Name: Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 ChIP 기법을 이용하여 TGF-β1 유도 SMAD2와 STAT3 전사인자 결합을 HepG2 및 Hep3B 세포에서 분석하는 방법을. 이 기법은 생체 내 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

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이 연구는 TX 텍사스 주 MD 앤더슨 암 센터 (Houston, TX) (시작 자금, BB)의 지원을 받았다.

1. 솔루션 준비 <ol><li> 각 실험마다 다음과 같은 해결책을 준비하십시오. <ol><li> 고정 솔루션을 위해서는 37 % 포름 알데히드를 준비하고 RT에 보관하십시오. 1.42 %의 최종 농도로 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)로 희석한다. 주의 : 포름 알데히드는 자극성, 부식성, 돌연변이 성, 기형 발생 성 및 발암 성으로 분류됩니다. 섭취하지 마십시오. 가스 / 흄 / 증기 / 분무를 흡입하지 말 것. 환기가 충분하지 않은 경우 적절한 호흡 장비를 착용하십시오. 피부 및 눈과의 접촉을 피하십시오. 산화제, 환원제, 산성 물질, 알칼리성 물질 및 습기와 같은 비 양립성 물질로부터 멀리하십시오. </li><li> 글리신 정지 - 수정 솔루션을 위해, 1x PBS 솔루션 0.125 M 글리신을 준비하고 RT에 저장하십시오. </li><li> 세포 스크래핑 솔루션, dH 2 O에 1x PBS 솔루션을 준비하고 얼음에 저장하십시오. 사용 직전에 proteinase inhibitor 인 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) t최종 농도 0.5 mM. 주의 : PMSF는 부식성 및 독성으로 분류됩니다. 보호 복을 착용하고 통풍이 잘되는 곳에 사용하십시오. </li><li> 세포 용해 용액 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5 % NP40)을 사용하기 전에 1X Protease Inhibitor Cocktail (PIC; dimethyl oxoxide (DMSO) 중 100X 원액 : 104 mM 4- (AEBSF), 80 μM 아프로 티닌, 4 mM 베타 틴, 1.4 mM E-64, 2 mM 루피 펩틴 및 1.5 mM 펩 스타틴 A) 및 0.5 mM PMSF를 첨가 하였다. </li><li> 핵 용해 완충액 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 1 % SDS)을 사용하기 전에, 1X PIC 및 0.5 mM PMSF를 첨가한다. </li></ol></li></ol> 2. 세포 고정 및 전단 <ol><li> 10cm 조직 배양 접시에 70-80 % 합류로 세포를 성장. 실험 목적에 따라 세포를 자극하십시오. </li><li> 조직 배양 배지를 제거하고 고정 용액 5 mL를 넣고 배양한다.떨고있는 플랫폼에서 실온에서 10 분 동안 세포를 세척 하였다. </li><li> 고정 솔루션을 제거하고 얼음으로 차가운 1X PBS 10 ML로 세포를 두 번 씻으십시오. </li><li> 1x PBS를 제거하고, 글리신 중지 - 수정 솔루션 5 ML을 추가하고 떨고 플랫폼에서 RT에서 5 분 동안 세포를 품어. </li><li> 글리신 중지 - 수정 솔루션을 제거하고 얼음으로 차가운 1X PBS 10 ML로 세포를 두 번 씻으십시오. </li><li> 1X PBS를 제거하고 세포 스크래핑 용액 2mL를 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수거하십시오. 수확 한 세포를 얼음 위에 원뿔형 튜브로 옮긴다. </li><li> 600 xg 및 4 ° C에서 10 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는을 제거하고, 1X 세포 용해 버퍼의 1 ML에 펠렛을 resuspend하고, 30 분 얼음에 품어. 또는 액체 질소로 펠렛을 스냅 동결하고 -80 ° C에 보관하십시오. </li><li> 일단 펠렛이 세포 용해 버퍼에 resuspended되면 얼음 추위 dounce 균 질기에 세포 현탁액을 전송하고 타입 B pestl를 사용하여 10 스트로크에 douncee 세포 파괴. </li><li> microcentrifuge 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 2,400 XG와 4 ° C에서 10 분 샘플을 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 폐기하고, 핵 소화 완충액 350 μL에 펠렛을 resuspend, 37 5 분 ° C.에 대한 샘플을 품어. </li><li> micrococcal nuclease (1 U / μL)를 추가하고 vortexing하여 섞는다. 37에서 샘플을 품어 ° C 5 ~ 20 분; 2 분마다 반전시켜 시료를 섞는다. 참고 : 시간과 효소 농도는 세포주마다 다르며 최적 이하 효소 절단의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다. </li><li> 또는 상업적으로 이용 가능한 초음파기를 사용하여 초음파로 크로 마틴을 절단 할 수 있습니다. 참고 : Sonication 조건 최적화가 필요합니다. 아래에 샘플 볼륨 300 μL과 샘플 처리 능력 25 %를 사용하는 최적화 예제 프로토콜이 제공됩니다. <ol><li> 단계 2.10에 따라, 상등액을 버리고 n을 재현 탁한다1.0 mL의 상업용 전단 버퍼에 넣었다. </li><li> 3 분의 1.7 ML microcentrifuge 튜브로 resuspended 핵 펠렛의 나누어지는 300 μL. 얼음 위에 올려 놓으십시오. </li><li> 최적 sonication 조건을 결정하는 3 가지 조건을 사용하여 25 % 전력에서 고정 염색질의 3 aliquots을 전단 : 각각 20 초의 5 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식. 각각 20 초의 10 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식. 각각 20 초의 20 펄스, 각 펄스 사이의 얼음에 30 초의 휴식. </li><li> 아래에 설명 된대로 단계 2.15를 계속하십시오. </li></ol></li><li> micrococcal nuclease와 incubation 후, 반응을 멈추기 위해 ice-cold 0.5 M EDTA 7 μL를 첨가한다. </li><li> 16,200 XG 및 4 ° C에서 10 분 동안 절단 된 DNA로 샘플을 원심 분리하십시오. </li><li> 전단 된 DNA 함유 상층 액을 신선한 미세 원심 분리 관으로 옮긴다. 별도의 microcentrifuge 튜브로 나누어지는 50 μL를 su를 확인하십시오세심한 DNA 절단 (3 절). 면역 침전 (섹션 4)을 위해 나머지 부피를 즉시 사용하거나 -80 ° C에 보관하십시오. </li></ol> 3. 전단 효율의 확인 <ol><li> 단계 2.16에서 잘라낸 염색질의 50 μL 나누어지는 부분에 nuclease없는 dH 2 O 150 μL와 5 M NaCl 10 μL를 추가합니다. </li><li> 가교 결합을 반대하기 위해 샘플을 65 ° C에서 4 시간 동안 품는다. </li><li> RNase A (10 μg / μL) 2 μL를 넣고 37 ° C에서 15 분간 배양합니다. </li><li> proteinase K (0.5 μg / μL) 10 μL를 첨가하고 42 ° C에서 90 분간 배양한다. </li><li> DNA 정제를 위해 페놀 / 클로로포름 추출 12을하십시오 . <ol><li> nuclease-free 물을 200 μL의 최종 부피에 첨가하십시오. 200 μL의 페놀 : 클로로포름 : 이소 아밀 알코올 (25 : 24 : 1)을 시료에 넣고 20 초 동안 와동시킨다. </li><li> 방에 원심 분리기16000 x g에서 5 분 동안 성숙. 조심스럽게 상부 수성 상을 제거하고 신선한 튜브로 옮긴다. 피펫을 할 때 페놀을 옮기지 않도록주의하십시오. </li><li> 0.1 M 3M 초산 나트륨 (NH 4 OAc) (pH 5.2)을 넣고 손가락으로 튜브를 여러 번 가볍게 쳐서 섞는다. 빙냉 된 100 % 에탄올 2.5 부피를 넣고 5 초 동안 볼 텍싱하여 혼합한다. -20 ° C에서 시료 O / N을 배양하거나 -80 ° C에서 1 시간 이상 배양하십시오. </li><li> 4 ° C와 16,000 XG에서 30 분 동안 시료를 원심 분리하여 cDNA를 펠렛으로 만든다. </li><li> 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. RT, 70 % 에탄올 1 ML을 추가하고 튜브를 여러 번 거꾸로. </li><li> 4 ° C 및 16,000 X g에서 2 분 동안 시료를 원심 분리하십시오. 조심스럽게 상등액을 제거하십시오. </li><li> 펠렛을 실온에서 5-10 분 동안 건조시킨다. dH 2 O 30 μL에 펠렛을 Resuspend. </li></ol></li><li> 1 % TAE가있는 겔 전기 영동을 위해 정제 된 DNA의 5 및 10 μL 분취 량을 사용하십시오아가 로스 겔. 참고 : 성공적인 염색질 전단은 200-1,500 bp DNA 패턴을 초래합니다. 전단이 실패한 경우, 전단 단계 (단계 2.12)의 배양 시간을 5 분, 10 분 및 15 분으로 수정하여 특정 세포에 대한 최적의 전단 조건을 결정합니다. </li><li> 나머지 샘플을 사용하여 샘플의 DNA 농도를 분석하십시오. 전단 크로 마틴 샘플에서 DNA 농도를 역 계산 (단계 2.16); immunoprecipitation (섹션 4)에 대한 각 치료 그룹에 대해 동일한 DNA 금액을 사용하십시오. </li></ol> 4. 면역 침전 <ol><li> ChIP 수준의 단백질 G 자성 구슬 25 μL, immunoprecipitation 희석 버퍼 (주식 솔루션 : 0.01 % SDS, 1.1 % 트리톤 X - 100, 16.7 MM의 10 μL)와 가위, crosslinked 염색질 (단계 2.16) 10-25 μg을 결합 Tris-HCl, pH 8.0, 1.2 mM EDTA 및 167 mM NaCl) 및 1 ㎕의 PIC. </li><li> 배양 4 시간 후, 1 ~ 10 μg의 항체 (항체 농도항체의 친 화성에 따라 다를 것이다; 처음에는 제조사의 권장 사항에 따라 사용해야하고 필요한 경우 실험적으로 최적화해야 함) 1.5 mL 미세 원심 분리 튜브에 넣고 dH 2 O를 최종 부피 100 μL에 넣으십시오. 참고 : 직접 immunoprecipitation 방법 대신에 간접 immunoprecipiation 방법 대신에 먼저 항체와 염색질을 결합하여 단백질 G 자성 구슬을 추가하여 사용할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 4 ~ 12 시간 동안 종단 간 회 전자에서 시료를 배양한다. </li></ol> 5. 용출 <ol><li> 튜브를 자석 스탠드 위에 놓습니다. 일단 자기 구슬이 튜브의 측면에 응집되면 조심스럽게 제거하고 상등액을 버립니다. </li><li> Wash Buffer 1 (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 및 150 mM NaCl) 800 μL로 비즈를 세 번 씻으시오. 튜브를 여러 번 뒤집어서 혼합하십시오. 자성 스탠드 위에 튜브를 놓고자석 비드가 튜브의 측면에서 응집되면 조심스럽게 세척 완충액을 제거하고 폐기하십시오. </li><li> Wash Buffer 2 (0.1 % SDS, 1 % Triton X-100, 2 mM EDTA, pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 및 500 mM NaCl) 800 μL로 비즈를 한번 씻으십시오. 튜브를 여러 번 뒤집어서 혼합하십시오. 튜브를 자석 스탠드 위에 놓고 자석 비드가 튜브의 측면에서 응집되면 조심스럽게 세척 버퍼를 버리고 버립니다. </li><li> 용리 버퍼 (1 % SDS와 100 MM NaHCO 3 ) 50 μL에 구슬을 Resuspend하고 RT에서 15 분 동안 엔드 투 엔드 회 전자에 샘플을 품어. </li><li> 튜브를 자기 스탠드에 놓고 자석 비드가 튜브 측면에 모이면 상층 액을 새 튜브로 옮깁니다. </li><li> 가교 결합을 역전시키기 위해 5 μM NaCl 6 μL를 추가하고 프로 테이나 제 케이 (0.5 μg / μL) 2 μL를 첨가하십시오. 샘플을 혼합 한 후 65 ° C에서 2 시간 동안 샘플을 배양하십시오. </li><li> DNA 정제를 위해 phenol / 클로로포름 추출 12 (단계 3.5) 후 펠렛을 30 μL의 dH 2 O에 재현 탁한다. 참고 : 시료는 단백질 결합 부위를 직접 분석하거나 (섹션 5) -20 ° C에서 보관할 수 있습니다. </li></ol> 6. 바인딩 사이트 분석 <ol><li> PCR 또는 qRT-PCR을 사용하여 알려진 핵산 서열 내의 특정 결합 부위에 대한 분석을 수행하십시오. 프라이머 디자인을 위해서는 기존의 PCR 또는 qRT-PCR 프로토콜을 따르십시오. 관심의 단백질 바인딩 사이트 ( 그림 1 )를 교량 150-400 BP amplicon을 합성하는 뇌관을 설계하십시오. </li><li> 특이성을 보장하기 위해 4 개의 다른 DNA 템플릿을 사용하여 PCR을 설정합니다 : i) 관심 항체로 면역 침강 된 ChIP의 DNA, ii) 비특이적 IgG 항체로 면역 침전 된 ChIP의 DNA, iii) 입력 DNA 및 iv) 오염을 배제하기 위해 PCR에 대한 음성 대조군. 경로 자극의 경우, immunoprecipitated 단백질의 알려진 바인딩 사이트에 특정 프라이머의 다른 세트를 사용하여 다섯 번째 템플릿을 선택하십시오. 참고 : c-KIT 리간드 프로모터 분석의 경우 c-KIT 리간드 프로모터 영역 내의 SBE에서 TGF-β 유도 SMAD 결합을 입증하기 위해 기존 PCR을 사용하십시오. 양성 대조군으로, TGF-β 유도 SMAD 결합의 알려진 표적으로 플라스 미노 겐 활성제 억제제 -1 (PAI-1)에 PCR을 수행하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

이 보고서에서 우리는 c-KIT 리간드 프로모터 내 SBE에 SMAD2의 TGF-β1 유도 된 결합과 TGF-β1 리간드 유전자 내에서 STAT3의 인식 서열에 TGF-β1에 의해 유도 된 결합을 입증했다. 우리는 염색질 면역 침전을 사용하여 두 전사 인자 모두의 사이토 카인 유도 결합을 증명한다. 크로마토 그래피 면역 침전은 DNA에 대한 관심있는 단백질의 직접 결합을 입증하고, DNA에 대한 단백질 결합을 유도하는 자극을 특성화하고, 단백질이 결합하는 DNA 서열을 특성화하는 강력한 도구입니다. 후자의 정보는 관심있는 특정 단백질에 의해 조절되는 유전자의 확인에 도움이 될 수 있으며 ChIP-on-chip, ChIP-seq 또는 복제 전략 7 , 8 , 9 의 사용에 의해 달성된다. ChIP의 주요 장점과 ...

진핵 생물의 핵에서는 DNA가 히스톤 단백질과 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축된다. 생리 학적, 병태 생리 학적 및 세포 생물학적 상황에서 세포 기능은 염색질 - 조정 된 유전자 발현에 의해 공간적 및 일시적으로 조절된다. DNA- 단백질 상호 작용은 DNA 복제, 재조합 및 수리뿐만 아니라 단백질 발현과 같은 세포 과정의 조절에 필수적인 역할을한다. 따라서, DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 발현 및 세포 기능의 평가에 없어서는 안될 도구입니다. Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA)와 DNase I footprinting 1,2 와 같은 시험 관내에서 DNA- 단백질 상호 작용을 평가하는 몇 가지 기술이 있습니다. 그러나 이러한 기술은 염색질 및 세포 내에서 단백질 -DNA 상호 작용을 분석하지 못합니다. 칩 i이 기술은 특정 DNA 결합 부위에 결합 된 단백질을 포착하여 염색질 컨텍스트 내에서 DNA- 단백질 상호 작용의 확인을 용이하게합니다. 이 기술은 원래 Gimour와 Lis가 Escherichia coli 와 Drosophila melanogaster 3 , 4 에서 특정 유전자에 결합하는 RNA 중합 효소 II의 평가를 위해 개발되었습니다. 이것은 DNA- 단백질 복합체를 고정시킨 후 염색질 추출을 수행하고 ~ 200 염기쌍 (bp) 단편으로 DNA를 절단함으로써 수행됩니다. 이어서, DNA- 결합 된 관심 단백질은 면역 침전에 의해 분리된다. DNA- 단백질 교차 결합의 역전 후, DNA를 정제하고 분석한다. 몇 가지 방법은 단백질 결합 사이트의 분석을 위해 사용할 수 있으며 대상 유전자 내 단백질 바인딩 사이트의 핵산 시퀀스에 따라 달라질 수 있습니다. DNA 서열이 알려져있는 경우, 표준 Pol알려진 결합 부위에 인접한 특정 프라이머 쌍을 사용하여 ymerase Chain Reactions (PCR)을 적용 할 수 있습니다. 정량 실시간 PCR (qRT-PCR)도 사용할 수 있습니다 6 . 서열이 알려지지 않은 경우 ChIP는 DNA 마이크로 어레이 (ChIP-on-chip), DNA 시퀀싱 (ChIP-seq) 또는 클로닝 기술 7 , 8 , 9 와 결합 될 수있다. TGF-β 경로는 강력한 종양 억제 기능을 가지고 있으며 세포 분화의 핵심 경로입니다. TGF-β1 리간드와 동족 수용체 복합체의 결합을 통해 활성화되어 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 - 포스 포 릴화를 일으킨다. 공통 중재자 인 SMAD4와의 결합 이후에, SMAD- 복합체는 핵으로 전위되어 표적 유전자의 프로모터 영역 내의 SBE와 결합하여 세포주기, 세포 사멸 및 세포 특이성을 조절하는 유전자를 조절한다에. TGF-β 자극에 대한 전사 반응은 세포 유형 및 상황에 따라 다릅니다 10 . 최근에 우리는 TGF-β와 c-KIT 경로 사이에 긍정적 인 피드백 고리를 기술했다. 이 모델에서, TGF-β1- 활성화 SMAD2는 c-KIT 리간드 프로모터에 결합하여 그 발현 및 분비를 유도한다. 이어서, c-KIT 리간드는 자동 및 준 - 유사 방식으로 c-KIT 수용체를 활성화시킨다. c-KIT 수용체 활성화는 JAK1 / 2를 통한 STAT3 Tyr705- 인산화를 초래한다. STAT3 활성화 및 핵 전좌 이후, STAT3은 TGF-β1 리간드 유전자에 결합하고 그 발현을 조절한다. 여기에서 우리는 c-KIT 수용체 리간드 프로모터에 대한 SMAD2 결합의 확인과 신호 변환기 (and) Transcription 3 (STAT3의 TGF-β1- 유전자).

<table><tbody><tr><td>HepG2 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B 세포</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>R& D Systems</td><td>101-B1</td><td>10ng/mL 농도에서 사용</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>5339</td><td>사용량/IP: 3 &마이크로; g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4904</td><td>사용량/IP: 3 &마이크로; g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR 전방 프라이머: PAI-1</td><td></td><td></td><td>서열: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'</td></tr><tr><td>PCR 리버스 프라이머: PAI-1</td><td></td><td></td><td>서열: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'</td></tr><tr><td>PCR 순방향 프라이머: SCF</td><td></td><td></td><td>서열: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 리버스 프라이머: SCF</td><td></td><td></td><td>서열: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'</td></tr><tr><td>PCR 앞으로 뇌관: TGF-beta; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>서열: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 리버스 프라이머: TGF-&베타; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td> <td>순서 : 5 '-TAGCTTTCTCTGCCTTGCTCCCC-3 ' &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 앞으로 뇌관: TGF-beta; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>순서: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>PCR 리버스 프라이머: TGF-&베타; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td> <td>서열 : 5 '-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTC-3 ' &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation을 이용한 c-kit 리간드 프로모터 분석

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA 복제 및 수리, DNA 재조합 및 유전자 발현을 포함한 여러 세포 과정은 단백질과 DNA 간의 상호 작용을 필요로합니다. 따라서 DNA- 단백질 상호 작용은 세포 분화, 세포 증식, 세포주기 조절, 염색체 안정성, 후성 유전자 조절 및 세포 변형과 같은 여러 생리적, 병리 생리 학적 및 생물학적 기능을 조절합니다. 진핵 세포에서 DNA는 히스톤 및 비 히스톤 단백질과 상호 작용하고 염색질로 응축됩니다. 전기 이동 (젤) 이동성 이동 분석 (EMSA) 및 DNase I 발자국과 같은 몇 가지 기술 도구를 사용하여 DNA- 단백질 상호 작용을 분석 할 수 있습니다. 그러나 이러한 기술은 세포 내에서가 아니라 in vitro에서 단백질 -DNA 상호 작용 을 분석합니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 특정 DNA 결합 부위에서 단백질을 포착하여 DNA- 단백질 상호 작용을 확인하는 기술입니다s의 염색질 컨텍스트 내에서. 이것은 DNA- 단백질 상호 작용을 고정시킨 후 관심 단백질의 면역 침전에 의해 이루어진다. 이어서, 단백질이 결합 된 게놈 부위가 특성화된다. 여기에서 우리는 ChIP를 기술하고 논의하고 티로신 - 아밀로오스의 프로모터 영역 내에서 전사 인자 SMAD2의 SMAD 결합 요소 (SBE) 로의 형질 전환 성장 인자 -β (TGF-β) - 유도 된 결합의 동정을위한 분석적 가치를 입증한다. 단백질 키나아제 키트 (c-KIT) 수용체 리간드 줄기 세포 인자 (SCF).

동족 수용체 복합체에 대한 TGF-β1 리간드의 결합은 SMAD2 / 3 전사 인자의 세린 - 인산화를 초래하고,이어서 공통 매개체 인 SMAD4와의 결합을 일으킨다. SMAD 복합체는 핵으로 전이합니다. TGF-β는 SMAD가 표적 유전자의 조절 영역 내 SBE에 직접 결합하거나 SMAD가 조절하는 표적 유전자의 발현을 조절하는 전사 조절 자나 억제 자의 표현을 통해 간접적으로 유전자 전사를 조절할 수있다. c-KIT 리간드 SCF가 SMAD2의 직접 프로모터에 대한 TGF-β1 유도 결합에 의해 전사 조절되는지를 시험하기 위해, 우리는 SCF 유전자의 SCF 프로모터를 포함하는 2.4kb, 5 &#39; SMAD2 결합 모티프, 5&#39;-AGAC-3 &#39;(SBE) 13 , 14 . 우리는 7 개의 추정 SBEs 업을 확인했습니다.SCF 시작 코돈 ( <...

DNA- 단백질 상호 작용은 여러 생물학적 과정에 필수적입니다. 세포 기능을 평가하는 동안 DNA- 단백질 상호 작용의 분석은 유전자 조절을 이해하는 데 없어서는 안될 필수 요소입니다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)은 생체 내에서 그러한 상호 작용을 분석하는 강력한 도구 입니다.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

이 염색질 면역침전 절차의 전반적인 목표는 C kit promoter의 SMAD 결합 요소에 대한 전사 인자 SMAD2의 TGF beta 1 유도 결합을 평가하는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 유도 유전자 전사와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사 인자 및 기타 전사 조절 단백질을 in vivo에서 DNA 결합 부위에 직접 결합할 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 것입니다.10cm 조직 배양 플레이트에서 세포를 70-80% 합류로 성장시킵니다. 실험 목적에 따라 세포를 자극합니다. 조직 배양 배지를 제거하고 5ml의 고정 용액을 첨가합니다.그런 다음 진탕 플랫폼에서 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 정착액을 제거하고 10ml의 얼음처럼 차가운 1 X PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 1X PBS를 제거하고 5ml의 글리신 정지 고정 용액을 추가합니다.진탕 플랫폼에서 실온에서 5분 동안 세포를 배양한 후 글리신 정지 고정 용액을 제거하고 10ml의 얼음으로 1X PBS로 세포를 2회 세척합니다. PBS를 제거한 후 2ml의 세포 스크래핑 용액을 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 그런 다음 수확된 세포를 얼음 위의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.샘플을 600배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1ml의 X 세포 용해 완충액 1ml에 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 펠릿이 세포 용해 완충액에 다시 현탁되면 세포 현탁액을 얼음처럼 차가운 Dounce 균질기로 옮기고 세포 파괴를 위해 B형 절굿공이를 사용하여 10회 스트로크합니다.그런 다음 세포 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 2도, 400배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 350마이크로리터의 핵 분해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 샘플을 배양한 후 미세코커스 뉴클레아제를 첨가하고 볼텍싱으로 혼합합니다.섭씨 37도에서 5분에서 20분 동안 샘플을 배양하고 2분마다 반전을 통해 샘플을 혼합합니다. 어느 정도 농도를 유지하는 데 걸리는 시간은, 세포주 사이에 있는 경우, 최적화가 아닌 효소 전단의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다. 시판되는 소닉케어(sonicare)를 사용하는 대안적인 전단 절차는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있다.micrococcal nuclease를 사용한 배양 후 7마이크로리터의 얼음처럼 차가운 0.5몰 EDTA를 첨가하여 반응을 중지합니다. 전단된 DNA로 샘플을 16, 200배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액이 포함된 전단된 DNA를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.50마이크로리터를 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 분주하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA의 성공적인 절단을 확인합니다. 남은 부피는 면역침전을 위해 즉시 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 10-25마이크로그램의 전단 교차 결합 염색질과 25마이크로리터의 염색질 면역침전 등급 단백질 G 마그네틱 비드를 결합합니다.그런 다음 10마이크로리터의 면역침전 희석 완충액과 1마이크로리터의 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. 4시간 배양 후 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 1-10마이크로그램의 항체를 추가합니다. 그리고 증류수를 최종 부피 100마이크로리터에 추가합니다.엔드-투-엔드(end-to-end) 로테이터에서 샘플을 섭씨 4도에서 4-12시간 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 마그네틱 비드가 튜브 측면에 응집되면 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.800마이크로리터의 세척 완충액 1개로 구슬을 세 번 세척합니다. 세척할 때마다 튜브를 여러 번 뒤집어 비드를 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 튜브 측면에 응집되면 세척 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.다음으로, 동일한 절차를 사용하여 800마이크로리터의 세척 버퍼 2로 비드를 한 번 세척합니다. 세척 후 비드를 50마이크로리터의 용리 완충액에 다시 현탁시키고 실온에서 15분 동안 종단 간 회전체에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드를 사용하여 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.교차 연결을 역전시키기 위하여 5 몰 염화나트륨의 6 마이크로리터를 추가하고, proteinase K.의 2 마이크로리터가 표본을 섞은 후에, 65 섭씨 온도에 2 시간 동안 그(것)들을 배양하십시오. 이 시점에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 결합 부위에 대해 샘플을 직접 분석하거나 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. SCF 프로모터에 대한 SMAD2의 TGF 베타 1 유도 결합을 확인하기 위해 염색질 면역침전 분석을 수행했습니다.TGF 베타 1 처리는 인간 간암 라인, HepG2 및 Hep3B에서 SCF 프로모터에 SMAD2가 결합하는 결과를 낳았습니다. TGF beta 1 자극이 없는 경우, SMAD 결합은 관찰되지 않았다. 양성 대조군으로, TGF beta 1-induced SMAD activation에 대해 PAI-1에 대한 염색질 면역침전을 수행하였다.PAI-1 프로모터는 TGF 베타 및 SMAD의 알려진 표적입니다. SMAD2 면역침전의 특이성은 비특이적 IgG 항체의 사용을 통해 확인되었습니다. IgG를 사용한 면역침전 후 SBE에 대한 SMAD2 결합은 관찰되지 않았습니다.TGF 베타 리간드 유전자에 대한 STAT3의 TGF 베타 1 유도 결합을 확인하기 위해 TGF 베타 1 처리된 HepG2 및 Hep3B 세포를 사용하여 염색질 면역침전 분석을 수행했습니다. TGF 베타 1 처리는 STAT3가 TGF 베타 유전자의 두 번째 추정 STAT3 결합 부위에 결합하는 결과를 낳았지만, 첫 번째 부위에는 결합하지 않았습니다. 이 예에서 STB-2에 대한 양수 STAT3 바인딩은 내부 양수 대조군 역할을 합니다.다른 염색질 면역침전 실험과 유사하게, IgG를 사용한 면역침전 후 ST-2에 대한 STAT3 결합은 관찰되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행된다면 항체에 따라 하루나 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험실 안전 지침을 따르고 프로토콜의 모든 단계에서 매우 정확해야 합니다.이 절차를 수행하는 동안 MSDS를 확인하고 장갑, 흰 코트, 보안경과 같은 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 DNA 결합 염기서열에 대한 단백질 결합을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜에 따라 염색질 면역침전으로 입증된 단백질 DNA 결합의 기능적 관련성을 확인하기 위해 프로모터 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

우리는 기본 T 세포를 사용하여 염색질의 immunoprecipitation위한 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 표준 방법에 설립 있지만, 세포의 제한된 수량에 대한 효율성을 개선 조건과 시약의 특정 집합을 사용합니다. 중요한 데이터 분석 단계에 대한 자세한 설명이 표시됩니다.

바이오 매스의 제한 금액을 사용하여 효율적으로 염색질 immunoprecipitation의

염색질의 immunoprecipitation과 매우 높은 처리량 시퀀싱 (칩 SEQ)의 조합은 특정 조직이나 세포주에서 단백질 DNA 상호 작용을 파악하고 매핑 할 수 있습니다. 설명은 예를 들어 전사 인자 TCF7L2 경험을 사용하여 다음 순서를위한 고품질 칩 템플릿을 생성하는 방법이다.

높은 처리량 시퀀싱을위한 고품질 염색질 면역 침전의 DNA 템플릿의 생성 (칩 SEQ)

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

이 작품은 성숙 마우스 T 세포 라인을 사용하여 염색질 immunoprecipitation (ChIP)에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 특정 프로모터 사이트 또는 게놈 전체에서 특정 히스톤 마크의 분포를 조사하는 데 적합합니다.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

강화, 같은 DNA 규제 요소, 물리적으로 대상 유전자 발기인, 큰 게놈 거리에 걸친 장거리 염색체 상호 작용을 통해 자주 연락 하 여 유전자 발현을 제어 합니다. 발기인 캡처 안녕-C (PCHi-C) 그들의 표적 유전자를 잠재적인 규제 시퀀스의 지정을 활성화 발기인 및 원심 지역 사이 중요 한 상호 작용을 식별 합니다.

발기인 캡처 안녕-c: 고해상도, 게놈 넓은 발기인 상호 작용의 프로 파일링

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

배우세요 ChIP 기법을 이용하여 TGF-β1 유도 SMAD2와 STAT3 전사인자 결합을 HepG2 및 Hep3B 세포에서 분석하는 방법을. 이 기법은 생체 내 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 데 필수적입니다.

Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

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