Name: 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 학습하세요 NSC-34 세포에서 실시간 핵세포질 수송 측정법을. 셔틀-GFP와 leptomycin B를 활용해 핵 수입률을 정량 분석하고, ALS 관련 dipeptide repeat 단백질의 수송 장애를 검출하는 민감한 분석 기법을 익히세요.

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우리는 AI 실험실의 모든 구성원에게 도움이되는 의견과 제안을 해주신 것에 대해 감사드립니다. 셔틀 -GFP 벡터를 제공 한 Mark Hipp 교수 (Max Planck 생화학 연구소)에 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF # 124 / 14), Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Career Integration Grant (CIG # 333794), Israel National Psychobiology Institute NIPI # b133-14 / 15).

1. 세포주 준비 <ol><li> 액체 질소 용기에 저장되어있는 마우스 신경 모세포종 척수 세포 (NSC-34 cells) 약 1,000,000 개를 해동합니다. 세포가 완전히 해동 될 때까지 37 ° C의 물 배양기를 사용하십시오. </li><li> 신선한, 따뜻한 매체 (10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L - 글루타민, 1 % 펜 strep 항생제를 포함하는 DMEM 매체)를 추가합니다. </li><li> 5 분 동안 500xg에서 해동 된 세포 (SL16R)를 원심 분리하여 세포 펠렛을 형성한다. 배지를 버리고 세포 재현 탁의 새로운 배지 1 mL를 첨가한다. </li><li> 15 ML 플라스크에 resuspended 세포를 놓고 여분의 5 ML 매체를 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO 2 와 멸균 배양기에서 하룻밤 사이에 세포를 품어. </li><li> 병행하여, 60mm 배양 접시에 8 개의 코팅되지 않은 커버 슬립 (커버 유리 : 12mm, 0.13-0.17mm 두께)을 놓고 70 % 에탄올을 사용하여 멸균하고 건조 될 때까지 30 분간 자외선에 노출시킵니다. 각 접시에 매체를 넣고 처분하여 잔류 에탄올을 씻어냅니다.</li><li> 그들이 약 90 % 합류 (플라스크 당 약 6 백만 세포)에 도달 후 접착 세포가 해리 수 있도록 트립신 버퍼 (2.5g의 트립신과 행크의 균형 소금 솔루션 1L에 EDTA 0.2g)를 추가합니다. 주의 : NSC-34 세포는 민감하며, 배지를 사용하기 전에 트립신 완충 배양 15 초 및 트립신이없는 배양 1 분을 추가로 요구한다. </li><li> 접시 당 약 35,000, 매체 3 ML과 coverslips 이미 포함 된 60mm 문화 요리에 세포를 판다. coverslips에 세포 부착을 허용하기 위해 24 시간 동안 인큐베이터에 그들을 남겨주세요. </li></ol> 2. 세포 형질 감염 참고 : 약 24 시간 후, NSC-34 세포는 40 % 컨 플루 언스 (약 800,000 세포)에 도달하고 형질 감염을위한 준비가 완료됩니다. <ol><li> 살균 microcentrifuge 욕조에 순수 DMEM 매체 (각 60mm 문화 접시에 대한 DMEM 매체 300 μL)를 준비es. </li><li> 각 DMEM 포함 microcentrifuge 튜브에 transfection에 필요한 각 플라스미드 2 μg을 추가합니다. 참고 : 셔틀 -GFP 플라스미드는 모든 세포 형질 감염에서 필수적입니다. </li><li> 필요한 플라스미드가 들어있는 모든 미세 원심 분리 튜브에 트랜스 팩션 시약을 넣으십시오. 여기에 2 μg의 DNA마다 상업용 형질 전환 시약 4 μL를 넣으십시오. </li><li> DMEM, 플라스미드 및 형질 감염 시약이 들어있는 미세 원심 분리 튜브를 와동시키고 실내 온도에서 25 분 동안 배양하십시오. </li><li> 배양 접시에 각 미세 원심 분리 관을 추가하고 부드럽게 균질 한 용액을 형성하도록 접시를 저어주십시오. 48 시간 동안 인큐베이터에서 접시를 다시 놓습니다. 참고 : shuttle-GFP는 모든 세포에서 발현되어야하므로 shuttle-GFP transfection 효율을 부분적으로 검사하고 밤새 형질 감염 후 형광 현미경을 사용하여 사전 테스트 할 수 있습니다. 면역 형광법 분석기를 사용하여 비 형광으로 발현 된 단백질의 전체 검사를 수행 할 수 있습니다.입니다. </li></ol> 3. 현미경 검사 <ol><li> 분리 된 죽은 세포를 제거하기 위해 coverslip 홀더에 transfected NSC-34 세포를 포함 coverslips를 첨부하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 부드럽게 씻으십시오. </li><li> 거꾸로 된 현미경으로 녹색 형광 필터를 사용하여 적합한 세포 패치를 식별. 참고 : 적합한 세포 패치는 많은 수의 세포 (한 분야에서 20-30 개의 세포)와 핵이 세포에서 명확하게 정의되어있는 현미경 시야로 정의됩니다. 세포 패치 내의 세포 핵은 먼저 눈으로 확인되고 이미징 소프트웨어에 의해 수동으로 표시됩니다. </li><li> 현미경으로 coverslips에 버퍼를 물방울에 coverslips에 PBS에 10 NG / ML LMB를 포함 exportin - 1 억제제 Leptomycin B (LMB) 버퍼의 200 μL를 추가합니다. 참고 :이 시점은 간격 0으로 설정됩니다. </li><li> 약 400-500 초 동안 3 초 간격으로 표시된 핵의 형광 강도를 정량화하십시오. </li><li&gt; 각 실험에서 각 transfection 그룹에 대해 3 ~ 5 커버 슬립을 테스트하십시오. </li></ol> 4. 분석 참고 : 다른 세포가 형광성 셔틀 GFP의 다른 수준을 표현하기 때문에 각 세포의 핵 형광 강도를 자체 초기 형광 강도로 정상화하는 것이 중요합니다. <ol><li> 각 핵의 3 초 형광 간격을 핵의 초기 6 개 간격의 평균으로 나누어 표시 핵의 형광 강도를 표준화합니다. </li><li> 각 핵의 정상화 후, 각 세포 패치에 대한 시간의 함수로서 핵 형광의 변화를 나타내는 형광 강도 곡선을 생성하십시오. 이렇게하려면 각 세포 - 패치 (각 패치에서 대략 20-30 개의 세포로 이루어짐)의 모든 세포의 평균을 계산하십시오. 참고 : 핵 형광 강도 곡선은 마이클리스 - 멘텐 포화 곡선과 유사하며, 증가 된 ti 내에서 더 잘 관찰됩니다나 마침표. 이것은 핵 수송으로 인한 시간에 따른 셔틀 -GFP의 세포질 양의 감소 때문이다. 이 감소는 셔틀 -GFP가 핵으로 운반 될 확률을 통계적으로 낮추어 핵 형광에서 포화 상태에 이른다. 곡선의 선형 초기 속도로부터 유도 된 기울기는 핵으로의 Vmax 진입 속도를 산출한다. </li><li> 그래프 소프트웨어를 사용하여 3-5 개의 독립적 인 실험에서 파생 된 각 셀 패치의 V 최대 기울기를 분석하여 각 실험 그룹을 나타내는 하나의 기울기를 생성합니다. 일원 분산 분석 (ANOVA) 통계 분석을 사용하여 정량화를 수행하십시오. </li></ol> 5. 단백질 발현 검증 <ol><li> 얼음에 각 실험 그룹에서 잔여 세포 (위의 실험에 사용되지 않음)를 포함 60mm 문화 요리를 놓으십시오. </li><li> 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 씻어서 희석하고 나머지 배지를 씻으십시오. </li><li> 200-400으로 세포를 치료하십시오.PBS, 0.5 % 트리톤 및 프로테아제 억제제 칵테일 타블렛 (PI)을 함유하는 용해 완충액 1 μL. 셀 스크레이퍼를 사용하여 긁으십시오. </li><li> microcentrifuge 튜브에 용해 버퍼에 세포를 수집하고 얼음 아래 1 분 4,000 rpm으로 homogenizer로 균질. </li><li> 10 분 2,500 XG에서 균질 세포를 원심 분리기. 상등액을 수집하고, Bradford 분석법을 사용하여 단백질 농도를 정량화하고 -20 ℃에서 사용할 때까지 보관하십시오. </li><li> 총 단백질 30 ~ 70 μg (단백질에 따라 다름)을 모으고 SDS-PAGE 젤에 넣고 면역 블 롯 분석을 사용하여 단백질 발현을 시험합니다. </li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜은 nucleocytoplasmic 교통의 미세 변화를 평가하는 매우 민감하고 정량적 인 새로운 분석을 보여줍니다. 이 시스템을 사용하면 단백질 분포에서 극적인 변화를 가져 오는 큰 결함뿐만 아니라 실시간으로 핵 세포질 수송과 그 기능 장애를 관찰하고 측정하는 것이 가능합니다. 이 분석법은 감도 우위를 가질뿐만 아니라 준비가 거의 필요없고 저렴하며 매우 쉽고 낮은 결합 분석법입니다. 이 시스템의 효율을 테스트하기 위해, 이전에 핵 세포질 수송 결함을 일으키는 것으로 밝혀진 ALS 및 FTD 모델 인 C9orf72 단백질, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR) DPR을 5 , 7 , 8 , 10 , <sup class="xre...

NPC (nuclear pore complex)는 세포핵 내외로의 큰 분자의 반입 및 반출을 제어합니다. 제 1 규칙없이 핵에 들어갈 수있는 작은 분자와 달리, 더 큰 분자의 수송은 NPC에 의해 강력하게 제어된다. 단백질과 RNA와 같은 이러한 거대 분자는 임 핀틴 (importin)과 엑스 핀틴 (exportins)을 포함한 수송 요소와 연관되어 핵에서 수입되고 수출된다. 수입을 위해서, 단백질은 일반적으로 핵 위치 확인 신호 (NLS)라고 불리는 작은 펩타이드 모티프를 가져야하며, 이것은 임포트린 2 에 의해 결합됩니다. 이러한 아미노산의 배열은 tag로 작용하고 composition 3 , 4 에서 다양합니다. 단백질은 exportin과의 연관 때문에 핵에서 세포질로 내보낼 수 있습니다.일반적으로 핵 수출 신호 (nuclear export signal, NES) 2 라고 불리는 신호 서열에 결합한다. 수입업자와 수출업자 모두 작은 Ras 관련 핵 단백질 GTPase (Ran) 2 의 규제로 인해화물을 운송 할 수 있습니다. Ran은 그것이 GTP 또는 GDP에 결합되어 있는지 여부에 따라 다른 형태의 상태로 존재하는 것으로 나타났습니다. GTP에 바인딩되면 Ran은 importins 또는 exportins에 바인딩 할 수 있습니다. RanGTP에 바인딩되면 수입업자는화물을 방출하고 수출업자는 RanGTP를 묶어 수출화물과 복합체를 형성해야합니다. Ran의 지배적 인 뉴클레오타이드 결합 상태는 핵 (RanGTP) 또는 세포질 (RanGDP)에서의 그의 위치에 의존한다. 최근 많은 연구에서 핵 세포질 경로의 손상과 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 전 측두엽 성 치매 (FTD) 사이의 연관성이 밝혀졌습니다 5 , 6 </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런 (MN) 13 모두에 영향을 미치고 평균적으로 2 ~ 5 년 내에 마비와 궁극적으로 사망에 이르는 진행성 및 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적 (SALS)으로 분류되며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 우성 방식 (가족 성 ALS; FALS)으로 유전됩니다. 최근, ALS와 FTD의 유전 적 원인으로 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 14 , 15 로 확인되었다. 이러한 돌연변이는 FALS 사례의 30-40 %를 차지하고 있으며, 여러 연구가 쟁점을 가지고있다핵 세포질 수송에 영향을줌으로써 독성을 유발한다는 것. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE의 최종 결과와 발현을 대부분 보여 주었지만 실시간으로 핵 세포질 파괴를 입증하지 못했습니다. 그 결과 심한 핵 세포질 운반체 결핍이 11 , 17 , 18 에서만 평가되었다. 이 프로토콜은 새롭고실시간으로 nucleocytoplasmic transport dysfunction을 평가하고 정량화하는 민감 분석. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 이전에 설명한 바와 같이 exportin 억제제를 사용하여 이루어 지므로 셔틀 -GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 형광 현미경 및 실시간으로 형광 변화를 정량화 할 수있는 소프트웨어를 사용하여 핵에 위치한 셔틀 -GFP의 형광 강도의 점진적 변화를 정량화 할 수 있습니다. 결과적으로, 임의의 주어진 시간에서 핵 셔틀 -GFP의 양을 나타내는 형광 - 시간 축의 미카엘리스 - 멘틴 (Michaelis-Menten) 형 포화 곡선이 만들어 질 수있다. 곡선의 초기 선형 속도를 사용하여 형광 포화 전에 핵에 들어가는 속도를 나타내는 기울기를 생성 할 수 있습니다. 분석을 확인하기 위해 번역이전에 핵 세포질 수송을 방해한다고보고 된 C9orf72 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)은 5 , 7 , 8 , 10 , 12로 사용 되었다. 이 분석법을 사용하여, 대조군에 비해 핵 수입률이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic 수송의 미세한 변화를 검사 할 수 있습니다. 또한, nucleocytoplasmic 전송 결함을 구출하는 다양한 요인의 능력을 확인할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>마우스 모터 뉴런 유사 하이브리드 세포주(NSC-34)</td><td>tebu-bio</td><td>CLU140-A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4.5 g/L L-포도</td>당 <td>생물학 산업</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>FBS 유럽 등급</td><td>생물학 산업</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R 원심분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Forma 시리즈 ii 수복 CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 12mm 직경, 두께 0.13-0.17mm</td><td>Bar Naor LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFect 형질주입 시약</td><td>Thermo Scientific</td><td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100 도립 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaging Workbench 2</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leptomycin B</td><td>Sigma</td><td>L2913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biological Industries</td><td>02-023-1A</td><td></td></tr><tr><td>균질화기 모터/제어/척/90도 클램프</td><td>Glas-Col</td><td>099C K5424CE</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 17R 원심분리기, 냉장</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002455</td><td></td></tr></tbody></table>

모터 뉴런과 유사한 nsc-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Nucleocytoplasmic 수송은 세포핵에서 큰 분자의 수입과 수출을 의미합니다. 최근 여러 연구에서 근 위축성 측삭 경화증 (ALS)과 핵 세포질 경로의 손상이 연관되어 있음이 밝혀졌습니다. ALS는 평균 2 ~ 5 년 내에 마비가되고 궁극적으로 사망에 이르는 운동 신경 세포에 영향을주는 신경 퇴행성 질환입니다. ALS의 대부분의 경우는 산발적이며 명백한 유전 적 연계가 없지만 10 %는 지배적 인 방식으로 유전됩니다. 최근, 염색체 9 ​​오픈 리딩 프레임 72 (C9orf72) 유전자의 헥사 뉴클레오타이드 반복 확장 (HREs)이 ALS 및 전두 측두엽 치매 (FTD)의 유전 적 원인으로 확인되었다. 중요한 것은, 다른 그룹은 최근 이러한 돌연변이가 nucleocytoplasmic 수송에 영향을 제안했습니다. 이 연구들은 핵 세포질 수송에 대한 HRE에 의해 야기되는 최종 결과와 증상을 대부분 보여 주었지만, 핵 수송 장애를 증명하지는 못했다.실시간. 결과적으로 심각한 핵 세포질 운반체 결핍이 결정될 수 있는데, 이는 대부분 높은 과발현 또는 외인성 단백질 삽입 때문이다. 이 프로토콜은 실시간으로 nucleocytoplasmic 수송 장애를 평가하고 정량화하는 새롭고 매우 민감한 분석을 설명합니다. NLS-NES-GFP 단백질 (shuttle-GFP)의 유입 속도는 형광 현미경을 사용하여 실시간으로 정량화 할 수 있습니다. 이것은 exportin 억제제를 사용하여 수행되므로 셔틀 GFP 만 핵에 들어갈 수 있습니다. 분석을 검증하기 위해, 이전에 핵 세포질 수송을 방해하는 것으로 밝혀진 C9orf72 HRE 번역 된 디 펩티드 반복체, 폴리 (GR) 및 폴리 (PR)이 사용되었다. 설명 된 분석법을 사용하여, 대조군과 비교하여 핵 수입율이 50 % 감소했다. 이 시스템을 사용하여 nucleocytoplasmic transport의 미세한 변화를 조사 할 수 있으며 nucleustoplasmic tr (심지어 부분적으로)을 구출하는 여러 요소의 능력진단 결함이 결정될 수 있습니다.

여기에 제시된 절차를 사용하여, 모터 뉴런과 같은 NSC-34 세포를 NLS-NES-GFP (셔틀 -GFP) 단백질로 형질 감염시켰다. 이 단백질은 NLS와 NES 신호 서열 ( 그림 1 )을 가지고 있으며, 핵과 세포질 사이를 왕래 할 수 있습니다. 일반 GFP는 확산에 의해서만 현지화 신호 태그가 없기 때문에 핵에 들어 오거나 나가기 때문에 핵과 세포질 사이에 고르게 분포됩니다 ( 그림 2A ). 대조적으로, 셔틀 -GFP 단백질은 NES 및 NLS 신호 가 그것의 분산에 영향을 미치기 때문에 세포질에서 주로 발견된다 ( 도 2B ). 따라서 단백질 수출을 저해하는 exportin inhibitor leptomycin B (LMB)의 첨가만으로 shuttle-GFP를 핵내에 축적시키고 결과적으로 셔틀 -GFP 수입율 ( 그림 2C<...

이 프로토콜은 NLS-NES-GFP 단백질의 핵 임포트에서 실시간 변화를 정량화함으로써 모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 핵 세포질 수송 속도를 민감하게 측정하는 방법을 설명합니다.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

본 분석의 전반적인 목적은 잠재적인 수송 속도 억제 분자의 존재 유무에 따라 세포의 핵질-세포질 수송 속도의 미세한 변화를 실시간으로 검출하는 것입니다. 이 방법은 핵질-세포질 수송에 부정적인 영향을 미치는 것으로 제안된 ALS와 같은 특정 신경유전성 질환에 대한 핵심 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 몇 가지 장점은 민감도가 매우 높고 정량적이며, 핵질-세포질 수송 속도의 미세한 변화를 실시간으로 분석할 수 있다는 점입니다.시연은 제 실험실의 대학원생인 Tom Shani가 진행하겠습니다. 우선 액체 질소 저장소에서 약 1×10⁶개의 마우스 신경모세포종 척수 세포를 37°C 항온수조에서 해동하는 것으로 시작하십시오. 세포가 완전히 해동되면 원심 분리를 통해 세포를 수집하고, 펠렛을 1mL의 신선한 배지에 재현탁하십시오.그런 다음 세포를 5 mL의 세포 배양액이 들어 있는 15 mL 플라스크로 옮겨 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 세포의 밀집도가 90%에 도달하면, 코팅되지 않은 커버슬립 8개를 각각 개별 60 mm 배양 접시에 넣고 70% ethanol로 멸균합니다. UV 램프 아래에서 30분 동안 커버슬립을 건조시킵니다.유리가 마르면, 잔류 에탄올을 제거하기 위해 커버스립을 신선한 배지로 세척합니다. 커버스립이 준비되면, 세포 배양 인큐베이터에서 트립신-EDTA를 사용하여 신경모세포종 세포를 약 15초 동안 해리시킵니다. 그런 다음 상온에서 세포를 1분 동안 안정시킵니다.원심분리를 통해 세포를 수집합니다. 세포 수를 측정한 후, 3 mL의 배지당 3.5 × 10⁵ cells 농도로 펠렛을 재현탁하고 디시당 3 mL의 세포를 분주합니다. 그 다음, 세포가 커버슬립에 부착될 수 있도록 배양물을 인큐베이터에 넣고 24시간 동안 배양합니다.다음 날, 60mm 배양 접시당 300 µL의 DMEM 배지가 담긴 멸균 마이크로 원심분리 튜브 하나에 각 transfection 플라스미드 2 µg씩을 첨가합니다. 각 튜브에 플라스미드 2 µg당 4 µL의 상용 transfection 시약을 첨가합니다. 그리고 DNA transfection 용액을 볼텍싱합니다.또는 shuttle-GFP의 핵 대 세포질 비율이 거의 1:1에 가까운 세포군에서는, 핵을 쉽게 구별할 수 있도록 형질전환 전에 핵 표지자로 세포를 사전 표지할 수 있습니다. 실온에서 25분 동안 배양한 후, 각 디쉬에 플라

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

이 프로토콜은 신경암 세포에서 단백질을 추출하는 방법을 설명합니다. 세포는 완충액으로 세척되고 효소 및 기계적 파괴를 통해 용해됩니다. 추출된 단백질이 풍부한 상등액은 원심분리 후 회수됩니다.

신경 세포에서 단백질 추출

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

막 인신 매매에 대한 조사는 신경 기능을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 뉴런에서 소포 운동성을 정량화하는 방법을 소개합니다. 이것은 신경계에서 막 인신 매매의 정량화에 적용 할 수있는 편리한 방법입니다.

형광 프로브를 이용한 배양 된 뉴런의 엔도 좀과 리소좀 기능의 정량화

꼬마 선 충 (C. 선 충) axonal 세포내 수송을 공부 하는 좋은 모델입니다. 여기, 내가 vivo에서 녹음 및 C. 선 충에 axonal intraflagellar 수송의 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다.

신경 세포에서 세포내 수송 분석 꼬마 선 충 의 동원 정지

손상된 미토콘드리아 수송 및 형태는 각종 신경 퇴행성 질환에 관여합니다. 제시된 프로토콜은 유전 경직 성 하반신 마비에서 미토콘드리아 수송 및 형태를 평가하기 위해 유도 된 다능성 줄기 세포 유래 전뇌 뉴런을 사용합니다. 이 프로토콜은 축축을 따라 미토콘드리아 인신 매매의 특성화와 신경 퇴행성 질환의 연구를 용이하게하는 형태학의 분석을 허용합니다.

유전 경직 성 하반신 마비에서 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 미토콘드리아 수송 및 형태 분석

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

이 프로토콜은 광유전학 도구를 통해 핵세포질 수송을 추적하여 얻은 살아있는 세포 이미징 데이터의 자동 분석을 효율적으로 설정하고 수행하는 방법을 설명합니다.

LEXY 및 LINuS 광유전학 도구 및 자동화된 이미지 분석을 사용하여 살아있는 세포의 핵세포질 수송 역학을 정량화합니다.

현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

학습하세요 NSC-34 세포에서 실시간 핵세포질 수송 측정법을. 셔틀-GFP와 leptomycin B를 활용해 핵 수입률을 정량 분석하고, ALS 관련 dipeptide repeat 단백질의 수송 장애를 검출하는 민감한 분석 기법을 익히세요.

모터 뉴런과 유사한 NSC-34 세포 내에서 실시간으로 핵 세포질 수송을 측정하는 분석

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