Name: 재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 배우세요 신경 돌기를 빠르게 확장하고 정밀하게 연결하는 마이크로유체 챔버 기법을 사용한 재귀 신경 회로 연구 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준의 정밀한 조작과 재현성 있는 실험을 가능하게 합니다.

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많은 도움이되는 토론과 통찰력을 얻으려는 요요이 미야하라 (Yoichi Miyahara)에게 감사드립니다. MA와 PG는 NSERC로부터 자금 지원을 인정합니다.

아래에 설명 된 모든 절차는 McGill 대학의 동물 관리위원회 (Animal Care Committee)의 승인을 얻었으며 캐나다 동물 보호 협회 (Council of Animal Care)의 가이드 라인을 준수했습니다. 1. Microfluidic 장치를 사용하여의 연결 문화의 표준화 : 장치 조립 <ol><li> 원하는 실험에 적합한 마이크로 유체 장치를 선택하십시오. 동일한 집단 내에서 뉴런을 연결하려면 Neuro Devices ( 그림 1 )를 사용하고 다른 집단의 뉴런을 연결하려면 Co-Culture Devices ( 그림 6 )를 사용하십시오. </li><li> 멸균 된 커버 슬립이나 유리 바닥 접시를 깨끗하게 준비하십시오. 플라스틱 표면의 최상의 결과를 얻으려면 35mm 접시, 유리 사용시 25mm 커버 슬립 또는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 이미징 시스템을 기준으로 유리 두께를 선택하십시오 (예 : 0.15 mm). </li><li> 접시 또는 coverslips를 2 시간 또는 밤새 실온에서 100 μg / ML PDL 0.5-1 ML와 코트ature. 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지하고 필요할 경우 다음 날에 다시 시작할 수 있습니다. 또한, 붕산염 완충액으로 희석 된 PDL, Poly-L-Lysine (PLL), 라미닌 또는 기타 세포 접착 분자로 식탁을 코팅 할 수 있습니다. </li><li> 접시를 물로 두 번 씻으십시오 (소금 결정이 채널을 차단할 수 있으므로 인산염 완충 용액을 사용하지 마십시오). 모든 액체를 제거하고 바이오 안전성 캐비닛과 같은 살균 환경에서 5 ~ 10 분 동안 건조시킵니다 표면이 완전히 건조합니다. 참고 : 잔여 액체가 미세 유체 시스템의 부착을 방해하므로 커버 슬립이 완전히 건조되도록주의하십시오. </li><li> 멸균 환경 (biosafety 캐비닛)에서 10 분 동안 자외선 아래 패턴을 향한 미세 유체 장치를 놓습니다. 바이오 안전성 캐비닛에서 작업 할 때 무균 절차를 따르십시오 10 . </li><li> 핀셋을 사용하여 깨끗한 coversl와 접촉 패턴을 아래로 향하게 microfluidic 장치를 놓으십시오ip / dish. 핀셋을 사용하여 장치를 부드럽게 눌러 유리에 달라 붙지 않도록하십시오. 참고 : 빛을 바라 볼 때 접착 된 영역의 투명도가 보입니다. 모든 모서리가 유리에 닿아 있는지 확인하십시오. 모든 마이크로 유체 장치에이 작업을 수행하십시오. 그림 1a를 참조하십시오. </li><li> 단일 모집단 장치를 매체로 채우려면 피펫을 채널쪽으로 향하게하고 혈청이없는 B-27 (체적 비율 1:50)과 500 μg / mL 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민 (보편적으로 보충 된 50 μL의 완전한 세포 배지를 첨가하십시오 NBM이라고 함)을 오른쪽 상단에 넣은 다음 대각선 방향으로 우물에 50 μL를 더합니다. 모든 장치에 대해 이것을 수행하고, 매질이 우물 사이를 흐르도록하십시오. 다음, 남아있는 2 개의 우물에 매체 50 μL를 추가합니다. 그림 2a를 참조하십시오. <ol><li> 매체가있는 여러 개의 모집단 장치를 채우려면 피펫을 채널쪽으로 향하게하고 30 μL완전한 우물에 대한 완전한 NBM의 그림 6a를 참조하십시오. 모든 장치에 대해 이것을 수행하고, 매질이 우물 사이를 흐르도록하십시오. 다음, 나머지 4 우물에 매체 50 μL를 추가합니다. </li></ol></li><li> 세포 배양을 준비하는 동안 1-2 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도)에 autoclaved 물 (습식 챔버)와 장소와 오픈 접시와 함께 더 큰 접시에 장치를 놓으십시오. 그림 2b를 참조하십시오. </li></ol> 2. Microfluidic 체계에있는 뉴런의 도금 <ol><li> Ref. 8 , Sprague Dawley 쥐 배아 (성별)에서 해리 된 해마 또는 피질 뉴런을 얻는다. </li><li> NBM에서 1 ~ 2 백만 뉴런 / mL의 농도로 배아 뉴론을 Resuspend. hemocytometer 및 참조 8 다음과 현미경에서 세포 농도를 확인합니다. 세포 농도 조절g을 원하는 세포 밀도로 증가시킨다. 채널당 단일 해마 축삭을 얻는 기회를 높이려면 장치 당 10,000 뉴런을 준비하십시오. 동일한 채널에 여러 개의 축색 돌기를 갖기 위해서는 장치 당 60,000 개의 뉴런이 있어야합니다. 참고 :이 숫자는 사용 된 연결 유형에 따라 다릅니다. </li><li> 우물을 비우지 않고 microfluidic 장치에서 매체를 제거합니다. 각각 약 5 μL를 남겨 둡니다. </li><li> 단일 모집 장치에 세포를 플레이트하려면 우 하단에 NBM 50 μL를 잘 넣으십시오. 이 시점에서 매체는 다른 하부 우물을 채우기 위해 그 자체로 흐릅니다. 그림 1b 에 표시된 대로 microfluidic 장치의 오른쪽 상단에 농축 세포 솔루션 20 μL를 추가합니다. <ol><li> 여러 개의 모집단 장치에 세포를 정돈하려면 그림 6a 의 오른쪽 우물 각각에 20 μL의 농축액 솔루션을 추가하십시오. </li></ol></li><li> 세포가 현미경에 있는지 확인하십시오.챔버 내부에 있으며 15 ~ 30 분 동안 인큐베이터에 장치를 배치하여 세포에 세포 부착을 촉진합니다. </li><li> 챔버에 세포가 충분한 지 현미경으로 확인하십시오. 더 필요한 경우 2.4 및 2.5 단계를 반복하십시오. </li><li> 세포가 여러 인구 장치에 주입되었다 같은 우물에 단일 인구 장치와 NBM 20 μL의 2 우물에 50 μL의 NBM을 추가합니다. 미디어는 약간 돌출되어 웰스에게 머핀 상단면을 제공하는 긍정적 인 반월 상 연골을 형성합니다. 다시, 그림 2a 를 참조하십시오. </li><li> 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도에서 세포를 유지하십시오. </li></ol> 3. 신경 세포 배양 유지 <ol><li> 세포에서 NBM (피펫으로 약 30 μL)을 제거하고 장치에 도입 한 다음 날 (즉, 2 단계 후에 1 d)에 새로운 예열 된 NBM을 적용하십시오. </li><li> 각 채널에 매체가 충분한 지 2 일 간격으로 확인하십시오. 머핀 Top가 낮 으면 맨 위 웰에 매체를 추가하십시오. </li><li> microfluidic 장치의 제거하기 전에 최소한 7 일 동안 문화 세포. 세포는 몇 주 동안이 장치에서 생존 할 수 있습니다. 샘플을 실험하기 1-2 일 전에 장치를 제거하십시오. </li></ol> 4. 미세 유체 장치의 제거 <ol><li> microfluidic 장치의 제거하기 전에 1 - 2 d, 챔버에 범람하고, 인큐베이터에 장치를 유지 각 샘플 접시 37 ° C에 prewarmed NBM 2 ML을 추가합니다. </li><li> 살균 핀셋과 하나의 팁을 사용하여 뉴런의 패턴 구성을 남긴 coverslips에서 microfluidic 장치를 제거합니다. 팁을 사용하여 커버 슬립을 제자리에 고정하고 핀셋을 사용하여 우물의 왼쪽 하단 모서리에있는 장치의 가장자리를 고정시킵니다. 섬세하게 비틀림을 가하여 장치를 핀셋으로 들어 올리면 덮개가 벗겨집니다. 그림 2c - 2d를 참조하십시오. </li><li> 2 ~ 3 일마다 하를 교체하십시오.샘플이 실험에 사용될 때까지 NBM. </li><li> 샘플의 재배 선 실험을 수행하기 전에, 단일 모집단 채널의 신경 돌기 및 다중 모집단 장치의 연결 인구가 현미경에서 이들 사이의 틈을 조사하여 고립되어 연결 인구를 연결하는 필라멘트가 없는지 확인하십시오. </li></ol> 5. PDL 코팅 비드 준비 <ol><li> PDL (100 μg / ML) 1 ML에 물 (1 : 500)로 희석 4, 10 또는 20 μm의 폴리스티렌 구슬의 2 X 50 μL 방울을 추가합니다. 실온에서 최소 2 시간 동안 방치하십시오. 참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지하고 다음 날에 다시 시작할 수 있습니다. </li><li> 용액을 8,820 xg에서 1 분간 원심 분리한다. 조심스럽게 용기 바닥에 쌓인 구슬을 방해하지 않고 뜨는 제거. </li><li> 구슬을 멸균 10 MM HEPES pH 8.4 용액 1 mL로 두 번 씻으십시오. </li><li> 10 MM HEPES pH 8.4 200 ML에 PDL 코팅 구슬을 Resuspend해결책. </li></ol> 6. 준비 Micropipettes <ol><li> 수평 전극 풀러를 사용하여 유리 모세관 튜브 (내경 1mm, 외경 1.5mm)에서 피펫을 준비합니다. 뽑아 낸 마이크로 피펫의 바깥 쪽 끝 부분이 ~ 2-5 μm가되도록 설정을 조정하십시오. 잡아 당기기 전에 유리관이 깨끗한 지 확인하십시오. </li><li> 피펫을 고정 용 유리 슬라이드에 고정시키고 팁이 깨지기 쉽기 때문에 팁이 슬라이드 표면에 닿지 않도록하십시오. 먼지로부터 보호하기 위해 덮여있는 용기에 실온에서 보관하십시오. 그들이 당겨지는 날 피펫을 사용하십시오. </li></ol> 7. 뉴런에 대한 PDL 비드 접착 <ol><li> 4 단계에서 준비된 세포 배양에 5 단계에서 준비한 40-60 μL의 PDL 코팅 비즈를 추가합니다. 커버 슬립에 희미하게 보이는 뉴런 위에 피펫 팁을 놓고 비즈를 추가하십시오 ( 그림 3 참조). </li><li> sy의 형성을 촉진하기 위해 1 시간 동안 인큐베이터로 시료를 되돌려주십시오.naptic 접촉 8 , 9 . </li><li> 배양 후 예열 된 NBM으로 배양액을 부드럽게 씻어서 부착되지 않은 비드를 제거합니다. </li></ol> 8. 생리 식염수 용액 준비 (실내 온도 실험 용) <ol><li> 참고 문헌 7 , 8 에 열거 된 성분을 혼합하여 생리 식염수 용액을 준비한다. 이것은 인큐베이터 외부 의 세포 환경을 조절하는 것입니다. </li><li> 참고 문헌 7 , 8 에 표시된대로 삼투압과 pH 수준을 확인하십시오. </li><li> 실험을 수행하면서 pH 변동을 최소화하기 위해 지속적으로 용액에 O 2 를 주입합니다. </li><li> 상온으로 가열. </li><li> 플라스틱 튜브 (선택 사항)의 한쪽 끝을 O 2가 주입 된 생리 용액에 넣고 다른 쪽을 고정하여 관류 시스템을 설정하십시오.샘플 홀더에 삽입 된 바늘에. 튜빙과 용액을 샘플보다 높게 위치시킵니다 ( 그림 4 참조). <ol><li> 튜브를 바늘에서 분리하고 주사기에 연결하십시오. 주사기를 사용하여 압력을 가하고 액체를 흡입하여 튜브를 채 웁니다. 롤러 클램프로 봉인하고 바늘을 다시 연결하십시오. </li></ol></li></ol> 9. 비드 미세 조작 <ol><li> 거꾸로 된 광학 현미경의 40X 상 대물 렌즈 (개구 수 0.6)를 사용하여 micromanipulators에 장착 된 두 개의 마이크로 피펫으로 위에서 접근 할 수 있고 아래에서 광학적으로 접근 할 수 있도록 실험 배열에 샘플을 설치하십시오. 이 구성에서 현미경의 측면 포트에 이미지 캡처를위한 CCD 카메라를 탑재하십시오. 플라스틱 튜브를 통해 1mL 주사기에 각 피펫을 연결합니다. 이 단계에서 NBM을 생리 식염수 (1-2 mL)로 교체하십시오 ( 그림 4 참조). </li><li> 체험 도중단계 8에서 제조 한 생리 식염수 용액을 0.5-1 mL / min의 속도로 연속적으로 세포를 관류시킨다. </li><li> 시야에서 뉴런에 붙어 있지 않은 PDL 비드를 선택하십시오. 비드를 마이크로 피펫까지 초점을 맞추어 마이크로 피펫 팁과 정렬시킵니다. 현미경을 통해 그것을 모니터링하여 가능한 한 팁을 비드에 가능한 가깝게 가져 오십시오. </li><li> 비드를 데리러 피펫에 연결된 1 ML 주사기와 부정적인 압력을 적용합니다. 실험 전반에 걸쳐 부정적인 압력을 유지하십시오. </li></ol> 10. 이빨 꾸는 자 <ol><li> 시야에서 뉴런에 붙어있는 PDL - 비드를 선택하고 9.3-9.4 단계에 설명 된대로 흡인을 사용하여 두 번째 micropipette에 붙이십시오. </li><li> PDL - 비드 - 뉴런 복합체를 천천히 (~ 0.5 μm / min) 당겨서 마이크로 조작기 또는 시료 스테이지를 1 μm 이동시키고 5 분간 멈추어 신경 돌기 시작을 허용하십시오. </li><li> 10.2 단계를 두 번 반복하십시오. 참고 : 처음 3 &amp;실험적 성공을 보장하기 위해 매우 천천히 잡아 당겨야하는데, 이는 시간의 95 % 이상 발생합니다. </li><li> PDL - 비드 - 뉴런 복합체를 서서히 (~ 0.5 μm / 분) 끌어 당기고 micromanipulator 또는 샘플 스테이지를 2 μm 이동시키고 신경 돌기 연장을 허용하기 위해 5 분 동안 정지시킨다. </li><li> 처음 5 μm의 성공적인 개시 및 신경 돌기 확장 후, mm 거리 규모 이상의 20 μm / min에서 신경 돌을 당겨. 참고 : 당기기는 연속적으로 또는 단계적으로 그리고 다양한 속도로 수행 될 수 있습니다. 그림 5b -5c를 참조하십시오. </li></ol> 11. 뉴런 연결하기 <ol><li> 신경 돌기가 많은 부위를 선택하고 PDL- 비드 - 신경 돌기 복합체를 낮추어 물리적으로 접촉시킵니다. 다른 구슬을 사용하여 coverslip 표면 위의 팁 높이를 측정합니다. 그림 5d를 참조하십시오. </li><li> 두 번째 micropi를 조작하면서 PDL - 비드 - 신경 자극 복합체를 대상 신경 돌과 접촉 상태로 두십시오쁘띠. 두 번째 PDL 비드와 함께 새로 형성된 신경 돌기의 상단에 약 20 μm의 형태로 첫 번째 비드를 놓습니다. 두 번째 PDL - 비드를 사용하여 새로운 신경 자극 필라멘트를 대상 세포쪽으로 밀어냅니다. </li><li> 적어도 1 시간 동안 두 구슬을 제자리에 두십시오. 현미경으로 비드와 접촉하는 신경 돌기가 두꺼워지는 것을 확인하십시오. </li><li> 이 시간 동안 재관류를 사용하여 시료의 배지를 생리 식염수에서 예열 된 CO 2 평형 NBM으로 서서히 변경하십시오. </li><li> 흡입을 해제하여 두 번째 피펫에서 비드를 놓습니다. 새로운 신경 돌기가 붙어 있으면 첫 번째 비드도 놓습니다. 그림 5e를 참조하십시오. </li><li> 부드럽게 식염수를 제거하고 NBM (~ 2 ML)로 바꿉니다. </li><li> 조심스럽게 미래 실험을위한 연결을 강화하기 위해 인큐베이터에 샘플을 다시 놓습니다. 이 연결은 24 시간 이상 안정적 임 </sup&gt;. </li></ol> 12. 전체 셀 페어링 된 패치 클램프 녹음을 통해 새 연결 의 기능 확인 <ol><li> 참고 문헌 7 , 18 , 19를 따른다. 전기 생리학 셋업 </li><li> 참고 문헌 7을 따른다. 사전 및 postsynaptic 전극 준비. </li><li> 참고 문헌 18 , 19에 따라 패치 클램프 데이터를 수집하십시오. </li><li> 결과를 자연스럽게 발생하는 신호 7 과 비교하여 연결 유형을 결정하십시오. </li></ol>

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</ol>

저자 인 Margaret H Magdesian은 본 기사에서 사용 된 도구를 생산하는 Ananda Devices의 CEO입니다.

표준 micromanipulation과 혁신적인 microfluidic 장치를 사용하여, 새로운 기술은 빠른 거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 연결하기 위해 개발되었습니다. 피펫 micromanipulation은 대부분의 신경 과학 연구소 4 , 13 에서 일반적인 도구입니다. 재현성 있고 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 실질적인 과제는 마이크로 미터 정밀도의 세포 배양을 구성하는 마이크로 유체 장치의 개발을 통해 실험 기간 동안 (수 주일 수 있음) 건강하고 정확한 위치의 연결 문화를 표준화하는 것이 었습니다. 고품질 세포 배양은 데이터 검증의 초석입니다. 이것은 쉽고 빠른 현미경 이미징 및 문화와 결과의 표준화에 기여합니다. microfluidic 장치는 생체 내 에서 비슷한 조직으로 체외에서 세포를 배양하기 위해 설계되었습니다. 단일 모집 장치로긴 신경 돌기의 ...

성인 중추 신경계 (CNS)에 부상을 입으면 축삭 재성장을 제한하는 여러 메커니즘으로 인해 영구적 인 장애가 발생할 수 있습니다 1 . 손상 후 많은 CNS 축색 돌기가 새로운 성장 원추를 형성하지 못하고 효과적인 재생 반응 2를 일으키지 못합니다. 또한, CNS 병변을 둘러싼 손상 및 흉터 조직은 axonal 성장을 크게 억제 1,2,3 . 손상 후 CNS 재생을 촉진시키는 현재의 치료법은 부상당한 뉴런의 본질적인 성장 잠재력을 높이고 myelin 파편과 glial scar 1 , 3 과 관련된 axonal extension의 억제제를 마스킹하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 먼 축삭을 먼 표적으로 재생시키고 적절한 기능 시냅스를 형성하는 능력은 심각하게 제한되어있다 . </sup&gt; 5 , 6 , 7 . 현재 연구에서, 마이크로 비드, 피펫 마이크로 조작 및 마이크로 유체 장치는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 개시, 연장 및 정확하게 연결하는 데 사용됩니다. 이전 연구는 poly-D-lysine-coated beads (PDL- 비드)가 시냅스 소포 복합체의 클러스터링과 기능적인 시냅스 전처리 8의 형성에 이어 막 접착을 유도한다는 것을 보여 주었다. PDL- 비드가 시냅스 전 분화 후에 기계적으로 제거되면 시냅스 단백질 군집이 비드를 따라 가면서 새로운 신경 돌기 9를 시작한다는 것도 보여 주었다. 다음 절차는 polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic 장치를 사용하여 coverslip에 조직화 된 영역으로 쥐의 배아 hippocampal 뉴런을 배양하여 신경 세포를 정확하게 재 연결하는 능력과 함께이 사실을 이용합니다회로. 이러한 PDMS 마이크로 유체 장치는 무독성이며 광학적으로 투명하며 마이크로 채널 시스템으로 연결된 두 개의 챔버로 구성됩니다. 일단 coverslip에 조립, 각 장치는 연결 성장을 유도 하고 체외에서 4 주 이상에 대한 정확한 패턴에 건강한 연결의 문화를 유지하기 위해 금형 역할을합니다. 여기, 새로운 신경 돌기의 확장과 기능의 한계를 조사하는 프레임 워크가 제시됩니다. 새로운 기능성 신경 돌기가 만들어져 신경 세포 네트워크를 제어 가능하게 (재) 배선 할 수 있습니다. 달성 된 확장 속도는 밀리미터 - 스케일 거리에서 20 μm / min보다 빠르며 기능적 연결이 확립됩니다. 이러한 결과는 예기치 않게 길항에 대한 이들 신경 돌기의 내재적 능력이 이전에 생각했던 것보다 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 이 제안 된 기계적 접근법은 느린 화학 전략을 우회하고 특정 타겟에 대한 제어 된 연결을 가능하게합니다. Th기술은 손상 후 신경 연결성을 복원하기위한 새로운 치료법에 대한 in vitro 연구를위한 새로운 방법을 제시합니다. 그것은 또한 시험 관내에서 신경 신호 처리 및 연결 기능의 근본적인 측면을 조사하기 위해 신경 네트워크의 조작 및 재배 선을 가능하게합니다.

<table><tbody><tr><td>공동 배양 장치</td><td>Ananda Devices</td><td></td><td>에서 시판되는 http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro devices</td><td>Ananda Devices</td><td></td><td>http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dish #0, Uncoated, Gamma-Irradiated</td><td>MatTex Incorporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35mm 세포 배양 접시, 비발열성, 멸균</td><td>Corning Inc</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>95mm x 15mm 페트리 접시, 미끄러질 수 있는 뚜껑, 멸균 폴리스티렌</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브, 인쇄된 눈금 및 플랫 캡</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>15mL 폴리프로필렌 원추형 튜브, 17 x 120mm 스타일, 비발열성, 멸균</td><td>매</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>세포외 솔루션</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50X), 세럼 프리</td><td>B-27 보충제 (50X), 세럼 프리</td><td>17504044</td><td>세포외 솔루션</td></tr><tr><td>Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>세포외 용액</td></tr><tr><td>200 &mu; L 피펫터</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L Pipettors</td><td>에어로졸 내성 팁</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 3mL 전사 피펫 [비멸균]</td><td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>세포외 용액</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>세포외 용액/비드</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>세포외 용액</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>세포 외 솔루션</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>세포 외 솔루션</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>세포 외 솔루션</td></tr><tr><td>#5 Dumont Dumostar 핀셋 11cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>해부 도구</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 기반 마이크로 입자, 10 &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 튜브</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>14696-2</td><td></td></tr><tr><td>수평 피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>갈색 플레이밍 P-97</td><td></td></tr><tr><td>미세 조작기, PCS-5000 시리즈</td><td>SD 기기</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>광도 캐</td><td>스케이드 II: 512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>쥐 해부</td></tr><tr><td>Typsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드</td><td>라이프 테크놀</td>로지스 <td>25300054</td><td>쥐 해부</td></tr><tr><td>DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L 피루브산나트륨]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>쥐 해부</td></tr><tr><td>HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- 염화칼슘, - 염화마그네슘, - 황산마그네슘]</td><td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>쥐 해부</td></tr></tbody></table>

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

뇌와 척수 손상은 장거리에서 뉴런을 재생성하고 적절한 표적으로 정확하게 다시 연결할 수 없기 때문에 영구적 인 장애와 죽음을 초래할 수 있습니다. 여기서는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 정확하게 연결하는 절차가 설명됩니다. 달성 된 신장율은 말초 신경계에서 가장 빠르게 성장하는 축색 돌기의 생체 내 속도 (0.02-0.04mm / h)보다 30-60 배 빠르고 1.2mm / h를 초과하고 이전에보고 된 것보다 10 배 더 빠릅니다 발달의 초기 단계에서의 연결 유형 4 . 첫째, 쥐 hippocampal 뉴런의 고립 된 인구는 microfluidic 장치에서 2-3 주 동안 세포를 정확하게 위치시키기 위해 성장되어 쉽게 미세 조작과 실험적 재현성을 가능하게한다. 다음으로, poly-D-lysine (PDL)으로 코팅 된 비드를 신경 돌기에 위치시켜 접착 성 cont행동 및 피펫 micromanipulation 결과 비드 - 신경 자극 단지를 이동하는 데 사용됩니다. 비드가 움직일 때 수백 마이크로 미터 이상으로 확장되고 1 시간 이내에 목표 세포에 기능적으로 연결된 새로운 신경 돌기가 빠져 나옵니다. 이 과정은 실험 재현성과 조작의 용이성을 가능하게하면서 느린 화학적 전략을 우회하여 신경 돌기 성장을 유도합니다. 여기에 제시된 예비 측정은 생리 학적 성장 속도를 훨씬 초과하는 연결 성장 속도를 보여줍니다. 이러한 혁신을 결합하면 전례없는 수준의 제어력으로 문화의 신경 네트워크를 정확하게 구축 할 수 있습니다. 뉴런 네트워크의 신호 전송과 의사 소통에 대한 많은 정보와 통찰력뿐만 아니라 연결 성장의 한계를 탐구하는 놀이터이기도 한 새로운 방법입니다. 잠재적 인 응용 및 실험은 신경 세포를 다시 연결하는 것을 목표로하는 치료법에 직접적인 영향을 미치며 널리 퍼져있다외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 l 회로.

배아 쥐 hippocampal 뉴런은 세포, PDL - 비즈 및 micromanipulators의 정확한 위치를 수 있도록 microfluidic 장치에서 교양 있습니다. 첫 번째 단계는 유리 coverslip이나 접시에 microfluidic 장치를 제대로 조립하는 것입니다. 챔버가 챔버에서 나와 밀봉되어야하는 장치의 부품 아래로 이동하는 것을 피하려면 마이크로 유체 장치가 기판에 잘 부착되어야합니다 ( 그림 1a ). 몇 주 동안 건강한 문화를 유지하기 위해서는 매 2-3 일마다 세포 배지를 확인하고 배양액의 양성 반월 상 연골을 보존하여 배지를 막는 것이 중요합니다 ( 그림 2a ). 중간 증발은 또한 더 큰 판 ( 그림 2b ) 안에 물과 셀을 모두 열어 놓음으로써 피할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치...

이 절차는 신경 돌기를 유도하는 마이크로 피펫에 고정 된 폴리 -D- 라이신 - 코팅 된 비드를 사용하여 마이크로 유체 챔버에서 조직화 된 신경을 신속하게 개시, 연장 및 연결하는 방법을 설명합니다.

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 새로운 뉴라이트를 생성하고, 이를 빠르게 신장시키며, 표적 세포에 정밀하게 연결하는 것입니다. 이러한 절차는 제어 가능하고 재현 가능한 환경에서 배양된 세포를 사용해야만 가능합니다. 이 방법을 통해 신경과학의 핵심 질문들에 대한 답을 얻을 수 있습니다.뉴런의 성장 속도를 제한하는 요인은 무엇일까요? 뉴런은 얼마나 빠르게 성장할 수 있을까요? 기계적 단서가 그 과정에서 역할을 할까요?우리는 또한 시냅스가 어떻게 형성되는지, 뉴런이 어떻게 표적 세포를 찾는지 연구할 수 있습니다. 시냅스는 어떻게 노화하고 성숙할까요? 셋째로, 체계적으로 신경망을 구축하기 시작하여 뉴런이 어떻게 계산하는지 연구할 수 있습니다.이 기술의 주요 장점은 조작이 용이하고 실험 재현성이 뛰어나며, 최종적으로 단일 세포 수준에서 높은 수준의 제어가 가능하다는 점입니다. 이 절차를 시작하기 위해, 필요한 수의 멸균 커버슬립을 세척하고 준비하십시오. 다음으로, 각 커버슬립에 100 µg/mL PDL 0.5~1 mL를 도포하고 실온에서 최소 2시간 동안 처리하십시오.그 후, 커버 슬립을 물로 두 번 세척하고 모든 액체를 제거합니다. 멸균 환경에서 5~10분 동안 또는 표면이 완전히 마를 때까지 건조시킵니다. 그런 다음, 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내에서 패턴이 위를 향하도록 미세유체 장치를 배치하고 UV 광선 아래에서 10분 동안 처리합니다.10분 후, 패턴이 아래를 향하도록 하여 마이크로플루이딕 장치를 깨끗한 커버슬립 위에 접촉시킵니다. 핀셋을 사용하여 장치를 살짝 눌러 유리에 밀착시킵니다. 단일 세포군 장치를 배지로 채우려면, 오른쪽 상단 웰에 완전 세포 배지 50 µL를 첨가합니다.그 다음, 대각선 방향의 웰에 완전 세포 배지를 50 µL 더 추가합니다. 다중 세포군 장치를 배지로 채우려면, 한 줄의 웰에 완전 NBM 30 µL를 추가하십시오. 배지가 웰 사이로 잘 흐르는지 확인하십시오.그 다음, 나머지 각 웰에 50 µL의 배지를 추가합니다. 멸균 증류수가 담긴 개방형 접시와 함께 장치들을 더 큰 플레이트에 넣고, 세포 배양을 준비하는 동안 1~2시간 동안 인큐베이터에 보관합니다. 이제, 웰을 완전히 비우지 않은 상태에서 미세유체 장치의 상단 웰로부터 배지를 제거합니다.그런 다음, 농축된 세포 용액 20 µL를 미세유체 장치의 우측 상단 웰에 넣고, 현미경으로 단일 집단 미세유체 장치 내부에서 세포가 어떻게 흐르는지 확인합니다. 다중 집단 장치에 세포를 도말하려면, 상단 웰 각각에 농축된 세포 용액 20 µL를 넣습니다. 현미경 하에서 세포가 챔버 내부에 있는지 확인합니다.그 후, 기질에 세포가 잘 부착되도록 장치를 인큐베이터에 15분에서 30분 동안 넣어둡니다. 세포가 기질에 부착되면, 단일 세포군 장치의 상단 두 웰에 NBM 40 µL를 추가합니다. 이는 마이크로 채널 내의 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다.세포를 주입했던 다중 군집 장치의 상단 웰에 MBM 20 µL를 추가합니다. 배지가 약간 돌출되어 양의 메니스커스를 형성하고, 웰의 윗부분이 머핀 윗면과 같은 모양이 되어야 합니다. 미세유체 장치를 제거하기 1~2일 전에, 각 샘플 접시에 미리 데워둔 NBM 2 mL를 추가하여 챔버를 가득 채웁니다.그런 다음, 장치들을 인큐베이터에 보관합니다. 이어서, 멸균 핀셋과 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립에서 미세유체 장치를 제거하여 뉴런의 패턴화된 구성을 남깁니다. 이 과정에서, 준비된 PDL 코팅 비드 40~60 µL를 세포 배양액에 첨가합니다.그다음, 시냅스 접점 형성을 촉진하기 위해 샘플을 인큐베이터에 넣고 1시간 동안 배양합니다. 이어서, 두 개의 마이크로피펫을 통해 세포를 위에서 평가하고 광학적으로 접근할 수 있도록 샘플을 실험 장치에 설치합니다. 이 구성에서 CCD 카메라는 이미지 캡처를 위해 현미경의 측면 포트에 위치합니다.생리식염수가 채워진 각 피펫을 1mL 시린지에 연결한 후, 생리식염수로 샘플을 관류합니다. 다음으로, 현미경 하에서 분리된 두 뉴런 집단 사이의 간격을 확인하여 두 집단이 자연적으로 연결되어 있지 않은지 확인합니다. 시야 내에서 뉴런에 부착되지 않은 PDL 비드를 선택합니다.비드와 마이크로피펫 팁의 초점을 각각 맞추어 비드와 팁의 위치를 정렬합니다. 그 다음, 현미경을 통해 관찰하면서 팁을 비드에 최대한 가깝게 가져갑니다. 이어서 피펫에 음압을 가해 비드를 흡입하고, 실험 전 과정 동안 음압을 유지합니다.이제 시야 내에서 뉴런에 부착된 PDL 비즈를 선택하고, 흡입을 이용하여 이를 두 번째 마이크로피펫에 부착합니다. 마이크로매니퓰레이터 또는 시료 스테이지를 분당 0.5 µm의 속도로 1 µm만큼 천천히 이동시켜 PDL 비즈-뉴런 복합체를 당긴 후, 신경돌기 형성을 위해 5분 동안 대기합니다. 다시 PDL 비즈-뉴런 복합체를 분당 0.5 µm의 속도로 2 µm만큼 측면으로 천천히 이동시켜 당긴 다음, 신경돌기 신장을 위해 5분 동안 대기합니다.성공적인 개시와 처음 5 µm 동안의 신경돌기 신장이 이루어진 후, 분당 20 µm의 속도로 신경돌기를 계속해서 당깁니다. 뉴런을 연결하려면 신경돌기가 풍부한 영역을 선택하십시오. 다른 비드를 사용하여 커버슬립 위 피펫 팁의 높이를 측정하고, PDL 비드-신경돌기 복합체를 내려 신경돌기에 물리적으로 접촉하게 합니다.두 번째 마이크로피펫을 조작하는 동안 PDL 비드-뉴라이트 복합체가 표적 뉴라이트와 접촉한 상태를 유지하십시오. 그런 다음, 두 번째 PDL 비드가 달린 두 번째 피펫을 첫 번째 비드에서 약 20 µm 떨어진 새로 형성된 뉴라이트 위에 내리고, 두 번째 PDL 비드를 사용하여 새로운 뉴라이트 필라멘트를 표적 세포 쪽으로 밀어 넣으십시오. 이어서 두 비드를 최소 1시간 동안 제자리에 고정하십시오.현미경을 통해 비드와 접촉하는 신경돌기가 두꺼워지는 국소 부종(focal swelling)이 없는지 확인하십시오. 이 과정 동안, 샘플의 배지를 생리식염수에서 미리 데워 이산화탄소로 평형을 맞춘 NBM으로 천천히 교체하십시오. 흡입을 해제하여 두 번째 피펫으로부터 비드를 방출하십시오.새로운 신경突起(neurite)가 계속 부착되어 있다면, 첫 번째 비드 또한 분리하십시오. 그 후, 향후 실험을 위해 뉴런 간의 연결을 강화할 수 있도록 샘플을 인큐베이터에 조심스럽게 다시 넣으십시오. 마이크로조작된 연결의 전기적 기능을 조사하기 위해 전체 세포 패치 클램프(whole cell patch clamp) 기록법을 사용할 수 있습니다.PDMS 마이크로디바이스 내에서 100 µm 간격으로 분리된 고립된 신경세포군이 여기에 표시되어 있습니다. 전체 세포 구성으로 페어 패치 클램프 기록을 수행하였으며, 기계적으로 유도된 연결을 분석하여 자연적으로 연결된 신경세포군 및 연결되지 않은 세포군과 비교하였습니다. 자연적으로 또는 마이크로조작을 통해 연결된 신경세포에서 기록된 시냅스 전 활동전위 이후의 전기적 반응은 유의미하게 더 높았으며, 시냅스 전 활동과 일시적으로 상관관계를 보였습니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 8시간 이내에 완료할 수 있으며, 본 절차를 시도할 때 빠르고 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 건강하고 패턴이 잘 형성된 장기 세포 배양물을 준비하는 것이 중요합니다. 본 절차 이후에는 다양한 방법을 통해 미세 조작된 연결의 전기적 기능성을 검증할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 미세유체 챔버에서 세포 집단을 배양하고, 피펫 조작을 통해 뉴라이트를 유도, 연장 및 연결하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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신경 과학에 대한 관심

이 비디오는 미세 유체 장치 및 미세 조작을 사용하여 뉴런의 빠른 시작 및 확장과 대상 뉴런과의 새로운 연결을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이것은 외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 신경 회로를 다시 연결하는 것을 목표로 하는 치료법에 사용될 수 있습니다.

빠른 신경관 확장 및 형성 시작기능적 신경 세포 연결

유도만능줄기세포(iPSC), 일차 피질 뉴런 및 성상세포에서 유래한 뉴런으로 구성된 공동 배양 시스템을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 공동 배양 시스템을 통해 새로운 iPSC 유래 뉴런과 채널로돕신-2를 발현하는 기존 피질 뉴런 사이의 시냅스 접촉 및 회로 형성을 감지할 수 있습니다.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

이 원고는 공간적으로 제한, 기능적으로 상호 연결된 신경 회로로 구성된 체외 모듈 형 네트워크에서 성장하는 프로토콜을 설명합니다. 마스크는 폴리머 기판 위에 배양 세포 접착을 촉진하는 단백질 패턴 층을 사용한다. 도금 뉴런 코팅 분야 자발적인 연결을 설정 및 전기 생리 활성을 나타내는에서 성장.

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이 원고는 마이크로 조직 공학 신경 네트워크의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 3 차원 크기의 마이크론 크기의 구조물은 관 모양의 하이드로 겔에 둘러싸인 집적 된 신경 세포군에 걸친 길쭉한 정렬 축색관으로 구성됩니다. 이러한 살아있는 비계는 신경 회로를 재구성하거나 조절하기위한 기능적 중계 역할을하거나 회색 - 흰색 물질 신경 조직학을 모방 한 생물 여과 테스트 베드 (bifidelic test-bed) 역할을 할 수 있습니다.

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우리 쇼케이스 경도 정렬된 astrocytic somata 소설 소재 넣음 내 프로세스의 자기 조립, 3 차원 번들의 개발. 이러한 "생활 건설 기계", 아직 테스트-베드 neurodevelopmental 메커니즘을 공부 하거나 감독 신경 마이그레이션 및 axonal neuroregeneration를 용이 하 게 하 역할 수 센티미터 길이, 확장 미크론 단위 직경을 전시 설계 길입니다.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

여기 선물이 외상 영향 관련 날짜 표시줄에 96-잘 형식에서 스트레치 상해의 모델 인간 생체 외에서 하는 방법. 이 기계적 모욕, 경작 및 셀 부상, 이미징, 및 상해 계량 높은 콘텐츠 분석 측정 stretchable 번호판 조작에 대 한 메서드가 포함 됩니다.

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신경 전구체의 생체 외 렌티 바이러스 공학에 기초하여, 야생 형 뇌로의 공동 이식및 "테스트"와 "제어"유도체의 쌍 형태 평가, 이 방법은 신피질의 생체 내 유전자 제어의 정확한 모델링을 할 수 있습니다 간단하고 저렴한 방법으로 뉴런 형태.

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이 보고에서는, 우리는 EGFP 및 관심있는 단백질과 공동 으로 transfecting에 의해 배아 쥐 피질 뉴런에 있는 neurite outgrowth를 공부하기 위한 간단한 프로토콜을 기술합니다.

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Neurite outgrowth assay는 재생 신경 세포 과정에 대한 정량적 가치를 제공합니다. 이 반자동 소프트웨어의 장점은 마스크를 생성하여 세포체와 신경돌기를 별도로 분할하고 신경돌기 길이, 분지점 수, 세포체 클러스터 면적 및 세포 클러스터 수와 같은 다양한 파라미터를 측정한다는 것입니다.

Neurite Outgrowth 측정을 위한 새로운 반자동 소프트웨어의 표준화 

배우세요 신경 돌기를 빠르게 확장하고 정밀하게 연결하는 마이크로유체 챔버 기법을 사용한 재귀 신경 회로 연구 방법입니다. 이 기술은 단일 세포 수준의 정밀한 조작과 재현성 있는 실험을 가능하게 합니다.

재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

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