Name: 설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 학습하세요 설치류 말라리아 기생충의 무성 및 성적 혈액 단계와 모기 단계 현상형 분석 방법을. 동결 보존 원충 주식을 해동하고 마우스에 주입하여 혈액 및 모기 단계를 분석하는 표준화된 기술을 익혀보세요.

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아메드 Aly는 개발 보조금의 터키 정부에서 Bezmialem Vakif 대학에 자금 지원 2015BSV036, 공중 보건 및 열대 의학의 툴레인 대학 학교에서 제공하는 자금으로, R21Grant에 대한 NIH-NIAID에서 자금지원 1R21AI11058-01A1.

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<li>Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Characterization+of+Coenzyme+A+Biosynthesis+Reveals+Essential+Distinctive+Functions+during+Malaria+Parasite+Development+in+Blood+and+Mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260(2017).</li>
<li>Vanderberg, J. P., Yoeli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+sporogonic+development+of+Plasmodium+berghei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei.</a> The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).</li>
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저자는 공개 할 것이 없다.

인간 말라리아 기생충의 그것과 그들의 생활 주기의 일반적인 생물학에 있는 유사성에도 불구하고, 마우스 말라리아 모형은 또한 생체 내 모형에서 믿을 수 있는 그들의 사용을 제한하는 인간 적인 Plasmodium 종에 많은 유사점이 있습니다. 예를 들면, 백신으로 살아있는 감쇠한 기생충을 제외하고, 소단위와 DNA 및 그밖 백신을 가진 모든 백신 연구 결과는 마우스 모형에 있는 우수한 결과를 주었습니다, 그러나 풍토성 지역에 사는 인간에서는, 결과는 만족에서 멀리 이었습니다.
또 다른 문제는 한 마우스 변형에서 다른 마우스 균주에서 다른 수명 주기 단계 감염의 차이, 때로는 동일한 마우스 변형에 대 한 다른 한 동물 공급 업체에서. 더욱이, 생체내 말라리아 모델에서 선호되는 것으로 널리 사용되는 주요 2개의 설치류 말라리아 종, P. berghei 및 P. yoelii,어떤 인간 말라리아와는 완전히 다른...

말라리아 기생충은 인간에 있는 말라리아 감염의 수억을 세계전반 일으키는 원인이 되고,이상 600,000의 죽음과 함께 매년 1. 인간적인 감염은 5개의 말라리아 기생충 종, 즉 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P.말라리아, 및 P. knowlesi에기인합니다. 대부분의 임상 말라리아 사망자는 사하라 사막 이남의 아프리카에서 P. falciparum에 의해 발생1. 사하라 사막 이남의 아프리카 외부광범위 한 세계적인 이환을 일으키는 원인이 되는 또 다른 인간적인 말라리아 기생충 종은 P. vivax2입니다. 다른 세 종은 모두 더 지리적으로 제한되고 치명적인 P. knowlesi3를 제외하고 양성 말라리아 감염을 일으킵니다. 감염의 관련되고 실제적인 비 인간 적인 모형의 가용성은 항상 이고 아직도 말라리아 백신 및 약 발달에 장애물입니다. 이전 말라리아 약 표적화 및 신진 대사 연구 결과는 P. gallinaceum 및 P. lophurae같이 조류 말라리아 모형에 광범위하게, 닭과 오리를 감염시키는, 각각4. 그 후, 설치류 말라리아 종은 생체 내 모델로서 다양한 백신 및 약물 표적 연구에서 점차적으로 도입되었다. 수년에 걸쳐, 인간 말라리아 종에 설치류 말라리아 모형의 생활 주기 단계의 생물학 그리고 호스트 기생충 상호 작용의 유사성의 기록이 축적되었습니다.
특히, 설치류 말라리아 모델은 모기의 생물학을 탐구하고 특성화하는 것이 매우중요했으며 적혈구 전 단계 5. 그러나, 4개의 설치류 말라리아 종(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi,및 P. vinckei)이다른생물학적 특징을 가지며, 그 중 가장 주목할 만한 것은 혈액 단계 6에 있다. 설치류 말라리아 종은 혈액 단계의 동시성에 차이가, 어디 P. chabaudi와 P. vinckei 균주의 혈액 단계는 대부분 동기, P. berghei와 P. yoelii의 혈액 단계는 하지 않습니다 하는 동안6 , 7. 또 다른 주목할만한 차이점은 일부 균주에서 발생하는 혈액단계의 자기 정리입니다 (예를 들어, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 및 P. vinckei lentum),다른 사람의 혈액 감염에 대한 경우 동일한 종의 균주는 치료되지 않은 상태로 방치하면 치명적일 수 있습니다(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA 및 P. chabaudi AS). 더욱이, P. yoelii 17X-NL 균주 및 P. 베르게이 ANKA 균주는 P의 이러한 특징이 있지만, 우선적으로 망상 세포 8,9,10,11을침범한다. yoelii 및 P. berghei 균주는 엄격한 성장 요구 사항이 아니다12,13,14. 따라서, 마우스는 P. berghei ANKA 균주와 P. yoelii에 대한 모기 감염에 필요한 기생충 및 gametocytemia를 증가시키기 위해 그 기생충의 혈액 단계로 감염하기 전에 페닐히드라진으로 치료된다. 17X-NL15,16,17,18,19.
모기 단계 발달의 차이는 또한 다른 설치류 말라리아 종 사이에서 존재하며, 가장 주목할만한 것은 최적의 모기 단계발달과 스포로조이트 길이 5,6에필요한 온도와 시간입니다. 20. 설치류 말라리아 종의 사전 적혈구 단계에서, 차이는 감염성 포자형 접종에 가장 취약 설치류 종과 균주를 포함, 영향을 받기 쉬운 설치류 균주에서 접종에 필요한 포자 형화물의 수, 체외 간 단계 발달 에 필요한 포유류 세포 유형, 및 간단계 발달을 완료하는 시간 5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.
이러한 가변성에도 불구하고, 설치류 말라리아 기생충은 역유전적 접근법의 적용을 위해 초기에 유리한 모델이었으며, 성공 확률이높은 31보다 적은 시간과 자원소비가 적기 때문이다. 사실, 설치류 말라리아 모형은 제일 모형이고, 많은 경우에 유일한 모형은, 기능적으로 모기와 간 단계에서 표현된 유전자를 특성화하기 위하여 수년간 유효합니다.
설치류 말라리아 모형에 있는 역유전 접근의 대중성과 구역성에 비추어, 다른 방법론은 형질전환 기생충 생활 주기 단계, 특히 혈액 단계의 표현형을 분석하기 위하여 이용되었습니다. 그러나 이러한 방법론 중 일부는 일치하지 않습니다. 예를 들어, IP 주입 다음 혈액 단계 기생충의 감염을 비교 (이는 아마도 후막 림프절에 배수하고, 거기에서, 혈류를 입력 할 수 있습니다; 따라서, 주입 된 기생충은 혈류량에서 동등하게 끝나지 않는다) , 일련 혈액 단계 전송 또는 G 번호의 다른 번호와 클론의 모기 전송을 비교 (이는 gametocytogenesis에 영향을 미칠 수32,33),또는 순진한 야생 유형에 직접 형질 전환 기생충을 비교 (WT) 전형및 양성 약물 선택 및 남성 gamete exflagellation의 각종 표준화되지 않은 평가를 결코 겪지 않았던 기생충. 따라서, 설치류 말라리아의 생물학적 가변성을 수용하기 위해 혈액과 모기에 있는 모든 유형의 형질전환 또는 WT 설치류 말라리아 기생충의 표현형 분석을 위해 따르기 위하여 따르기 위하여 간단한 프로토콜을 표준화하는 것이 중요합니다 기생충 종.
본 명세서에서, 우리는 형질전환 형 또는 야생형 P. yoelii 및 P. berghei 기생충의 혈액 및 모기 수명 주기 단계의 표현형 분석을 위한 표준화되고 상세한 실험 프로토콜에 보고한다. 이들 프로토콜은 또한 P. 차보디 및 P. 빈케이 기생충에 적용 가능하다.

<table><tbody><tr><td>헤파린</td><td>시그마</td><td>375095-100KU</td><td></td></tr><tr><td>크산투렌산</td><td>시그마</td><td>D120804-5G</td><td></td></tr><tr><td>하이포잔틴</td><td>시그마</td><td>H9377-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alsever의 솔루션</td><td>시그마</td><td>A3551-500ML</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>페닐히드라진</td><td>시그마</td><td>P26252-5G</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>시그마</td><td>GS1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 정밀 글라이드 니들,&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>1mL TB 주사기, 26 g x 3/8</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>1cc 인슐린 주사기, U-100 27 G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란, USB</td><td>Piramal</td><td>2667- 46- 7</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>22400105</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>섬유 유리솜</td><td>코닝</td><td>3950</td><td></td></tr></tbody></table>

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

유전학 및 시스템 생물학 기술에 있는 최근 어드밴스는 분자 수준에 말라리아 기생충의 생물학의 우리의 이해를 승진시켰습니다. 그러나, 백신 및 화학요법 발달을 위한 효과적인 말라리아 기생충 표적은 아직도 제한됩니다. 이것은 주로 인간 Plasmodium 종에 대한 관련및 실용적인 생체 내 감염 모델의 가용성, 특히 P. falciparum 및 P. vivax에대한 가용성 때문입니다. 따라서, 설치류 말라리아 종은 말라리아 백신, 약물 표적화, 면역 반응 및 보존된 Plasmodiumspp. 유전자의 기능적 특성화 연구를 위한 생체내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다. 실제로, 설치류 말라리아 모형은 특히 모기 전송 및 간 단계 생물학을 탐구를 위해 귀중한 것으로 입증되고, 면역학 연구 결과를 위해 필수적이었습니다. 그러나, 형질전환 및 야생형 무성 및 성혈액 기기생충의 표현형을 평가하는 데 사용되는 방법에는 불일치가 있다. 이러한 불일치의 예로는 혈액 단계 기생충을 가진 설치류의 정맥 내 감염 과 남성 gamete exflagellation의 평가의 선택입니다. 본 명세서에서, 우리는 리포터 유전자 또는 야생형 설치류 말라리아 기생충 종을 발현하는 형질전환 기생충에서 무성 및 성혈액 단계의 표현형을 평가하기 위한 표준화된 실험 방법을 상세히 설명한다. 우리는 또한 Anopheles 모기 벡터 안쪽에 말라리아 기생충 모기 단계 (gametes, ookinetes, oocysts 및 sporozoites)의 표현형을 평가하는 방법을 상세히 설명합니다. 이러한 방법은 P. berghei 및 P. yoelii의 치명적이고 비 치명적인 균주에 대해 여기에서 상세하고 단순화되지만 P. chabaudi 및 P. vinckei 설치류 말라리아 종에 대한 일부 조정으로도 적용 될 수 있습니다.

말라리아 기생충에 역유전적 도구와 기술을 적용하는 성공은 말라리아 연구 분야에 혁명을 일으켰으며, 여러 Plasmodium 종의 특정 게놈 세그먼트를 추가, 삭제 또는 수정할 수 있는 능력으로39개에 달하는 말라리아 연구 분야에 혁명을 일으켰습니다. 중요한 것은, 분배 가능한 게놈 loci는 설치류와 인간 말라리아 기생충에 있는 형광 단백질 마커를 이중 상동 재조합에 의하여, 모든 생활 주기 단계 40에서 안정한 발현을 지키기 위하여 성공적으로 이용되었습니다 ,41,42. 이러한 WT와 같은 형질전환 기생충의 예는 우리 실험실에서 생성된 Py230p(-) 기생충이며, 혈액 및 모기 수명 주기 단계1...

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

설치류 말라리아 기생충의 수명 주기 및 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 인간 말라리아 기생충, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위한 필수불가결한 되었습니다. 이 표준 방법은 야생 모형 및 형질 전환기 설치류 말라리아 종의 표현적인 분석을 수행하는 방법에 관하여 말라리아 연구 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 고즈데 데베치와 일크누르 일마즈가 될 것입니다.냉동 기생충 주식을 신속하게 해동하고 즉시 26 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를 사용하여 약 200 마이크로 리터의 재고를 가진 유전자형 내형 당 적어도 두 명의 기증자 마우스를 주입하십시오. 주입 후 24시간 후, 24 또는 26 게이지 바늘을 사용하여 첫 번째 마우스의 꼬리를 찌르고 현미경 슬라이드에서 혈액 방울을 수집합니다. 다른 슬라이드의 짧은 가장자리를 사용하여 첫 번째 슬라이드를 통해 혈액을 빠르게 얼룩지게합니다.혈액이 완전히 건조되면 슬라이드를 100 % 메탄올로 1 분 이상 고정하십시오. Giemsa의 고정 샘플을 10~15분 간 염색한 다음 단일 또는 이중 증류수 세척을 합니다. 슬라이드가 건조되면 그리드당 감염된 적혈구의 총 수를 계산하기 위해 100X 목표 및 광 현미경에 오일 침지하에 샘플을 볼 수 있습니다.감염 후 2~3일 후, 기생충증이 supine 위치에 0.1~1%에 도달한 마취 마우스를 확보하고 포셉을 사용하여 흉골 의 기저 부근에서 피부를 들어 올려 피부 절개 생성을 용이하게 한다. 절개 부위에 피부를 떼어 내어 복강의 다이어프램과 상부를 노출시키고 집게를 사용하여 흉막 구멍을 뚫고 다이어프램을 절단하는 동안 흉곽의 기저부위를 잡습니다. 흉곽을 다시 고정하여 심장을 드러내고 헤파린의 적어도 20 마이크로 리터를 함유하고 심장 조직에 구멍을 부드럽게 26 게이지 바늘을 장착 한 밀리리터 주사기를 사용합니다.플런저를 천천히 철회하여 약 1밀리리터의 혈액을 수집하고 혈액을 미세 원심 분리튜브로 분배합니다. 모든 혈액이 수확되면, 적색 열램프 하에서 받는 쥐를 따뜻하게 하고 적절한 용량의 기생충을 받는 사람당 27 게이지 바늘을 장착한 인슐린 주사기를 적재한다. 그런 다음 첫 번째 수령인을 제지로 넣고 감염된 적혈구를 한 번 전체 투여량을 팽창된 꼬리 정맥에 주입합니다.모기 먹이의 경우, 성인 4-7일 된 여성 Anopheles stephensi

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

유전자가 말라리아에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 이내 Plasmodium 감염을 예방의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 plasmodium 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. gametocyte 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액을 준비하고 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기와 감염 표현형 결정에서 Plasmodium falciparum 감염에 대한 프로토콜

이 인터뷰에서, 조지는 Plasmodium falciparum Dimo​​poulos 및 뎅그열 바이러스 감염을 방지하기 위해 모기에 의해 사용되는 생리적 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 설명이 방법은 주요 내화물 유전자에 대해 제공됩니다, 벡터 병원균에 대한 저항력을 부여하는 그 유전자는, 모기에 식별 방법과이 지식은 말라리아 기생충이나 뎅그열 바이러스를 가지고 수없는 유전자 변형 모기를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.

더 나은 모스키토 구축 : A. gambiae 및 A. aegypti 모기에 말라리아와 뎅그열 발열 저항을 사용 유전자를 확인

쥐 말라리아 기생충의 유전자 십자가는 모기에 두 유전자 별개의 기생충을 먹이에 의해 수행됩니다. 재조합 자손은 모기가 감염된 쥐를 물어 수 있도록 후 마우스 혈액에서 복제됩니다. 이 비디오의 유전자 십자가를 생산하는 방법을...

쥐 말라리아 기생충의 유전자 크로스의 생산을위한 프로토콜

이 비디오는 뇌성 말라리아의 실험용 마우스 모델의 생성을 보여줍니다. Plasmodium berghei에 감염된 암컷 모기에서 분리된 포자암을 구속된 쥐의 꼬리 정맥에 주입하여 혈액-뇌 장벽 파괴 및 뇌 염증을 유발하여 뇌성 말라리아를 유발합니다. 이 감염된 마우스 모델은 뇌성 말라리아와 관련된 생체 내 미세혈관 병리학을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

숙주 모기 유래 포자동물을 이용한 실험적 뇌성 말라리아의 마우스 모델 생성

결핵 및 말라리아는 인간과 열대 빈곤 인구의 사망률과 사망의 주요 원인에서 가장 널리 감염의 두 가지입니다. 우리는 감염의 자연 경로를 통해 두 병원체 공격 후 마우스에서 말라리아 결핵 동시 감염의 결과를 연구하는 실험 모델 시스템을 구축.

자연의 전송에 결핵 말라리아 동시 감염을 연구하는 실험 모델 결핵균와 변형체 berghei</i

말라리아 전염 모기는 분자 기술을 통해서만 감지할 수 있는 역학적으로 중요한 여러 가지 특성을 가지고 있습니다. MALDI-TOF 기반 SNP 유전형 분석 플랫폼을 활용하여 말라리아 매개체의 여러 주요 특성(종, 살충제 내성, 기생충 감염 및 숙주 선택)을 동시에 검출할 수 있는 분석을 개발했습니다.

말라리아 모기 전송하기위한 다중 탐지 분석

우리는 실험용 뇌 말라리아의 마우스 모델을 설명하고 자기 공명 영상을 사용하여 생체 내에서 염증 및 미세 혈관 병리학을 추적할 수 있는 방법을 보여줍니다.

자기 공명 영상을 이용한 실험용 뇌 말라리아 모델에서의 부종 발달 및 미세 혈관 병리학 적 추적

말라리아 기생충의 모기 단계에 대한 상세한 조사는 효과적인 전송 차단 전략을 설계하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 전염성 있는 게임토세포를 효과적으로 배양한 다음 이러한 게임토세포에 먹이를 주어 P. falciparum의모기 단계를 생성하는 방법을 보여줍니다.

플라스모듐 팔시파룸 인공 막 수유를 통한 게임토세포 배양 및 모기 감염

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

말라리아는 감염된 모기에 의한 Plasmodium의 sporozoite 단계 접종을 통해 전염됩니다. 형질전환 플라스모디움 은 말라리아의 생물학을 더 잘 이해할 수 있게 해주었고 말라리아 백신 개발 노력에 직접적으로 기여했습니다. 여기에서는 형질전환 Plasmodium berghei sporozoites를 생성하는 간소화된 방법론을 설명합니다.

유전자 변형 Plasmodium berghei Sporozoites 생성

Plasmodium 성적 발달은 모기의 중장에서 발생합니다. 기생충의 성기를 표적으로 삼는 것은 전염을 차단하는 유망한 전략입니다. 당사는 접합자 형성 후 나노루시페라아제를 발현하는 형질전환 P. berghei인 Ookluc을 개발하여 투과 차단 화합물의 고처리량 스크리닝을 가능하게 했습니다. 이 기사에서는 Ookluc을 사용한 스크리닝 방법에 대해 자세히 설명합니다.

Ookluc: 투과 차단 화합물 식별을 위한 Plasmodium berghei 라인

학습하세요 설치류 말라리아 기생충의 무성 및 성적 혈액 단계와 모기 단계 현상형 분석 방법을. 동결 보존 원충 주식을 해동하고 마우스에 주입하여 혈액 및 모기 단계를 분석하는 표준화된 기술을 익혀보세요.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

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