노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

이 생화학적 절차의 전반적인 목표는 서로 다른 조직 특이적 중간 필라멘트 단백질의 번역 후 변형을 연구하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트가 풍부한 분획을 분리하는 것입니다. 이 방법은 포유류의 노화 동안 이러한 중요한 스트레스 보호 세포골격 단백질의 기능 및 조절이 어떻게 영향을 받는지와 같은 중간 필라멘트 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 자동화된 조직 용해 단계를 통합하여 사용자가 여러 조직 샘플을 빠르고 효율적인 방식으로 처리할 수 있다는 것입니다.

먼저 프로테아제 억제제가 보충된 얼음처럼 차가운 Triton X-100 완충액 1ml를 유리관 균질기에 넣고 얼음 위에 놓습니다. 액체 질소 저장소에서 작은 조직 조각을 제거하고 유리 균질화기에 직접 놓습니다. 그런 다음 균질화기와 샘플을 항상 얼음 위에 유지하면서 폴리테트라플루오로에틸렌 파스틸을 약 50회 사용하여 기포 형성을 최소화하면서 샘플을 균질화합니다.

얼음에 1.5 밀리리터 마이크로 분리기 관으로 용해물을 옮기고, 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 000배 G에 표본을 분리기를 설치하십시오. 다음으로, Triton X 용해성 상등액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이 분획은 면역 침전 및 IF 단백질의 세제 용해성 풀 분석에 사용할 수 있습니다.

그런 다음 조직 펠릿에 프로테아제 억제제가 보충된 고염 완충액 1ml를 추가합니다. 깨끗한 균질기로 옮기고 100회 치십시오. 균질액을 다시 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 냉장실의 회전하는 셰이커에 1시간 동안 놓습니다.

20, 20 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 000 시간 G에 균질화액을 원심분리기하고 상층액을 버리십시오. 펠릿에 1ml의 얼음처럼 차가운 PBS EDTA 완충액을 추가하고 최종 세척 단계로 깨끗한 균질기로 옮깁니다. 균질화 후에, 새로운 관으로 표본을 옮기고 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 000배 G에 IF 단백질 부유한 높은 소금 추출물, 또는 HSC를 얻기 위하여 그것을 원심 분리하십시오.

상등액을 버리고 펠릿을 300마이크로리터의 예열된 비환원 SDS 샘플 버퍼에 용해시킵니다. 처음에는 피펫팅과 볼텍싱으로 펠릿을 분해합니다. 그런 다음 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 가열합니다.

펠릿이 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 필요에 따라 Vortex와 피펫을 사용하며 몇 분이 걸릴 수 있습니다. 분석할 때까지 모든 시료를 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. RNA 추출을 수행하려면 라이신 매트릭스 D가 들어 있는 튜브에 용해 버퍼를 추가한 다음 샘플 조직을 조직 용해기에 추가하고 각각 25초 동안 두 번 펄스합니다.

20, 000 시간 G.For, 단백질 적출에 원심분리에 의해 모체에서 lysate를 분리하십시오, 총 lysate를 준비하는 경우에 Triton X-100 또는 SDS 견본 완충기를 추가하십시오. 라이신 매트릭스 SS가 있는 라이신 튜브로. 그런 다음 샘플 조직을 추가합니다. 샘플을 펄스하여 짧게 섞습니다.

HSC를 준비하기 위하여는, 관에서 스테인리스 구슬을 제거하기 위하여 자석을 사용하고, 20, 10 분 동안 4 섭씨 온도에 있는 000배 G에 관을 원심 분리하십시오. 상등액과 펠릿 분획을 분리하고 비디오의 앞부분에서 설명한 대로 진행합니다. 10마이크로리터의 T20을 50밀리리터의 PBS pH 7.4에 첨가하여 PBST 버퍼를 준비합니다.

그런 다음 200마이크로리터의 PBST에 1-10마이크로그램의 항체를 첨가하여 PTM 항체 용액을 준비합니다. 50마이크로리터의 마그네틱 비드를 마이크로 원심분리기 튜브에 분취합니다. 자석에 놓고 비드 보관 용액을 흡입합니다.

항체 용액에 비드를 재현탁시키고 실온에서 20분 동안 회전체에서 샘플을 배양하여 비드를 면역침전 항체에 접합합니다. 자석에 튜브를 놓고 항체 용액을 흡인합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBST를 사용하여 항체 접합 비드를 한 번 헹구고 용액을 제거합니다.

0.6에서 1 밀리리터의 조직 용해물을 비드에 첨가합니다. 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 용액을 차가운 방의 회전판에서 3시간 동안 배양합니다. 튜브를 자석에 놓고 용해물을 제거한 다음 200마이크로리터의 PBST를 사용하여 비드를 5번 세척합니다.

마지막 세척 단계 후 비드와 PBS 100마이크로리터를 모아 깨끗한 새 튜브로 옮깁니다. 튜브를 자석에 놓고 PBS를 흡인합니다. 자석에서 튜브를 제거하고 100마이크로리터의 비환원 샘플 버퍼를 추가합니다.

튜브에서 50 마이크로 리터를 분취하고 5 % 2ME와 결합하여 샘플을 줄입니다. 샘플을 섭씨 95도까지 5분 동안 가열합니다. 튜브를 자석에 연결한 상태에서 비드에서 IP 분획을 수집하여 새 튜브로 옮깁니다.

분석할 때까지 샘플을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 질량 분석 분석을 위한 단백질 샘플의 오염을 방지하려면 깨끗한 장갑을 사용하여 모든 겔을 다루고 DD H2O로만 세척된 깨끗한 용기에 겔을 배양합니다. 표준 조건에 따라 SDS 페이지 젤에서 20-50마이크로리터의 HSE 샘플을 실행합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 젤을 염색한 후 플라스틱 시트 보호대 사이에 젤을 놓습니다. 그런 다음 절제할 밴드를 스캔하고 표시합니다. 질량 분석 분석을 위해 제출하기 전에 새롭고 깨끗한 면도기를 사용하여 IF 단백질 밴드를 절제하고 얼음 위의 깨끗한 마이크로 원심분리 튜브에 밴드를 놓습니다.

이 그림은 신속한 방법을 사용하여 분리한 9개의 마우스 조직에서 HSE의 일반적인 결과를 보여줍니다. 이 방법은 췌장과 비장에 잘 작동하지 않으며 대장 샘플에서 추가 밴드를 생성합니다. 이 유전자 발현 분석은 케라틴 8이 노화 중에 상향 조절된다는 것을 보여줍니다.

또한, 웨스턴 블롯은 케라틴 8이 늙은 쥐의 간에서 강력하게 상향 조절된다는 것을 보여줍니다. 여기서, 자동화된 프로토콜을 사용하여 얻은 간 HSE는 겔에서 케라틴 8 및 18의 강력한 농축을 입증합니다. 질량 분석 분석에 따르면 늙은 쥐의 간에 있는 K8 및 K18에는 젊은 쥐의 간에는 존재하지 않는 여러 인산화 및 아세틸화 부위가 있습니다.

간의 케라틴 변화와 유사하게, QPCR에 의한 뇌 조직 분석은 3개월 된 쥐에 비해 24개월 된 쥐의 뇌에서 GFAP mRNA가 5배 유도되는 것을 보여줍니다. 마지막으로, Coomassie 염색에 의한 고염 추출물의 단백질 분석과 총 및 아세틸 라이신 농축 분획의 면역 블롯은 GFAP 단백질이 노화된 쥐의 뇌에서 상향 조절되고 아세틸화됨을 밝힙니다. 이 절차에 따라 질량 분석 기반 단백질 혼합물과 같은 다른 방법을 사용하여 다양한 생리학적 및 병태생리학적 조건에서 중간 필라멘트 단백질의 중요한 번역 후 변형 및 결합 파트너는 무엇인지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다른 포유류 조직에서 중간 필라멘트 단백질을 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.