Chromatin Immunoprecipitation을 이용한 c-KIT 리간드 프로모터 분석

이 염색질 면역침전 절차의 전반적인 목표는 C kit promoter의 SMAD 결합 요소에 대한 전사 인자 SMAD2의 TGF beta 1 유도 결합을 평가하는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 유도 유전자 전사와 같은 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 전사 인자 및 기타 전사 조절 단백질을 in vivo에서 DNA 결합 부위에 직접 결합할 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 것입니다.

10cm 조직 배양 플레이트에서 세포를 70-80% 합류로 성장시킵니다. 실험 목적에 따라 세포를 자극합니다. 조직 배양 배지를 제거하고 5ml의 고정 용액을 첨가합니다.

그런 다음 진탕 플랫폼에서 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 정착액을 제거하고 10ml의 얼음처럼 차가운 1 X PBS로 세포를 두 번 씻습니다. 1X PBS를 제거하고 5ml의 글리신 정지 고정 용액을 추가합니다.

진탕 플랫폼에서 실온에서 5분 동안 세포를 배양한 후 글리신 정지 고정 용액을 제거하고 10ml의 얼음으로 1X PBS로 세포를 2회 세척합니다. PBS를 제거한 후 2ml의 세포 스크래핑 용액을 넣고 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 수확합니다. 그런 다음 수확된 세포를 얼음 위의 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

샘플을 600배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 1ml의 X 세포 용해 완충액 1ml에 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 얼음에서 30분 동안 배양합니다. 펠릿이 세포 용해 완충액에 다시 현탁되면 세포 현탁액을 얼음처럼 차가운 Dounce 균질기로 옮기고 세포 파괴를 위해 B형 절굿공이를 사용하여 10회 스트로크합니다.

그런 다음 세포 현탁액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 섭씨 2도, 400배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 350마이크로리터의 핵 분해 완충액에 다시 현탁시킵니다. 섭씨 37도에서 5분 동안 샘플을 배양한 후 미세코커스 뉴클레아제를 첨가하고 볼텍싱으로 혼합합니다.

섭씨 37도에서 5분에서 20분 동안 샘플을 배양하고 2분마다 반전을 통해 샘플을 혼합합니다. 어느 정도 농도를 유지하는 데 걸리는 시간은, 세포주 사이에 있는 경우, 최적화가 아닌 효소 전단의 경우 최적화가 필요할 수 있습니다. 시판되는 소닉케어(sonicare)를 사용하는 대안적인 전단 절차는 텍스트 프로토콜에서 찾을 수 있다.

micrococcal nuclease를 사용한 배양 후 7마이크로리터의 얼음처럼 차가운 0.5몰 EDTA를 첨가하여 반응을 중지합니다. 전단된 DNA로 샘플을 16, 200배 G, 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다. 상등액이 포함된 전단된 DNA를 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

50마이크로리터를 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 분주하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 DNA의 성공적인 절단을 확인합니다. 남은 부피는 면역침전을 위해 즉시 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 10-25마이크로그램의 전단 교차 결합 염색질과 25마이크로리터의 염색질 면역침전 등급 단백질 G 마그네틱 비드를 결합합니다.

그런 다음 10마이크로리터의 면역침전 희석 완충액과 1마이크로리터의 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. 4시간 배양 후 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브에 1-10마이크로그램의 항체를 추가합니다. 그리고 증류수를 최종 부피 100마이크로리터에 추가합니다.

엔드-투-엔드(end-to-end) 로테이터에서 샘플을 섭씨 4도에서 4-12시간 동안 배양합니다. 배양 후 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 마그네틱 비드가 튜브 측면에 응집되면 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다.

800마이크로리터의 세척 완충액 1개로 구슬을 세 번 세척합니다. 세척할 때마다 튜브를 여러 번 뒤집어 비드를 혼합합니다. 그런 다음 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓고 마그네틱 비드가 튜브 측면에 응집되면 세척 버퍼를 조심스럽게 제거합니다.

다음으로, 동일한 절차를 사용하여 800마이크로리터의 세척 버퍼 2로 비드를 한 번 세척합니다. 세척 후 비드를 50마이크로리터의 용리 완충액에 다시 현탁시키고 실온에서 15분 동안 종단 간 회전체에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 마그네틱 스탠드를 사용하여 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.

교차 연결을 역전시키기 위하여 5 몰 염화나트륨의 6 마이크로리터를 추가하고, proteinase K.의 2 마이크로리터가 표본을 섞은 후에, 65 섭씨 온도에 2 시간 동안 그(것)들을 배양하십시오. 이 시점에서 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 결합 부위에 대해 샘플을 직접 분석하거나 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. SCF 프로모터에 대한 SMAD2의 TGF 베타 1 유도 결합을 확인하기 위해 염색질 면역침전 분석을 수행했습니다.

TGF 베타 1 처리는 인간 간암 라인, HepG2 및 Hep3B에서 SCF 프로모터에 SMAD2가 결합하는 결과를 낳았습니다. TGF beta 1 자극이 없는 경우, SMAD 결합은 관찰되지 않았다. 양성 대조군으로, TGF beta 1-induced SMAD activation에 대해 PAI-1에 대한 염색질 면역침전을 수행하였다.

PAI-1 프로모터는 TGF 베타 및 SMAD의 알려진 표적입니다. SMAD2 면역침전의 특이성은 비특이적 IgG 항체의 사용을 통해 확인되었습니다. IgG를 사용한 면역침전 후 SBE에 대한 SMAD2 결합은 관찰되지 않았습니다.

TGF 베타 리간드 유전자에 대한 STAT3의 TGF 베타 1 유도 결합을 확인하기 위해 TGF 베타 1 처리된 HepG2 및 Hep3B 세포를 사용하여 염색질 면역침전 분석을 수행했습니다. TGF 베타 1 처리는 STAT3가 TGF 베타 유전자의 두 번째 추정 STAT3 결합 부위에 결합하는 결과를 낳았지만, 첫 번째 부위에는 결합하지 않았습니다. 이 예에서 STB-2에 대한 양수 STAT3 바인딩은 내부 양수 대조군 역할을 합니다.

다른 염색질 면역침전 실험과 유사하게, IgG를 사용한 면역침전 후 ST-2에 대한 STAT3 결합은 관찰되지 않았습니다. 일단 숙달되면 이 기술은 제대로 수행된다면 항체에 따라 하루나 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 실험실 안전 지침을 따르고 프로토콜의 모든 단계에서 매우 정확해야 합니다.

이 절차를 수행하는 동안 MSDS를 확인하고 장갑, 흰 코트, 보안경과 같은 보호 장비를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 DNA 결합 염기서열에 대한 단백질 결합을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 프로토콜에 따라 염색질 면역침전으로 입증된 단백질 DNA 결합의 기능적 관련성을 확인하기 위해 프로모터 분석과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.