Name: 흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 배우세요 혈소판 탈식 및 분비를 흐름 조건에서 실시간 이미징으로 추적하는 방법을. 형광 현미경 기반 플랫폼은 혈전증 및 지혈 메커니즘 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CM은 C1- 저해제 결핍증 (HAEi), Vladen van Het UMC Utrecht 및 수혈 연구를위한 Landsteiner 재단 (LSBR)에 대한 국제 환자기구의 재정 지원을 인정합니다.

University Medical Center Utrecht의 지역 의료 윤리위원회 (Medical Medical Committee)는이 연구를 포함한 생체 외 연구 목적으로 혈액을 채취하는 것을 승인했습니다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 10mM HEPES, 0.5mM Na 2 HPO 4 , 145mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO 4 및 5.55mM D- 글루타민을 용해시켜 4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) Tyrode &#39;s 완충액을 준비한다. 증류수 내 포도당. <ol><li> 완충액의 두 가지 변종을 만드십시오 : pH를 각각 6.5와 7.4로 설정하십시오. 실험 매일에 신선한 완충액을 만드십시오. 표시된 경우 10 ng / mL 프로 스타 사이클린으로 보충하십시오. </li></ol></li><li> 증류수에 50 MM 트리스와 150 MM NaCl을 용해하여 pH를 9.0으로 조정하여 TRIS - 버퍼 식염수 (TBS)를 준비합니다. </li><li> 85 mM Tri-sodium citrate, 71 mM citric acid 및 111 mM D-glucose를 용해시켜 산성 구연산 포도당 (acid citrate dextrose, ACD)을 준비한다.경수. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 pH 7.4에 2 % (v / v) 파라 포름 알데히드 (PFA)를 첨가하여 고정액을 준비하십시오. 용해시키기 위해 가열 (50 - 70 ° C)하고 pH를 7.4로 설정하십시오. 분주하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 사용 전에 37 ° C에서 해동하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 1 % (m / v) 인간 혈청 알부민 (HSA)을 용해하여 차단 완충액을 준비합니다 </li><li> 글리세롤 12g에 폴리 비닐 알콜 4.8g을 가하여 폴리 비닐 알콜 용액을 만들고 잘 섞는다. 12 mL의 증류수를 넣고 상온에서 로테이터에 밤새 방치한다. <ol><li> 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5) 24 mL를 넣는다. 30 분 동안 혼합하면서 50 ℃로 가열한다. 1,25- 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 1.25g을 가하고 잘 섞는다. 5 분 1,500 XG에서 원심 분리기. 나누어 진 상등액 (1 mL는 15-20 슬라이드에 충분 함) -20 ° C에 보관하십시오. 분량을 한 번 사용하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 커버 유리 준비 <ol><li> Degrease 표지희석 된 염색 황산에서 밤새 배양하여 유리 (25 x 50 mm 2 )에 옮겼다. 커버 유리를 증류수로 헹구고 오븐에서 60 ° C로 밤새 건조시킵니다. </li><li> 실험실 벤치 위에 파라핀 필름 스트립 (10 x 15cm 2 )을 물방울과 함께 붙이고 파라핀 필름을 부드럽게하여 공기를 제거합니다. paraffin 필름에 10 μg / mL VWF 또는 100 μg / mL fibrinogen의 피펫을 80 μL 떨어 뜨립니다. 방울 위에 안경을 놓으십시오. 단백질 용액은 두 표면 사이에 퍼져 유리의 전체 뒷면을 덮을 것입니다. 실온 (RT)에서 1.5 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 파라핀 필름을 제거하고 차단 된 버퍼가있는 4-well 플레이트에 코팅면이 위로 오도록하여 커버 유리를 올려 놓습니다. 37 ° C에서 1 시간 또는 4 ° C에서 밤새 품어 둡니다. 대조군으로 VWF 또는 피브리노겐으로 코팅되지 않은 커버 글래스를 차단하십시오. </li></ol> 3. 혈소판 풍부 혈장 (PRP) </p&gt; <ol><li> 베 뉼다에 의해 구연산 전혈 (최종 농도 : 0.32 % 시트르산 나트륨 (M / V))을 수집합니다. </li><li> 브레이크없이 160 XG와 RT에서 15 분 동안 혈액을 원심 분리하십시오. 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 상청액 ( 즉, PRP)을 수집합니다. 참고 : 원심 분리 후, 위에서 아래로 3 개의 층이 관찰 될 수 있습니다 : PRP, 백혈구 및 적혈구. 흰색과 빨간색 셀을 포함하지 않도록주의하십시오. 일반적으로 9 mL 혈액 튜브를 원심 분리 한 후 PRP 3 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> 세척 된 혈소판으로 실험을 수행하려면 4 절을 계속하십시오. PRP가 필요한 경우 다음 단계를 계속하십시오. </li><li> PRP 수집 후, 브레이크없이 2,000 xg에서 10 분간 다시 혈액의 나머지 (적혈구 펠렛 포함)를 원심 분리하십시오. 혈소판이 부족한 혈장 (PPP)이 들어있는 상등액을 수집합니다. 참고 : 일반적으로이 두 번째 원심 분리 단계 후에 2 mL를 수집 할 수 있습니다. </li><li> p의 수를 센다.세포 분석기의 PRP에 래트 렛을 넣고 150,000 혈소판 / μL의 농도로 PPP (단계 3.4)로 희석한다. 참고 : 희석 된 PRP의 총량은 기증자의 혈소판 수에 따라 다릅니다. 혈소판 수는 기증자에 따라 크게 다르며 PRP 희석은 개별적으로 평가해야합니다. 혈소판 수치는 150,000 ~ 450,000 혈소판 / μL 범위 내에서 정상으로 간주됩니다. </li><li> 섹션 5로 계속 진행하십시오. </li></ol> 4. 세척 된 혈소판의 제조 <ol><li> 세포 분석기를 사용하여 PRP에서 평균 혈소판 부피 (MPV)를 결정합니다. 참고 : 이것은 혈소판 사전 활성화 11 의 표시입니다. 혈소판을 쉬기위한 정상 MPV는 7.5-11.5 fL입니다 11 . MPV는 혈소판 세척 과정에서 1.5 fL 이상 증가하면 안됩니다. </li><li> 혈소판 사전 활성화를 방지하기 위해 PRD에 1/10 부피의 ACD를 넣고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 원심 분리하십시오. su를 제거하십시오.HEPES Tyrode의 완충액 (pH 6.5)에서 조심스럽게 pellet을 PRP의 원래 부피로 다시 부순다. </li><li> TBS를 10 μg / mL의 농도로 첨가하여 프로스타 시클린의 분량을 녹입니다. 얼음에 보관하십시오. </li><li> 혈소판 활성화를 막기 위해 프로 그레시클린을 재조합 혈소판에 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. 뜨는를 제거하고 HEPES Tyrode의 버퍼, 산도 7.4에서 신중하게 펠렛을 다시 중단. </li><li> 혈소판 수를 세고 (단계 3.5) MPV (단계 4.1)의 변화를 결정하십시오 (MPV가 1.5 fL 이상 변하지 않아야 함). </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)으로 혈소판 수를 150,000 혈소판 / μL의 농도로 조정하십시오. 실험 전에 RT에서 30 분 동안 회복하기 위해 혈소판을 남겨주세요. 격리 후 4 시간 이내에 실험을 위해 세척 된 혈소판을 사용하십시오. </li></ol> 5. 플로우 챔버 어셈블리 12를 사용 합니다. 추가 분석을 위해 우선적으로 제거 할 수있는 커버 유리를 수용 할 수있는 한 상업적으로 생산 된 다양한 유동 챔버를 사용할 수 있습니다. 설명 된 실험에 사용 된 유동 챔버는 현미경 삽입 스테이지에 정확하게 맞도록 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)로 만들어졌습니다. 여기에는 흡입구와 배출구 ( 그림 1A - C , 1, 2)와 진공 연결부 ( 그림 1A 및 C , 3)가 있습니다. 맞춤형 실리콘 시트 ( 그림 1A 및 D ; 4)가 위에 배치됩니다. 두 개의 컷 아웃은 커버 유리 ( 그림 1A , 6)를 챔버에 단단히 부착하기 위해 진공 채널을 형성합니다 ( 그림 1A 및 D ; 5). 중앙 절개 부는 유동 채널을 형성한다 ( 도 1A </strong&gt; 및 D ; 7; 폭 2.0 mm, 높이 0.125 mm). 입구와 출구는 유로에 연결되고 진공은 진공 채널에 연결됩니다. <ol><li> 플로우 챔버의 상단을 증류수로 덮고 부드러운면이 아래로 향한 맞춤 실리콘 시트를 물 위에 놓습니다. 시트를 제 위치에 유지하면서 여분의 물을 제거하여 시트를 제자리에 놓습니다. 참고 :이 실리콘 시트는 재사용이 가능합니다 (실리콘은 비활성 속성으로 알려져 있음). 일반적으로 혈소판은 부착되지 않았다. 시트는 세제로 닦고 재료가 손상 될 때까지 재사용 할 수 있습니다 ( 즉, 채널 사이의 영역에서 특히 찢어짐). 일반적으로 시트는 하루에 여러 번 실험하여 20 일 동안 사용할 수 있습니다. </li><li> 60 ° C에서 1 시간 동안 유동 챔버를 배양하여 잔류 물을 증발시켜 실리콘 시트를 유동 챔버에 단단히 부착시킵니다. </li><li> 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 한 방울을HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 유로에 넣습니다. 코팅 된면이 아래로 향하게하여 커버 유리 (섹션 2 참조)를 유로에 놓습니다. 진공 펌프를 진공 연결부에 연결하십시오 ( 그림 1A 및 C , 3). 10 kPa의 압력을가하십시오. </li></ol> 6. 혈소판의 사전 염색 및 항체 준비 <ol><li> 혈소판 염색 <ol><li> 37 ℃에서 30 분 동안 10 μg / mL DAPI로 세척 된 혈소판을 인큐 베이트한다. 암소에서. 결합되지 않은 DAPI를 씻어 내고 혈소판 활성화를 막기 위해 프로스타글린을 10 ng / mL의 최종 농도로 첨가하고 브레이크없이 400 xg 및 RT에서 15 분간 즉시 원심 분리하십시오. </li><li> HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)에서 혈소판 펠렛을 재생하여 150,000 혈소판 / μL의 혈소판 농도를 얻습니다. </li></ol></li><li> 항체의 제조 <ol><li> Biotin으로 표지 된 항체와 Alexa로 표지 된 strep을 혼합합니다.1 : 1의 몰비의 타비 딘. 사용하기 전에 실온에서 최소 10 분 동안 품어 둔다 (단계 7.6). 참고 : 바이오틴 표지 효율은 배치마다 다를 수 있습니다. 표적 분자의 시각화에 문제가있는 경우, 성공적인 바이오틴 일화를 확인하기위한 대조 실험과 특정 비오틴 화 항체의 표적 결합 성질을 수행해야합니다. </li></ol></li></ol> 7. 관류 <ol><li> 형광 현미경뿐만 아니라 현미경 소프트웨어를 시작합니다. 표 1에 나열된 현미경 설정을 사용하십시오. 참고 : 현미경 소프트웨어에 적절한 실험을로드하여 혈소판 및 선택된 형광 표지 항체 및 / 또는 염료의 생세 (live-cell) 시각화 및 기록을위한 현미경 및 기록 설정을 시작하십시오. RT에서 플로우 실험을 수행하십시오. </li><li> 튜브에 10mL 주사기를 연결하고 1 % HSA 블로 우를 흡입하여 흡입 튜브를 차단하십시오cking buffer를 주입 튜브에 넣으십시오. RT에서 15 분 동안 품어 둡니다. HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)을 흡 입 튜빙으로 흡입하여 흡입 튜빙을 헹굽니다. </li><li> 차단 된 입구 튜브와 처리되지 않은 출구 튜브를 직경 1.02mm 및 길이 약 20-30cm로 챔버의 입구와 출구에 연결하십시오. 콘센트 튜빙에 10 mL 주사기 (또는보다 낮은 볼륨)를 연결하십시오. 주사기 펌프의 전원을 켭니다. 참고 : 펌프에 설정된 유속과 함께 주사기의 직경이 체적 유량을 결정합니다. 유동 채널의 표면적과 함께, 전단 속도는 식 13 에 따라 계산 될 수있다 이하. 따라서 주사기 펌프의 유량을 변경하거나 유로의 치수를 변경하여 전단 속도를 조작 할 수 있습니다. 800-1600s -1 의 전단 율은 전형적으로 동맥 혈류를 모델로하며, 25-100 s-1 모델은 정맥혈흐름. 이 설정에서 7.5 μL / min의 유속은 25 s -1 의 전단 속도를 발생시킵니다. 전단 속도 = 6Q / h 2 w in s -1 Q = 체적 유량 (mL / s), h = 높이 채널 (cm) (0.0125cm, 실리콘 시트의 두께), w = 너비 채널 (cm) (이 챔버에서 0.2cm). </li><li> 100X 대물 렌즈 (1,000X의 총 증폭)에 침지 오일 한 방울을 놓고 유리 표면을 아래로하여 현미경에 챔버를 놓습니다. </li><li> 유입 튜브를 HEPES Tyrode의 완충액 (pH 7.4)이 들어있는 튜브에 넣으십시오. 출구 튜빙에 연결된 주사기의 플런저를 수동으로 당기고 챔버를 통해 용액을 당겨 시스템에서 공기를 제거합니다. 주사기 펌프 ( 그림 1B 및 C , 8)에 주사기를 놓고 펌프를 잠깐 실행하여 플런저를 조이고 안정된 흐름을 확보합니다. </li><li> 혈소판 현탁액 또는 PRP에 항체 및 / 또는 염료를 조심스럽게 추가하십시오.플라스틱 피펫으로 섞어서 1.5 mL 튜브에 옮긴다. 참고 : 전단 속도 25 s-1 (7.5 μL / min)에서 일반적인 30 분 재관류 의 경우 최소 225 μL의 혈소판 현탁액이 필요합니다. 대표 결과에 사용 된 항체를 표 2 에 나타내었다 . </li><li> HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에서 주입 튜브를 PRP 또는 세척 된 혈소판과 항체 및 / 또는 염료가 들어있는 1.5 mL 튜브 ( 그림 1B 및 C ; 9)로 옮깁니다 . 참고 : 튜빙을 옮길 때 공기가 튜브 안으로 들어가는 것을 방지하기 위해 튜빙이 압착되어 있어야합니다 (공기를 밀어내는 것). 비슷한 방식으로 유입 튜브를 다른 튜브로 이동시켜 후속 단계에서 다양한 시약으로 부착 성 혈소판을 치료할 수 있습니다. 잠재적으로 유용한 시약의 목록이 표 3 에 나와 있습니다. </li><li> &#39;실시간 시각화&#39;를 선택하십시오.n &quot;옵션을 사용하여 코팅 된 커버 글래스의 표면에 현미경을 맞추고 혈소판이 유량 용기에 도달 할 때까지 1,600 s-1 (484 μL / min)의 전단 속도로 펌프를 시동하십시오. 시린지 펌프의 세팅을 7.5 μL / min의 유속으로 변경하여 전단 속도를 25 s-1 로 낮추십시오. </li><li> 커버 유리의 코팅면의 표면을 관찰하고 첫 번째 혈소판이 부착하기 시작할 때까지 기다렸다가이 혈소판에 현미경을 맞추고 소프트웨어에서 실험을 시작하여 녹음을 시작하십시오. 여기에 사용 된 녹음 설정은 표 1 을 참조하십시오. </li><li> 라이브 녹음을 시각적으로 따라하십시오. 30 분 후 주사기 펌프를 멈추십시오. 참고 : 실험 도중 혈소판에 초점이 맞춰 졌는지 확인하십시오. 전형적으로, 20-30 개의 혈소판이 1,000X의 배율로 시야에 붙습니다. 이것은 전체 흐름 채널에서 약 2,000-3,000 개의 혈소판입니다. </li><li> 사용하여 고정플로우 챔버 (옵션). <ol><li> 주사기 펌프를 멈춘 후 흐름이 멈 추면 주입 튜브 (공기가없는)를 고정 용액으로 옮기십시오. 펌프를 다시 시작하고 단계 7.8에서 언급 한 것과 같은 유속으로 채널을 통해 고정 버퍼를 최소 10 분 동안 흐르게하십시오. </li></ol></li><li> 현미경에서 챔버를 제거하고, 유리에서 침지 오일을 청소하고, 진공을 차단하고, 18G 바늘로 조심스럽게 커버 유리를 챔버에서 제거하십시오. 참고 : 커버 유리가 파손되어 실리콘 시트가 손상되지 않도록하십시오. </li><li> 증류수로 미리 적셔 놓은 조직의 상단에있는 4- 웰 플레이트에 커버 슬라이드 (셀이 위를 향하도록)를 놓습니다. 참고 : 이렇게하면 커버 유리가 표면에 달라 붙지 않고 건조되지 않습니다. </li><li> 커버 유리 위에 고정액 750 μL를 피펫과 실온에서 1 시간 품어. 샘플을 직접 분석 할 수없는 경우,안정적인 고정을 보장하기 위해 4 ℃에서 0.5 % PFA (HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4로 희석)에 보관하십시오. 이미징을 위해 커버 유리를 처리하려면 8 절을 계속 진행하십시오. </li><li> 사용 후에는 챔버, 튜빙 및 시트를 증류수로 헹구고 세제 용액에서 밤새 배양하십시오. 챔버 및 다른 구성 요소를 재사용하기 전에 증류수로 헹구십시오. </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 현미경 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요할 때 동영상을 .MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축으로 내 보냅니다. 별도의 프레임을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol> 8. 공 촛점 형광 현미경 검사를위한 샘플 준비 <ol><li> 덮개 유리를 새로운 4-well plates에 옮기고 3 mL의 HEPES Tyrode &#39;s buffer, pH 7.4로 5 회 헹굽니다. 차단 버퍼 3 ML / 잘 추가하고 RT에서 1 시간 품어. </li><li> 블로킹 버퍼를 제거하십시오. HEPES Tyrode의 완충액, pH 7.4에 0.15 % 글리신 (M / V) 3 mL / well을 첨가한다. R에서 15 분간 품어 둔다.티. </li><li> 글리신 용액을 제거하고 3 mL / well의 블로킹 완충액으로 5 번 씻는다. 필요에 따라 추가 염색을 위해 블로킹 완충액으로 희석 한 형광 단 결합 항체를 첨가하십시오. 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 품어 낸다. </li><li> 차단 완충액으로 5 회, 증류수로 2 회 세척한다. 세포를 만지지 말고 조직 안의 가장자리에서 과량의 액체를 제거하여 유리를 말립니다. </li><li> 현미경 슬라이드에 폴리 비닐 알코올 용액 60 μL를 피펫에 넣습니다. 세포와 함께 커버 유리를 방울 위에 놓고 폴리 비닐 알코올이 두 표면 사이에 퍼지게하십시오. 어두운 밤 RT에서 밤새 품어 낸다. </li><li> 공 촛점 현미경으로 세포를 분석 14 . </li><li> 모든 메타 데이터가 포함 된 기록 된 스택 데이터의 원시 데이터 파일을 저장합니다. 필요한 경우 원시 데이터 파일을 MOV, h.264 압축 또는 .AVI 비 압축 파일로 처리합니다. 별도의 스택을 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. </li></ol>

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+granule+exocytosis%3A+a+comparison+with+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).</li>
<li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li>
<li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li>
<li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules%3A+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li>
<li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+%CE%B1-granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells%2C+their+extracellular+matrix%2C+and+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li>
<li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation%3A+methodological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li>
<li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li>
<li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules%2C+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome%2C+and+appears+identical+to+granulophysin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li>
<li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li>
<li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control%3A+Alternatives+for+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

전 세계적으로 혈전증은 사망 및 이환율의 주요 원인이며 혈소판은 그 발달에 중심적인 역할을합니다. 이 작품은 흐름 아래 혈소판 degranulation의 라이브 셀 이미징을위한 방법을 설명합니다. 일반적으로 혈소판이 활성화되면 모든 세분화 된 내용물이 직접 용액으로 방출된다고 가정합니다. 수반되는 결과는 이것이 꼭 그런 것은 아니라는 것을 암시한다. 접착 및 탈과립시 혈소판은 상당량의 폴리 인산염을 보유합니다 ( 그림 4 ). 또한, multimeric 단백질 VWF는 degranulation 후 혈소판 표면과 관련이있다 ( 그림 5 ). 이것은 혈소판 과립 탈과립을 조절하는 분자 기작이 일반적으로 추정되는 것보다 미묘 함을 나타냅니다. 유동 하에서 혈소판 탈과립의 생세포 이미징을 가능하게하기 위해, 실험 조건은 혈소판 응집을 최소로 유지하도록 선택되었다. 혈소판 검사150,000 혈소판 / μL의 ts가 사용되었다...

혈소판은 혈류를 순환하는 무핵 세포입니다. 그들의 주요 기능은 손상 부위에서 혈관 침범을 봉쇄하고 출혈을 막는 것입니다. 이러한 부상 부위에서, 내피 내 콜라겐 섬유가 노출되고이어서 다량 단백질, 폰 빌레 브란트 인자 (VWF)로 덮힌 다. VWF는 세포 표면의 당 단백질 Ibα-IX-V 복합체에 의존하는 메커니즘으로 혈소판과 순환 적으로 상호 작용하여 혈소판의 속도를 늦춘다. 이것은 고 전단 속도에서 특히 중요합니다. 이어서 혈소판은 콜라겐으로부터 활성화 자극을받는 동안 형태 학적 변화를 겪습니다. 이것은 돌이킬 수없는 퍼짐 및 결국 혈소판 응집을 유도한다. 두 공정 모두 혈소판 - 혈소판 혼입을 촉진하기 위해 과립 내용물의 분비에 달려있다. 그 중에서도 혈소판 알파 과립에는 혈소판의 부착과 다리를 돕기 위해 섬유소원과 VWF가 포함되어 있습니다혈소판을 인테그린에 의존적으로 결합시킨다. 혈소판 고밀도 과립에는 혈소판 활성화를 강화시키는 데 도움이되는 칼슘 및 아데노신 디 포스페이트 (ADP)를 비롯한 무기 화합물 2가 포함되어 있습니다. 또한 혈소판에는 (알레르기) 염증 3 매개체, 보체 - 조절 단백질 4 및 혈관 신생 인자 5,6 이 포함되어있어 이러한 내용물이 다양한 조건에서 어떻게 다르게 방출되는지 여부와 문제에 대한 의문을 제기합니다. 1980 년대 이래로, 혈류 모델에서 혈소판 기능에 대한 연구는 혈전 메커니즘의 연구에 유용했다. 그 이후로 많은 기술적 진보가 이루어졌으며, 피브린 형성을 포함하는 유동 모델은 현재 생체 내 에서 치료 용 혈소판 농축 물의 지혈 가능성을 평가하기 위해 개발되었다.혈전 형태학에 전단 율의 교란이 미치는 영향을 조사 9 . 병리학 적 혈전 형성 (혈전증)에 비해 안정적인 접착 및 생리적 인 혈전 형성 (지혈)을 유도하는 분자 및 세포 - 생물학적 기전의 차이는 매우 미묘 할 수 있으며, 이러한 세포 내 (subcellular)의 실시간 시각화를 허용하는 흐름 모델의 개발을 동기 부여 할 수있다 프로세스. 그러한 셋업이 가치있는 과정의 예는 세포 내 폴리 인산염의 (재) 분포와 응고 인자의 동원에 의해 섬유소 미세 구조에 미치는 영향을 밝혀줍니다. 연구는 종종 종단점 분석으로 제한됩니다. 기술 된 방법의 주 목적은 혈류가 활성화 된 상태에서 혈소판 활성화 과정에서 발생하는 동적 세포 과정을 실시간으로 시각적으로 조사 할 수있게하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO<>4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>프로스타사이클린&nbsp;</td><td>케이맨 화학</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>트라이 나트륨 시트레이트</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>구연산&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, 1 번 = 0.13 - 0.16 mm 두께.</td></tr><tr><td>염색황산(2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Von Willebrand factor (VWF)</td><td>in-house purified</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Enzyme Research Laboratories</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4웰 디쉬, 비처리</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Human Serum Albumin Fraction V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>혈액 수집 튜브, 9 mL, 9NC 응고 나트륨 시트레이트 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>세포 분석기&nbsp;</td><td>Abbott Diagnostics</td><td>CELL-DYN 혈액학 분석기</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>하버드 장치, Holliston, MA</td><td>하버드 장치 22</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기와 14.5 mm 직경</td><td>BD 생명과학</td><td>305959</td><td>Luer-Lok 주사기</td></tr><tr><td>Anti-CD63-biotin&nbsp;</td><td>아브캠&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>안티-CD62P-비오틴&nbsp;</td><td>R& D 시스템</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이머젼 오일</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>세제 솔루션</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올</td><td>시그마</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>트리스 하이드로 클로라이드</td><td>시그마</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>양 Anti-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Parafinn 필름</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 인치 x 125 피트 롤.</td></tr><tr><td>실리콘 시트 비강화</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200mm x 150mm x 0.125mm.</td></tr><tr><td>맞춤형 절단 실리콘 시트는</td><td>자체 제작</td><td></td><td>실리콘 시트 비강화 (Nagor, NA 500-1)</td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브</td>로 제작되었습니다. <td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>LED 여기 조명을 갖추고 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경 소프트웨어</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>블루 에디션</td><td></td></tr><tr><td>18 G 바늘 (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 파스퇴르 피펫</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 mL 비멸균, 최대 3 mL까지 눈금이 매겨집니다.</td></tr><tr><td>실리콘 튜브</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>내경. x 외경 x 벽 두께 = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1mm, 접지 가장자리 45°C, 끝단에 젖빛 끝단이 있습니다.</td></tr></tbody></table>

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

혈소판은 혈관 침범을 봉쇄하기위한 혈전 형성의 지혈에 필수적인 요소입니다. 또한 혈전증, 혈관을 막아 장기를 손상시키는 혈전 형성에 생명을 위협하는 결과를 초래합니다. 이것은 혈소판 기능에 대한 과학적 연구와 흐름 조건에서 일어날 때 세포 생물학적 과정을 추적하는 방법 개발의 동기를 부여합니다. 혈소판 접착 및 응집의 연구를 위해 다양한 유동 모델을 사용할 수 있는데, 혈소판 생물학의 두 가지 주요 현상입니다. 이 연구는 활성화 동안 혈류에서 실시간으로 혈소판 탈과립을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 와이드 필드 역전 된 LED 기반 형광 현미경 아래에 놓인 주사기 펌프 셋업에 연결된 유동 챔버를 사용합니다. 여기에 설명 된 설정은 형광으로 표지 된 항체 또는 형광으로 전달되는 다중 형광 물질의 동시 여기를 허용합니다염료. 라이브 셀 이미징 실험 후 커버 유리는 정적 현미경 ( 즉, 공 초점 현미경 또는 주사 전자 현미경)을 사용하여 추가 처리 및 분석 될 수 있습니다.

도 1 은 유동 챔버 및 실험 장치의 이미지를 도시한다. 실리콘 시트의 위치와 치수; 및 배관 연결. 그림 2 는 플로우 챔버의 치수에 대한 세부 사항을 제공합니다. 그림 3 과 영화 1 은 고정 된 VWF에 혈소판 접착 및 퍼짐의 이미지의 시계열을 보여줍니다. CD63은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 고밀도 과립 막에 삽입 된 막 관통 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 녹색으로 표시됩니다. 유사하게, P- 셀렉틴 (Psel)은 쉬고있는 혈소판의 세포 내 알파 - 과립 막에 삽입 된 막 횡단 단백질이다. 혈소판 표면에 시간 의존적으로 동원되어 오렌지색으로 표시됩니다. 도 3b 는 45 ° 각도에서의 대표 이미지, ...

이 연구는 혈소판의 부착, 퍼짐 및 유속 하의 분비를 연구하기위한 형광 현미경 기반의 방법을 설명합니다. 이 다목적 플랫폼은 혈전증과 지혈에 대한 기계 연구를 위해 혈소판 기능을 조사 할 수있게합니다.

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

본 실험의 전반적인 목표는 라이브 셀 이미징을 통해 흐름 조건에서의 혈소판 탈과립 및 분비를 추적하는 것입니다. 이 방법은 혈소판 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 세포의 세포하 수준에서 혈소판 함유물을 다각도로 조사할 수 있다는 점입니다.이 방법은 혈소판 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 비만 세포와 같은 다른 세포 유형에도 적용할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 혈소판 분리 과정 중 발생하는 전활성화 문제로 인해 어려움을 겪습니다. 저희는 혈소판 분비가 최종 단계에서만 평가될 수 있다는 점을 깨달았을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.실시간 이미지는 혈소판 과립 방출의 방출 역학에 대한 정보를 제공합니다. 혈소판 분리 절차는 본 연구소의 학생인 Silvia Pignatelli가 시연하겠습니다. 이어서 Arjan Barendrecht가 실시간 이미징 실험을 시연하겠습니다.먼저, 희석하지 않은 크롬황산(chromosulfuric acid)에 덮개 유리를 하룻밤 동안 배양하여 탈지합니다. 다음 날, 증류수로 헹굽니다. 그런 다음 건조를 위해 오븐에서 60 °C로 하룻밤 동안 둡니다.다음으로, 실험대 위에 물 한 방울을 떨어뜨린 후, 실험대와 필름 사이의 공기를 제거하면서 10cm x 15cm 크기의 파라핀 필름 조각을 물방울 위에 밀착시킵니다. 그런 다음 10 $\mu\text{g/mL}$ von Willebrand factor 또는 100 $\mu\text{g/mL}$ fibrinogen을 80 $\mu\text{L}$씩 파라핀 필름 위에 분주합니다. 물방울 위에 건조한 커버글라스를 덮고 실온에서 1시간 30분 동안 배양합니다.다음으로, 4-웰 플레이트의 각 웰에 블로킹 버퍼 3 mL를 넣습니다. 코팅된 면이 위로 향하게 하여 커버 글라스를 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 이를 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.구연산 처리된 전혈 9 mL를 160 ×g에서 15분 동안 중단 없이 원심분리합니다. 그 다음 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma)이 포함된 상층액을 수집합니다. 혈소판의 사전 활성화를 방지하기 위해 혈소판 부피의 1/9 비율로 산성 구연산 덱스트로스(acid citrate dextrose)를 첨가합니다.그 다음, 혈소판을 400 ×g에서 15분 동안 중단 없이 원심분리합니다. 이어서 상층액을 제거하여 혈소판 펠렛만 남깁니다. 그런 다음 펠렛을 pH 6.5의 HEPES Tyrode 완충액에 조심스럽게 재현탁하여 혈소판 샘플의 원래 부피로 되돌립니다.그 다음, 재현탁된 혈소판에 Prostacyclin을 첨가합니다. 즉시 샘플을 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다. 펠렛을 pH 7.4의 HEPES Tyrode 버퍼로 조심스럽게 재현탁합니다.다음으로, 세척된 혈소판을 세포 분석기에 넣고 혈소판 수를 측정합니다. pH 7.4의 HEPES Tyrode 완충액을 사용하여 시료 내 혈소판 농도를 microliter당 150,000개로 조정합니다. 재현탁 후, 실험 전 실온에서 30분 동안 혈소판을 회복시킵니다.유체 챔버 상단을 증류수로 덮고, 맞춤 제작된 실리콘 시트의 매끄러운 면이 아래로 향하게 하여 물 위에 올립니다. 시트의 위치를 유지하면서 과잉의 물을 제거하여 시트를 원하는 위치에 띄웁니다. 잔류하는 물을 증발시키고 실리콘 시트를 유체 챔버에 단단히 접착시키기 위해 유체 챔버를 60 °C에서 1시간 동안 배양합니다.플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 pH 7.4의 HEPES Tyrode 완충액 한 방울을 유로 채널 위에 떨어뜨립니다. 그런 다음 준비된 커버 글라스의 코팅된 면이 아래로 향하게 하여 유로 채널 위에 놓습니다. 진공 펌프를 약 10 kilopascals의 압력으로 켜고, 진공 펌프를 유동 챔버의 진공 연결부에 연결합니다.세척된 혈소판에 10 µg/mL의 DAPI 염색액을 첨가하고, 혈소판이 들어 있는 튜브를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그다음 37 °C에서 30분 동안 배양합니다. 혈소판 활성화를 방지하기 위해 prostacyclin을 최종 농도 10 ng/mL가 되도록 첨가하고, 결합되지 않은 DAPI를 제거하기 위해 즉시 브레이크를 사용하지 않고 400 ×g에서 15분 동안 원심분리합니다.혈소판 펠릿을 pH 7.4의 HEPES Tyrode 버퍼로 재구성하여, 마이크로리터당 150,000개의 혈소판 농도로 원래 부피까지 맞춥니다. 그런 다음, 형광 현미경의 전원을 켜고 현미경 소프트웨어를 실행합니다. 함께 제공된 텍스트 프로토콜의 표 1에 기술된 대로 이미징 파라미터를 설정하십시오.10 mL 주사기를 연결하고 블로킹 완충액을 유입 튜브로 흡입하여 유입 튜브를 차단하십시오. 실온에서 15분 동안 차단한 후, HEPES Tyrode buffer 7.4를 유입 튜브로 흡입하여 유입 튜브를 세척하십시오. 차단된 유입 튜브와 처리되지 않은 유출 튜브를 챔버의 유입구 및 유출구에 연결하십시오.그런 다음 10 mL 주사기를 배출 튜브에 연결합니다. 100배 대물렌즈 위에 침수유 한 방울을 떨어뜨리고, 유리 표면이 아래를 향하도록 챔버를 현미경에 장착합니다. 다음으로, pH 7.4의 HEPES Tyrode 완충액이 담긴 튜브에 유입 튜브를 넣습니다.출구 튜브에 연결된 시린지의 플런저를 수동으로 당겨 용액을 챔버로 통과시켜 시스템 내의 공기를 제거합니다. 그 다음 시린지를 시린지 펌프에 장착하고 펌프를 잠시 가동하여 플런저를 밀착시키고 안정적인 흐름을 확보합니다. 유체 시스템 준비가 완료되면, 혈소판 현탁액에 항체 및 또는 염료를 첨가하고 조심스럽게 혼합합니다.그 다음 유입 튜브를 짜서 버퍼에서 표지된 혈소판이 들어 있는 튜브로 옮깁니다. 소프트웨어에서 실시간 시각화(live visualization)를 선택합니다. 현미경의 초점을 커버 글라스 표면에 맞추고 펌프를 484 microliters per minute 속도로 시작합니다.혈소판이 유량 챔버에 도달할 때까지 펌프를 작동시킵니다. 다음으로, 유량을 7.5 µL/min으로 낮춥니다. 커버 글라스 표면을 관찰하십시오.첫 번째 혈소판이 부착되기 시작하면, 현미경의 초점을 해당 혈소판에 맞추고 소프트웨어에서 실험을 시작하여 기록을 개시하십시오. 30분 동안 기록한 후 시린지 펌프를 정지하십시오. 모든 메타데이터가 포함된 현미경 raw 데이터 파일을 저장하십시오.필요한 경우, 영상을 MOV H 264 압축 또는 AVI 비압축 형식으로 내보내십시오. 개별 프레임은 JPEG 또는 TIF 파일로 저장하십시오. 이미징이 끝나면 현미경에서 챔버를 제거하고, 유리에서 침수유를 닦아내고, 진공을 해제한 후 18게이지 바늘을 사용하여 챔버에서 커버 글라스를 조심스럽게 제거하십시오.세포가 위를 향하도록 커버 슬라이드를 증류수로 미리 적신 조직 위의 새로운 4웰 플레이트에 배치합니다. 그다음 커버 글라스 위에 고정액 750 microliters를 피펫으로 넣고, 암실 상태의 상온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플을 즉시 분석할 수 없는 경우, 안정적인 고정을 위해 4°C에서 0.5% 파라포름알데히드에 보관하십시오.이 영상은 고정된 von Willebrand factor가 코팅된 유리 슬라이드 상에서 혈소판의 부착 및 확산 과정을 시계열로 보여줍니다. 녹색으로 표시된 것은 CD63으로, 시간에 따라 혈소판 표면으로 이동하는 transmembrane protein입니다. 이와 마찬가지로 주황색으로 표시된 P-selectin 또한 혈소판을 정지시키는 세포 내 alpha-granules의 막에 삽입된 transmembrane protein입니다.유동 실험 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 혈소판 부착의 틸트 시리즈(tilt series)를 제작할 수 있습니다. 여기에서 CD63은 주로 중앙 과립구(granulomere)에 위치하며, P-selectin은 세포 전체에 분포하고 가장자리에 집중된 것으로 나타납니다. 이 실험에서 핵 DNA가 없는 혈소판은 청색으로 나타나는 DAPI와 함께 사전 배양되었습니다.이 사례에서 DAPI는 폴리인산염과 조밀 과립을 염색합니다. 이후 녹색 염색으로 나타나는 것은 혈소판 표면으로 CD63이 시간 의존적으로 이동하는 것입니다. 조밀 과립의 방출 징후가 뚜렷함에도 불구하고, 단일 세포 분석 결과 폴리인산염은 이들 혈소판 내부 또는 외부에 유지되고 있음을 보여줍니다.이 기술을 숙달하면 4개의 개별 유동 실험을 6시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 혈소판의 사전 활성화를 방지하는 것이 중요합니다. 이는 세포 현탁액을 세심하게 조작함으로써 달성할 수 있습니다.이 절차를 마친 후, 공초점 현미경과 같은 다른 방법을 사용하여 표적 분자의 3차원 분포에 대한 추가적인 통찰을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 단일 세포 수준에서 혈류 하의 혈소판 기능을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

혈소판 유착 계단식는 전단 흐름의 존재에서 일어나는, 요인은 종래의 (정적) 잘 철판 assays에서 차지하는 없습니다. 이 문서의 생리 전단 흐름 조건을 에뮬레이트하는 microfluidic 잘 플레이트 형식을 이용한 혈소판 - 집계 분석에 대한 보고서.

Microfluidic 흐름 전지를 사용하여 흐름에서 혈소판 접착 및 집계

여기 혈관 염증 및 라이브 쥐 혈전 형성되는 동안 활성화 내피에 heterotypic 혈소판 호중구 상호 작용을 시각화하는 형광 intravital 현미경의 실험 기술을보고합니다. 이 현미경 기술은 혈관 질환의 분자 메커니즘을 연구 할 수 있고 pathophysiological 조건에 따라 pharmacologic 요원을 테스트 할 가치가 있습니다.

라이브 마우스의 혈관 염증과 혈전 형성하는 동안 활성화 내피에 Heterotypic 혈소판 - 호중구 상호 작용의 실시간 영상

백혈구는 세포층 또는 세포 횡단 경로를 사용하여 내피 세포 단일 층을 교차. 우리는 내생 접합부의 분포가 VE-cadherin의 및 PECAM-1 백혈구 transendothelial 이주 중에 생리 흐름에 따라이 윤회 노선을 구별하기 위해 수행하는 간단한 분석을 개발했다.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

혈소판 수혈 및 지혈은 혈액 은행 혈소판의 기능을 조사하기 위해 혈액 재구성 및 미세유체 유동 챔버를 사용하여 모델링되었습니다. 이 데이터는 혈소판 저장 병변이 지혈에 미치는 영향을 in vitro에서 보여줍니다.

미세 유체 흐름 챔버 지혈 및 혈소판 수혈을 모델링하기 위해 재구성 된 혈액을 사용하여<em&gt; 체외</em

이 논문은 동시에 혈소판 기능과 응고를 측정 지혈의 실험 모델을 설명합니다. 혈소판 및 피브린 형광을 실시간으로 측정하고, 혈소판의 부착 율, 응고 속도 및 응고의 개시가 결정된다. 모델은 수혈 농축 플로우하에 혈소판 응고 특성을 결정하는데 사용된다.

혈소판 수혈 및 지혈을위한 미세 유체 유량 용기 모델은 실시간으로 혈소판 증착 및 섬유소 형성을 측정합니다

혈관 벽 손상 후 또는 염증 동안 백혈구 avidly 혈관 세포와 혈소판 상호 작용합니다. 여기, 우리 간단 층 흐름 기반 분석 결과 기초 백혈구와 셀룰러 파트너 간의 상호 작용 분자 메커니즘의 특성을 설명 합니다.

교양된 혈관 세포에 부착 혈소판 백혈구 신규 모집 조사 하 층 플로우 기반 분석

우리는 원뿔 판 점도를 사용 하 여 혈소판 표면 수용 체에 균일 한 전단을 적용 하는 인 솔루션 방법을 설명 합니다. 이 방법은 또한 다른 세포 유형 및 세포 단편에 전단을 적용 하 고 특정 리간드-수용 체 쌍을 표적으로 할 필요가 없는 더 광범위 하 게 사용 될 수 있다.

원뿔형 플레이트 점도를 통한 인간 혈소판 및 세포 표면 수용 체에 대 한 균일 한 전단 분석

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

혈류 하의 혈소판 기능을 평가하고 시뮬레이션된 지혈 소생술을 외상 및 수혈 의학에 응용하는 미세유체 장치를 사용하여 모델링할 수 있습니다.

혈소판 기능 평가에서의 미세유체역학(Microfluidics in Assessing Platelet Function)

혈소판에 대한 다색 유세포 분석은 고전적인 혈소판 하위 집단 내에서 휴지 혈소판, 응집성 혈소판, 단백질 응고제 및 자가사멸성 혈소판과 같은 새로운 혈소판 하위 유형을 식별할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 혈소판 작용제에 의해 유도된 다양한 하위 집단 패턴을 비교할 수 있습니다. 여기에서는 multi-color 유세포 분석 패널을 설정하는 절차를 자세히 설명합니다.

Multi-color 유세포분석법을 통한 혈소판 하위 모집단 분석

배우세요 혈소판 탈식 및 분비를 흐름 조건에서 실시간 이미징으로 추적하는 방법을. 형광 현미경 기반 플랫폼은 혈전증 및 지혈 메커니즘 연구에 활용됩니다.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

더 많은 동영상 탐색