단계를 통해 고효율 샘플 처리가 가능하며, 질량 분석 기반 PTM 프로파일링과 면역침전 분석에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] 및 P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill에]의 NIH 교부금으로 지원되었습니다. 저자는 qPCR 및 웨스턴 블랏 실험에 대한 도움을 주신 Deekshita Ramanarayanan에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 수행됩니다. 1. 준비 사항 <ol><li> 트리톤 -X 버퍼 (1 % 트리톤 X-100, 5mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), pH 7.4)를 준비한다. 500 mL를 만들려면 Triton X-100과 500 mM EDTA 각각 5 mL를 PBS 490 mL, pH 7.4에 넣으십시오. 4 ℃에서 Triton-X 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 고 염분 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCl, 5 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100, 이중 증류수 (dd) H 2 O에서 부피를 높임)를 준비한다. 500 mL를 만들 때 : 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6) 10 mL, 5 M NaCl 14 mL, KCl 55.9 g, 0.5 M EDTA 5 mL 및 트리톤 X-100 2.5 mL를 넣고 부피를 500 mL). 4 ° C에서 고 염분 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 사용하기 바로 전에 적절한 양의 Triton-X와 High Salt Buffer ( <em&gt; 25 mL 조직 샘플 당 1 mL)를 프로테아제 또는 프로 테아 제 / 포스 파타 아제 억제제 칵테일로 처리하고 억제제가 포함 된 사용하지 않은 완충액을 버립니다. </li><li> 1X PBS, 산도 7.4에서 5 MM EDTA를 준비합니다. 500 mL를 만들려면 0.5 M EDTA 5 mL를 1X PBS (pH 7.4) 495 mL로 저어줍니다. </li><li> 수의과 지침 및 기관 표준을 준수하는 승인 된 프로토콜을 사용하여 다른 마우스 장기 (뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 결장, 내장, 신장, 비장)를 분리하십시오. 조직 수집 절차는 protease가 풍부한 조직 ( 예 : 췌장을 먼저 처리해야 함)의 RNA 및 단백질 완전성을 보존하기 위해 5 분 이상 걸리지 않아야합니다. </li><li> IF 유전자 발현을위한 후속 RNA 추출, cDNA 합성 및 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 소량의 조직 (~ 5 ~ 20mg)을 잘라내어 RNA 보관 용액에 넣으십시오. 밤새 4 ° C에서 조직과 RNA 저장 솔루션 튜브를 배치하고 추가로 s의 제조 업체 프로토콜을 따르십시오torage 및 격리 단계. </li><li> 조직의 나머지 부분을 작은 조각 ( 예 : 0.5cm)으로 자르고 냉동 보관하십시오. 장기 보관을 위해 -80 ° C 또는 액체 질소에서 바이 얼을 고정하고 저장하십시오. </li></ol> 2. IF 유전자 발현 분석 <ol><li> RNA 저장 용액 시약으로 보존 된 조직에서 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 적합한 / 바람직한 RNA 추출 방법을 사용하십시오. </li><li> RNA 농도를 정량하고 RNA의 2 μg을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다. </li><li> 생성 된 cDNA 및 마우스 IF 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 블랭크 컨트롤뿐만 아니라 각 샘플의 3 가지 기술 복제를 포함하여 qPCR 반응을 셋업 하였다. </li><li> IF 유전자 발현을 다른 조건 ( 예 : 젊은 조직 대 오래된 조직)을 비교 한 배수 변화로 정량화하십시오. </li></ol> 3. PImmunoblot에 대한 전체 조직 용 해물의 배상 <ol><li> 2x 비 환원성 SDS 시료 완충액 1 mL에 조직 25 mg을 균질화한다. 단백질 농도를 정량하기 위해 비색계 단백질 분석을 수행해야하는 경우 샘플 버퍼에서 bromophenol blue 염료를 생략하십시오. </li><li> 환원 된 시료를 만들기 위해 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 5 % (v / v)를 첨가하십시오. 비 환원 시료 200 μL에 2-ME 10 μL를 첨가합니다. </li><li> 세제 및 환원제 호환 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 염료가 이미 시료 완충액에 포함되어있는 경우, 쿠마시 (Coomassie) 기반 얼룩 24를 비롯한 다양한 기술을 통해 겔을 실행 한 후 단백질 양을 추정 할 수 있습니다. </li><li> 95 ° C에서 5 분간 가열 한 후 모든 시료를 소용돌이 친다. </li><li> 환원 조건과 비 환원 조건 모두에서 웨스턴 블 랏팅을 수행하십시오. 막을 단시간에 (&lt;1 분) 노출시켜 단량체 종을 나타내며, 더 길게 (&gt; 1 분) 고 분자량 복합체를 나타냄.IF 단백질. 응집체를 모니터링하는 경우 전체 겔 / 멤브레인 (겔 웰의 바닥 포함)을 검사하십시오. </li><li> 병렬 젤을 실행하고 단백질 얼룩과 함께 로딩 컨트롤 24 로 얼룩. 질병 모델이나 상해 실험에서, 총 단백질 얼룩은 로딩 대조군으로 사용되어야한다. 대조군은 다른 스트레스 조건 하에서 변화하기 때문에 &#39;하우스 키핑&#39;단백질 ( 예 : 액틴, GAPDH)에 대한 면역 블록과 대조적이다. </li></ol> 4. 조직 특이적인 IF의 세제 가용성 및 고염 추출물의 제조 <ol><li> 빙냉 Triton X-100 완충액 1 mL를 유리 튜브 균질화기에 넣고 얼음 위에 놓습니다. </li><li> 액체 질소 저장 장치에서 작은 조각 (~ 25mg)을 꺼내고 유리 균질기에 직접 놓습니다. 균질화 (50 스트로크) 및 거품 생성을 피하기 위해 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 유봉을 사용하십시오. 항상 균질 기와 lysate를 보관하십시오. </li><li> lysate를 1.5 mL micr로 옮긴다.미리 냉각 된 원심 분리기 (4 ° C)에서 10 분 동안 20,000 xg에서 얼음과 원심 분리기에 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이것은 Triton X-soluble fraction으로 면역 침전 (IP) 및 IF 단백질의 세제 가용성 풀 분석에 사용할 수 있습니다. 뇌 조직에서 더 깨끗한 IF 추출물을 얻으려면 4.1-4.4 단계를 반복해야합니다. </li><li> 조직 펠렛에 1 mL의 High Salt Buffer를 넣고 깨끗한 균질기로 옮겨 100 스트로크를 내 보낸다. 균질 물을 다시 마이크로 원심 분리 관으로 옮기고 차가운 방에있는 회전 진탕기에 1 시간 동안 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 xg에서 균질 물을 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 펠렛에 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA 버퍼 1 ML을 추가하고 최종 정리 단계 *로 깨끗한 균질 기에서 펠렛 (20 스트로크)를 균질. 새로운 튜브로 옮기고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하여 IF 단백질 -풍부한 고염 추출물 (HSE). * 선택적으로,이 단계에서 균질화 대신에 와동. </li><li> 뜨는을 버리고 사전 가열 된 비 환원성 SDS 샘플 버퍼 300 μL에 알약을 용해. 초기에 pipetting과 vortexing으로 pellet을 분리 한 후 95 ℃에서 5 분간 시료를 가열한다. </li><li> 펠렛이 녹아있는 것을 확인하기 위해 필요에 따라 와동과 피펫을 사용하십시오. 알약을 완전히 녹이기까지 몇 분이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 5. 대량 실험에서 IF 단백질 추출을위한 자동화 된 조직 용해 <ol><li> RNA 추출의 경우 lysing matrix D (작은 세라믹 구를 사용)와 tissue lyser에서 25 초 동안 두 번 맥박하는 튜브에 lysis buffer (조직 25mg 당 600μL 완충액)를 놓습니다. 20,000 xg에서 원심 분리하여 매트릭스에서 용 해물을 분리하고 다음 단계로 격리하십시오. </li><li> 단백질 추출을 위해, Trit 배치용해 매트릭스 SS (단일 스테인리스 스틸 비드 사용)가 포함 된 용해 튜브에서 X-100 (또는 총 용 해물을 준비하는 경우 SDS 샘플 버퍼)에 넣습니다. 여러 매트릭스를 테스트 한 후 전통적인 douncing 방법과 비슷한 품질의 IF 단백질 추출물을 생산하기 때문에이 매트릭스를 선택했습니다. 자동 방법은 췌장 및 비장에 최적이 아니므로 표준 균질화 프로토콜을 이러한 조직에 사용해야합니다. </li><li> High Salt Extract를 준비하려면 자석을 사용하여 스테인레스 강 비드를 튜브에서 꺼내고 4 ℃에서 20,000 xg로 10 분간 원심 분리합니다. </li><li> 수동 프로토콜의 4.4 단계 (위)를 계속 진행하십시오. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 6. 번역 후 변형 된 IF 단백질의 면역 강화 <ol><li> PBST 완충액 (PBS에 0.02 % 트윈 -20)을 준비합니다. 50 mL를 만들려면 PBS, pH 7.4의 50 mL에 Tween-20 10 μL를 넣으십시오. </li><li> PTM 항체 준비용액 (PBST 200 μL 중 항체 1 ~ 10 μg). 일반적으로 3 μg의 항체 / 반응은 필요한 경우 더 최적화 할 수있는 좋은 시작 조건입니다. </li><li> 각각의 반응에 대해 50μL의 자기 비드를 미세 원심 분리기 튜브에 분주하고 자석 위에 놓고 비드 보관 용액을 대기음을냅니다. </li><li> 항체 용액에 다시 부유하고 20 분 동안 실온에서 회 전자 (end-over-end, 소량의 혼합을 보장하기 위해)에서 배양하여 면역 침전 항체에 구슬을 접합시킨다. </li><li> 튜브를 자석에 놓고 항체 용액을 대기시 키십시오. </li><li> 200 μL PBST에 한 번 항체 - 복합 비드를 린스하고 세척 버퍼를 제거하십시오. </li><li> 차가운 방에 rotator에서 3 시간 동안 부드러운 pipetting 및 부화로 비즈에 조직 lysate 0.6-1 ML을 추가하십시오. </li><li> 자석에 튜브를 놓고 용해 액을 제거하고 PBST 200 μL로 5 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 100에서 비즈를 수집 _6, L의 PBS (트윈 -20)없이 깨끗한 새 튜브로 옮긴다. 튜브를 자석 위에 놓습니다. </li><li> PBS를 대기음으로하고 비 환원 시료 완충액 100 μL를가합니다. 50 μL를 제거하고 2-ME (5 %)를 첨가하여 환원 시료를 만듭니다. 샘플을 95 ℃에서 5 분간 가열합니다. </li><li> 자석에있는 구슬에서 ip 분수를 분리하고 새로운 관으로 그것을 모으십시오. </li><li> 분석 할 때까지 -20 ° C에서 시료를 보관하십시오. </li></ol> 7. 질량 분석을위한 IF 단백질 시료의 준비 <ol><li> 질량 분석법 분석과 관련하여 상당한 시간과 비용이 소요되므로 연구를 시작하기 전에 프로테오믹스 전문가와 상담하십시오. </li><li> 오염을 피하기 위해 특별한 예방 조치를 취하십시오. 깨끗한 장갑으로 모든 젤을 처리하고 ddH 2 O (비누 방지)만을 사용하여 씻은 깨끗한 용기에 품습니다. </li><li> 표준 조건에 따라 SDS - PAGE 젤에 HSE 샘플 (섹션 4와 5에서) 20 ~ 50 μL를 실행합니다. </li&gt; <li> 1 시간 동안 단백질 얼룩이있는 얼룩이 있습니다. 여러 번 헹구고 ddH 2 O에서 얼룩 제거하십시오. IF 단백질 밴드는 탈 염색 후 쉽게 볼 수 있어야합니다. </li><li> 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 젤을 놓고 분석하기 위해 잘라내어 보낼 밴드를 스캔하고 표시하십시오. </li><li> 새로운 깨끗한 면도기를 사용하여 IF 단백질 밴드를 제거하십시오. </li><li> 젤 밴드를 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 넣고 질량 분석기로 옮깁니다. </li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

IF 단백질이 생체 화학적 특성을 나타낼 수있는 방법은 IF 단백질이 세포 및 조직 스트레스의 마커이자 모듈레이터이기 때문에 포유류 시스템에서 수많은 병태 생리 현상을 이해하는 데 유용합니다. 현재의 방법 뒤에있는 원리는 일반적으로 저염소 용액과 고염 용액을 사용하는 세포와 조직으로부터 IF 단백질을 분리, 분리 및 재구성하기위한 1970 년대와 1980 년대에 개발 된 초기 절차를 토대로하고 Triton-X100 세제 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . IF 단백질의 생화학 적 분리를 뒷...

<html> IFs는 인간에서 73 개의 유전자로 코드화되며 여섯 가지 주요 유형으로 분류되는 단백질 군입니다. 유형 I-IV는 세포질 ( 예 : 상피와 모발 케라틴 (K), 근육 세포 데민 (amocyte desmin), 신경 섬유 (neurofilaments), 신경 교세포 성 산성 단백질 (GFAP) 다른 사람); type V는 핵 라미네이트입니다. 및 VI 형은 눈 렌즈 ( 1) 에서 IF이다. 분자 구조면에서 보면, IF 단백질은 크게 보존 된 코일 형 코일 &quot;막대&quot;도메인과 구형 &quot;머리&quot;및 &quot;꼬리&quot;도메인의 세 가지 공통 도메인을 가지고 있습니다. IF 단백질 4 량체는 조립되어 짧은 필라멘트 전구체를 형성하며 궁극적으로는 성숙 필라멘트에 결합되어 기계적 보호에 관련된 동적 세포 골격 및 핵 골격 구조를 형성 2 , 스트레스 센싱 3 , 4 , 전사 5 조절 및 성장 및 기타 중요한 세포 기능&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . IF 시스템의 기능적 중요성은 신경 병증, 근육 병증, 피부 허약 장애, 대사 기능 장애 및 조기 노화 증후군을 포함하여 IF 유전자의 미스 돌연변이로 인한 많은 인간 질병의 존재에 의해 강조됩니다. 일부 IF 유전자 돌연변이는 간 질환 9 의 단순한 상피 각질과 같은 병의 진행을 야기하지는 않지만 캐리어를 질병에 걸리기 쉽게 만든다. 후자는 상피 세포에서 IF의 중요한 스트레스 - 보호 기능에 기인한다. IFs는 일반적으로 기저 조건 하에서 가장 풍부한 세포 단백질 중 하나이지만, 다양한 유형의 스트레스 중에 더욱 강하게 유도됩니다 10 . 예를 들어 선충류 C. elegans 의 프로테옴 전반에 걸친 변화를 평가 한 최근의 연구에 따르면 여러 IF가 고도로 상향 조절되고 응집되기 쉬운 것으로 나타났습니다유기체 노화 동안 11 , 12 . 적절한 IF 구조의 유지가 다양한 형태의 스트레스에 대한 세포 내성에 필수적이기 때문에, IF 응집 또한 노화 동안 기능 저하에 기여할 수있다. 그러나 스트레스를받는 여러 조직에서 여러 포유류 IF 단백질을 검사하는 유기체 수준의 연구가 부족합니다. IF는 세포의 요구를 충족시키기 위해 적응하는 매우 역동적 인 구조입니다. 예를 들어, 케라틴은 용해성 (비 섬유 성)과 불용성 (섬유 성) 단백질 풀 사이의 생합성과 무관 한 순환을 거친다. 정상적인 생리 조건에서 총 K8 / K18 풀의 약 5 %는 트리톤 (non-ionic) 세제 인 Nonidet P-40에서 가용화 될 수있는 약 20 %와 비교하여 세제가없는 완충액에서 추출 될 수 있습니다. X100 14 , </s&gt; 15 . 유사 분열 중에는 표피 각질에서 덜 명백하지만 vimentin 및 기타 III 형 IF 단백질에서 더 뚜렷한 단순형 상피 K8 및 K18 14 의 용해도가 현저히 증가합니다 15,16. IF 단백질의 용해도 특성은 필라멘트 재 배열 및 용해성을위한 주요 번역 후 변형 (PTM) 인 인산화에 의해 엄격하게 조절됩니다 17 , 18 , 19 , 20 . 대부분의 IF는 보존 된 장소에서 다수의 PTM에 의해 광범위한 규제를 받아 기능적 변화가 일어납니다 17 . 이 방법의 목적은 여러 가지 마우스 조직에서 IF 단백질 연구를위한 생화학 적 추출 및 분석 방법에 대해 IF 분야에 처음으로 연구자를 소개하는 것입니다. 특유한우리는 고염 추출법을 사용하여 IF 단백질을 분리하고 질량 분광기 및 PTM 표적 항체를 통해 PTM의 변화를 평가하는 데 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 이전에 발표 된 절차를 바탕으로하지만 IF 가족 전체의 규제에 대한 일반적인 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 IF 단백질 유형을 추출하기위한 수정을 포함합니다. 예를 들어 특정 라이신 잔기의 K8 아세틸 화는 필라멘트 구성을 조절하는 반면과 아세틸 화는 K8 불용성 및 응집체 형성을 촉진합니다 22 . 최근의 세계적 proteomic 프로파일 링 연구는 또한 대부분의 조직 특이적인 IF 단백질이 또한 아세틸 화의 표적이며 대부분의 IF 아세틸 화 부위가 고도로 보존 된로드 도메인에 국한됨을 보여 주었다. 이는 IF 시스템의 글로벌 프로파일 링에 적합한 방법의 필요성을 강조합니다. 우리는 또한 opti에서 자동 균질화를 사용하여 여러 조직에서 IF 단백질을 단리하는 신속한 방법을 소개합니다mized lysing matrix. 생성 된 준비물은 질량 분광법 및 기타 방법을 통한 다운 스트림 PTM 분석에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>면역침전 비드</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>10010049 완충액용</td></tr><tr><td>Purelink RNA 미니 키트</td><td>ThermoFisher Scientific 12183018</td><td></td><td>조직에서 RNA 추출</td></tr><tr><td>Purelink DNAse 세트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12185010A</td><td>컬럼 DNA 분해</td></tr><tr><td>Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>자석, dynabeads</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain 시약</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>질량 분석 호환 겔 염색</td></tr>, <tr><td>Pierce ECL 웨스턴 블로팅 기판</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td>, <td>웨스턴 블롯 사용,</td></tr><tr><td>고용량 cDNA, 역전사 키트</td><td>, ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>유전자 발현 분석에 사용하기 위한</td>4368813</tr><tr><td>Proflex 3 x 32-well PCR 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4484073</td><td>PCR 시스템</td></tr><tr><td>PVDF 전달 멤브레인&nbsp;</td><td>웨스턴 블롯을 위한</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td></tr><tr><td>Power Up SYBR 마스터 믹스</td><td>qPCR 분석을 위한</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>RNA 분리 전 조직 보관을 위한</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td> 솔루션</tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Precast protein gel</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 8 항체 (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>for western blot detection of K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>for western blot detection of vimentin</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>for wet transfer of protein gels</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>for preparing 단백질 겔 샘플</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td>단백질 <td>겔 실행을 위한</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td></tr><tr><td>용해 비드 - 조직</td> 파괴 및 RNA 추출을 위한 Matrix D <td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Lysis 비드 및 매트릭스 튜브</td></tr><tr><td>Lysing beads - 조직</td><td>파괴 및 단백질 추출을 위한 Matrix</td> SS <td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td> Lysis 비드 및 매트릭스 튜브</tr><tr><td>NanoDrop Lite 분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td> 단백질 <td>및 핵산</td><td>ND-LITE</td> 측정</tr><tr><td>Precellys 24 균질화 기</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>Automated tissue homogenizer</td></tr></tbody></table>

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

중급 필라멘트 (IF)는 액틴 필라멘트 및 미세 소관과 함께 모든 세포의 중요한 구조 요소 인 세포 뼈대를 형성합니다. 정상 기능 IFs는 세포에 기계적 및 응력 복원력을 제공하는 반면 기능 장애 IF 세포 뼈대는 세포 건강을 손상시키고 많은 인간 질병과 관련이 있습니다. 생체 변화 및 스트레스 조건에 따라 IF 역학을 비판적으로 조절합니다. 따라서 IF의 PTM 시그니처의 변화를 모니터링하는 능력은 세포 손상 동안 스트레스 리스폰 더로서의 IF 시스템의 더 나은 기능적 이해 및 궁극적으로 컨디셔닝에 기여할 수 있습니다. 그러나, 70 개 이상의 개별 유전자에 의해 암호화되고 조직에 의존적 인 방법으로 표현되는 많은 수의 IF 단백질은 다른 PTM의 상대적인 중요성을 분류하는 데있어 주요한 과제입니다. 이를 위해 IF 단백질에서 PTM을 모니터링 할 수있는 방법고립 된 가족 구성원이 아닌 유기체 차원에서이 분야의 연구 진행을 가속화 할 수 있습니다. 여기에 우리는 9 개의 다른 마우스 조직 (뇌, 심장, 폐, 간, 소장, 대장, 췌장, 신장 및 간세포)에서 IF 단백질의 전체, 세제 가용성 및 세제 내성 분획을 분리하는 생화학 적 방법을 제시합니다 비장). 우리는 lysing 매트릭스와 다른 마우스 조직의 자동화 균질화를 사용하여 IF 단백질의 신속한 분리를위한 최적화 된 프로토콜을 입증합니다. 자동화 된 프로토콜은 높은 샘플 양 (예 : 여러 동물 및 실험 그룹이 포함 된 질병 모델)이있는 실험에서 IF를 프로파일 링하는 데 유용합니다. 결과 샘플은 질량 분석 기반 PTM 프로파일 링을 포함한 다양한 다운 스트림 분석에 활용할 수 있습니다. 이 방법들을 이용하여, 우리는 다른 마우스 조직 (뇌 및 간)에있는 IF 단백질이 그들의 표현과 관련하여 평행 한 변화를 겪는다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제공한다시온 (sion) 수준 및 PTMs.

lysing matrix를 이용한 다중 마우스 조직으로부터 IF 단백질의 고염 기반 추출을위한 새로운 신속한 방법. 상피 조직으로부터 중간 필라멘트 단백질 분획의 대량을 분리하는 전통적인 방법 25 , 26 은 9 개의 다른 기관을 포함하고 조직 용해를위한보다 신속한 절차를 포함하도록 여기에서 변형되었다. 기존의 방법에는 3 가지 수동 균질화 단계가 필요하지만 수정 된 절차는 수동 균질화 단계가 하나뿐이므로 몇 가지 절차를 단축 할 수 있으며 특히 6 개 이상의 시료를 처리 할 때 더욱 그렇습니다. 그림 1A 는 9 마우스 조직...

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

이 생화학적 절차의 전반적인 목표는 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트가 풍부한 분획을 분리하여, 조직 특이적 중간 필라멘트 단백질의 번역 후 수정을 연구하는 것입니다. 이 방법은 포유류의 노화 과정 동안 이러한 중요한 스트레스 보호 세포골격 단백질의 기능과 조절이 어떻게 영향을 받는지와 같은 중간 필라멘트 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자동화된 조직 용해 단계를 통합함으로써 사용자가 여러 조직 샘플을 신속하고 효율적으로 처리할 수 있다는 점입니다.먼저, 프로테아제 억제제가 첨가된 얼음처럼 차가운 Triton X-100 완충액 1 mL를 유리 튜브 균질기에 넣고 얼음 위에 둡니다. 액체 질소 저장소에서 작은 조직 조각을 꺼내 유리 균질기에 직접 넣습니다. 그런 다음 균질기와 샘플을 항상 얼음 위에 둔 상태에서, 폴리테트라플루오로에틸렌 파스틸을 사용하여 약 50회 스트로크하며 기포 형성을 최소화하면서 샘플을 균질화합니다.용해물을 얼음 위에서 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 4 °C에서 20,000 ×g로 10분 동안 원심분리합니다. 그다음, Triton X 가용성 상층액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이 분획은 면역침강 및 IF 단백질의 계면활성제 가용성 풀 분석에 사용할 수 있습니다.그 다음, 조직 펠릿에 프로테아제 억제제가 첨가된 고염 버퍼 1 mL를 추가합니다. 이를 깨끗한 균질기로 옮겨 100회 쳐줍니다(dounce). 균질물을 다시 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 냉장실 내의 회전 쉐이커에서 1시간 동안 둡니다.균질물을 4°C에서 20,000 ×g로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 펠렛에 얼음처럼 차가운 PBS EDTA 버퍼 1mL를 추가하고, 최종 정제 단계로 깨끗한 균질기로 옮깁니다. 균질화 후, 샘플을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 20,000 ×g로 10분 동안 원심분리하여 IF 단백질이 풍부한 고염 추출물(HSC)을 얻습니다.상층액을 제거하고 펠렛을 300 µL의 예열된 비환원 SDS 샘플 버퍼에 녹입니다. 처음에는 피펫팅과 볼텍싱으로 펠렛을 분쇄합니다. 그런 다음 샘플을 95 °C에서 5분 동안 가열합니다.펠릿이 완전히 용해될 때까지 필요에 따라 보텍싱하고 피펫팅하며, 이 과정은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 분석 전까지 모든 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오. RNA 추출을 수행하려면, lysine matrix D가 들어 있는 튜브에 용해 버퍼를 넣은 다음, 샘플 조직을 조직 파쇄기에 넣고 25초씩 두 번 펄스 작동시키십시오.20,000 ×g에서 원심분리하여 매트릭스로부터 용해물을 분리합니다. 단백질 추출을 위해, 전체 용해물을 준비하는 경우 Triton X-100 또는 SDS 샘플 버퍼를 추가합니다. lysine matrix SS가 포함된 lysine 튜브에 샘플 조직을 넣습니다. 샘플을 짧게 펄스 처리하여 혼합합니다.HSC를 준비하려면, 자석을 사용하여 튜브에서 스테인리스 스틸 비드를 제거하고, 4°C에서 20,000 ×g로 10분 동안 튜브를 원심분리하십시오. 상층액과 펠렛 분획을 분리하고 앞서 비디오에서 시연한 대로 진행하십시오. 50 mL의 PBS pH 7.4에 10 µL의 T20을 첨가하여 PBST 버퍼를 준비하십시오.그 다음, PBST 200 µL에 1~10 µg의 항체를 첨가하여 PTM 항체 용액을 준비합니다. 자성 비드 50 µL를 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 이를 자석 위에 놓은 다음, 비드 보관 용액을 흡입하여 제거합니다.비드를 항체 용액에 다시 현탁하고 회전 혼합기(rotator)를 사용하여 상온에서 20분 동안 배양함으로써 비드를 면역침전 항체에 결합시킵니다. 튜브를 자석에 놓고 항체 용액을 흡입하여 제거합니다. 그 다음 200 µL의 PBST를 사용하여 항체가 결합된 비드를 한 번 헹구고 용액을 제거합니다.조직 용해물 1mL에 0.6을 추가하여 비드와 혼합합니다. 파이펫팅으로 부드럽게 섞은 후, 저온실의 로테이터에서 3시간 동안 용액을 배양합니다. 튜브를 자석 위에 올려놓고 용해물을 제거한 다음, 200µL의 PBST를 사용하여 비드를 5회 세척합니다.마지막 세척 단계 후, 비드와 100 µL의 PBS를 수집하여 새 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자석 위에 놓은 다음 PBS를 흡입하여 제거합니다. 튜브를 자석에서 분리하고 100 µL의 비환원 샘플 버퍼를 추가합니다.튜브에서 50 µL를 분취하여 5% 2ME와 혼합해 환원 시료를 만듭니다. 시료를 95 °C에서 5분 동안 가열합니다. 튜브를 자석 위에 놓고 비드로부터 IP 분획을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.분석 전까지 샘플을 -20°C에서 보관하십시오. 질량 분석용 단백질 샘플의 오염을 방지하기 위해, 모든 젤을 취급할 때는 깨끗한 장갑을 사용하고 DD H2O로만 세척한 깨끗한 용기에서 배양하십시오. 표준 조건에 따라 20~50 µL의 HSE 샘플을 SDS page 젤에서 전기영동하십시오.텍스트 프로토콜에 따라 젤을 염색한 후, 플라스틱 시트 보호기 사이에 젤을 넣습니다. 그런 다음 스캔하여 절단할 밴드를 표시합니다. 새롭고 깨끗한 면도날을 사용하여 IF 단백질 밴드를 절단하고, 질량 분석 분석을 위해 제출하기 전까지 깨끗한 마이크로원심분리 튜브에 담아 얼음 위에 보관하십시오.이 그림은 신속한 방법을 사용하여 분리한 9가지 마우스 조직의 전형적인 HSE 결과물을 보여줍니다. 이 방법은 췌장과 비장에서는 잘 작동하지 않으며, 대장 샘플에서는 추가 밴드가 생성된다는 점에 유의하십시오. 이 유전자 발현 분석은 노화 과정 동안 Keratin 8이 상향 조절됨을 보여줍니다.또한, 웨스턴 블롯 결과 고령 쥐의 간에서 Keratin 8이 강하게 상향 조절됨을 보여줍니다. 여기서는 자동화 프로토콜을 사용하여 얻은 간 HSE가 겔 상에서 Keratin 8과 18의 강력한 농축을 입증합니다. 질량 분석 분석 결과, 고령 쥐 간의 K8 및 K18에는 젊은 쥐의 간에서는 나타나지 않는 다수의 인산화 및 아세틸화 부위가 있음이 확인되었습니다.간에서의 케라틴 변화와 유사하게, QPCR을 통한 뇌 조직 분석 결과 24개월령 마우스의 뇌에서 3개월령 마우스에 비해 GFAP mRNA가 5배 유도된 것으로 나타났습니다. 마지막으로, Coomassie 염색을 이용한 고염 추출물의 단백질 분석과 전체 및 아세틸 라이신 농축 분획의 면역 블롯 분석을 통해, 노화된 마우스 뇌에서 GFAP 단백질이 상향 조절되고 아세틸화되었음을 확인했습니다. 이 절차 이후에, 질량 분석 기반의 프로테오믹스와 같은 다른 방법들을 사용하여 다양한 생리적 및 병리적 조건에서 중간 필라멘트 단백질의 중요한 번역 후 변형 및 결합 파트너가 무엇인지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다.이 영상을 시청한 후에는 다양한 포유류 조직에서 중간 필라멘트 단백질을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

isolation-intermediate-filament-proteins-from-multiple-mouse-tissues

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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