골지 - 콕스 방법을 이용한 고령의 해마 상피 세포의 수지상 돌기 복잡성 평가

이 방법론의 전반적인 목표는 수지상 형태와 복잡성을 조사하고 정량화하기 위해 골지체를 적절하게 염색하는 것입니다. 이 방법은 신경 과학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 골지 염색은 세포의 작은 부분 집합만 염색하기 때문에 이 기술은 뉴런의 구조를 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

이 기술의 가장 큰 장점은 뇌 부분이 세척 단계에서 건조되거나 떨어질 위험 없이 쉽게 염색될 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 Allen 박사 연구실의 대학원생인 Fred Kiffer, Tyler Alexander 및 Julie Anderson입니다. 갓 수확한 고정되지 않은 설치류의 반쪽 뇌를 5ml 또는 염화수은 기반 용액에 담그는 것으로 시작합니다.

염화수은 용액은 빛에 민감하므로 튜브를 호일로 덮으십시오. 샘플을 실온의 어두운 곳에 보관하십시오. 다음 날, 생물학적 위험 폐기물 용기에 적절하게 폐기하기 전에 용액을 임시 용기에 천천히 디캔팅합니다.

5ml의 신선한 염화수은 용액을 넣고 뇌가 잠기도록 합니다. 샘플을 실온에서 13일 더 어두운 곳으로 되돌립니다. 14일 후, 90ml의 증류수 또는 탈이온수(DH2O)에 30g의 동력 함침 후 완충액을 첨가하여 함침 후 완충액을 준비합니다.

6웰 플레이트의 각 웰에 6.5ml의 함침 후 완충액을 뇌당 1웰씩 채웁니다. 그런 다음 이전과 같이 뇌 조직에서 염화 수은 용액을 제거합니다. DH2O로 조직을 헹구고 함침 후 완충액이 있는 6웰 플레이트로 조직을 옮깁니다.

접시를 호일로 덮고 어두운 곳에서 실온에 보관하십시오. 다음날, 흡입하고 함침 후 완충액을 교체합니다. 접시를 다시 덮고 섭씨 4도의 냉장고에 보관하십시오.

뇌당 2개 또는 3개의 12웰 플레이트를 준비하고, 먼저 뚜껑에 있는 플레이트에 왼쪽에서 오른쪽으로, 위에서 아래로 오름차순으로 숫자를 표시한다. 절편된 뇌의 식별 번호를 추가합니다. 각 플레이트의 각 웰에 2밀리리터의 1X PBS를 피펫팅한 다음 스테이지를 설정하고 바이브라톰을 켭니다.

그런 다음 표본 홀더의 조직 블록에 테이프를 붙이고 그 위에 약간의 시아노아크릴레이트 접착제를 추가합니다. 6웰 플레이트에서 뇌를 꺼내 플라스틱이나 유리 접시에 담습니다. 스테인리스 스틸 양날 날을 사용하여 소뇌를 꼬리 쪽으로 자르고 뇌에 남아 있는 소뇌 부분이 평평한지 확인합니다.

그런 다음 남은 소뇌의 평평한 표면을 접착제에 놓습니다. 접착제가 건조된 후 티슈와 함께 표본 홀더를 표본 수조에 넣습니다. 비브라톰에 표본 수조를 놓고 조직 샘플을 PBS로 덮습니다.

그런 다음 블레이드를 비브라톰의 블레이드 홀더에 부착하고 블레이드가 완전히 잠기고 조직 상단보다 약간 아래에 올 때까지 블레이드를 표본 수조로 천천히 내립니다. 그런 다음 비브라톰 속도를 7로, 진폭을 6으로, 절단 각도를 12도로 설정합니다. 진동을 시작하고 200미크론 섹션을 자릅니다.

큰 페인트 브러시를 사용하여 표본 수조의 조직 부분을 12웰 플레이트의 지정된 각 웰로 이동합니다. 원하는 조직 절편 수에 도달할 때까지 조직을 계속 절단합니다. 절편 후 전사 피펫을 사용하여 12웰 플레이트의 웰에서 PBS를 흡인한 다음 PBS-T 2ml를 넣고 교반으로 30분 동안 세척합니다.

세척 기간이 끝날 무렵 3 부로 수산화 암모늄 용액을 DH2O 5 부로 희석합니다. 그런 다음 PBS-T를 제거한 후 희석된 수산화암모늄 용액을 첨가합니다. 호일을 사용하여 빛을 피하고 19-21 분 동안 섹션을 염색하십시오.

그런 다음 수산화암모늄 용액을 안전하게 제거한 후 염색 후 완충액을 추가합니다. 호일로 보호하고 19-21분 동안 더 염색합니다. 마지막으로 PBS-T의 섹션을 매번 5-10분 동안 세 번 헹굽니다.

큰 페인트 브러시로 1% 젤라틴 코팅된 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 실온에서 20-30분 동안 건조시킨 다음 Coplin Jar에 넣고 밤새 그대로 두십시오. Coplin Jar에서 슬라이드를 제거하고 흄 후드의 플라스틱 선반에 넣습니다.

100% 에탄올이 함유된 염색 접시에 5분 동안 담습니다. 두 번의 추가 5분 에탄올 세척을 통해 섹션을 탈수합니다. 그런 다음 슬라이드를 유리 선반에 놓고 금속 손잡이를 사용하여 99% 자일렌이 함유된 유리 염색 접시에 랙을 내립니다.

자일렌을 두 번 갈아서 각각 5분씩 세탁합니다. 두 번째 세척 시간이 경과한 후 크실렌에서 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 약 0.25ml의 장착 매체로 조직을 빠르게 덮습니다. 그런 다음 슬라이드 덮개를 가져 와서 미디어 위에 놓습니다.

슬라이드 커버 아래에 갇힌 기포를 페인트 브러시 끝과 같은 뭉툭한 물체로 가장자리로 밀어 넣습니다. 슬라이드를 직사광선이 닿지 않는 곳에 놓고 2-3일 동안 건조시킵니다. 건조 후 현미경을 사용하여 이미지 획득을 진행하고 적절한 소프트웨어로 분석합니다.

이 명시야 이미지는 이미징 및 추가 분석 기준을 충족하는 Golgi로 염색된 뉴런을 보여줍니다. 세 가지 척추 유형 모두 쉽게 볼 수 있습니다. 염색은 수상돌기의 전체 길이에 걸쳐 일관되며 수상돌기는 다른 뉴런과 분리됩니다.

이 그림은 Dentate Gyrus 내의 Golgi 염색 뉴런이 식염수 처리군에 비해 5-fluorouracil 처리 후 4차 및 6차에서 길이가 감소했음을 보여줍니다. 골지 염색은 척추 밀도의 현저한 차이를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. CA1 정점 피라미드 수상돌기에서 살아있는 마우스에 대한 5-플루오로우라실 투여는 척추 밀도를 현저히 감소시켰습니다.

기저 수상돌기에서는 가시의 전체 밀도에 큰 변화가 없었습니다. CA1 정점 피라미드 수상돌기에 대한 숄 분석은 5-플루오로우라실 처리로 소마에서 40-160미크론 떨어진 거리에서 수지상 가지화를 현저히 감소시키는 것으로 나타났습니다. 기저 수상돌기에서 5-플루오로우라실 처리는 소마에서 30-110미크론 떨어진 곳에서 수지상 수목화를 감소시켰습니다.

일단 숙달되면, 골지체(Golgi) 염색 과정과 장착, 세척 및 덮는 과정을 모두 고려하는 이 기술은 적절하게 수행된다면 뇌당 3시간 안에 완료할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 신경생물학 분야의 연구자들이 쥐 모델에서 신경해부학적 연결을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 뉴런이 과도하게 염색되지 않도록 수산화암모늄 용액의 절편을 19-21분 동안만 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 뇌 조직을 적절하게 염색하고, 절단하고, 헹구는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 염화수은 용액, 수산화암모늄 용액 및 크실렌으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행할 때 예방 조치를 취하고 실험실 장갑을 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오.