재귀 신경 회로의 연구 : 빠른 신경 돌기 확장과 기능적 신경 연결을위한 새로운 방법

이 절차의 전반적인 목표는 새로운 신경돌기를 시작하고, 빠르게 확장하고, 표적 세포에 정확하게 연결하는 것입니다. 이 절차는 통제되고 재현 가능한 환경에서 성장한 세포를 사용해야만 가능합니다. 이 방법을 통해 신경 과학의 핵심 질문에 답할 수 있습니다.

뉴런의 성장 속도를 제한하는 것은 무엇입니까? 얼마나 빨리 자랄 수 있습니까? 기계적 단서가 중요한 역할을 합니까?

우리는 또한 시냅스가 어떻게 형성되는지, 뉴런이 어떻게 표적 세포를 찾는지를 연구할 수 있습니다. 시냅스는 어떻게 노화하고 성숙합니까? 셋째, 우리는 체계적인 신경망을 구축하고 뉴런이 어떻게 계산되는지 연구할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 손쉬운 조작, 실험적 재현성 및 궁극적으로 단일 세포 수준에서 높은 수준의 제어가 가능하다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 원하는 수의 멸균 커버 슬립을 청소하고 준비하십시오. 다음으로, 실온에서 최소 2시간 동안 각 커버 슬립을 0.5-1밀리리터의 100마이크로그램 PDL로 코팅합니다.

그런 다음 커버 슬립을 물로 두 번 씻고 모든 액체를 제거하십시오. 멸균 환경에서 5-10분 동안 또는 표면이 완전히 마를 때까지 건조시킵니다. 그런 다음 패턴이 UV 광선 아래를 향하도록 미세유체 장치를 생물 안전 캐비닛에 10분 동안 놓습니다.

10분 후, 패턴이 아래를 향하도록 미세유체 장치를 깨끗한 커버 슬립과 접촉하도록 놓습니다. 핀셋을 사용하여 장치를 부드럽게 눌러 유리에 부착되도록 합니다. 단일 집단 장치를 배지로 채우려면 50마이크로리터의 완전한 세포 배지를 오른쪽 상단 웰에 추가합니다.

그런 다음 또 다른 50마이크로리터의 완전한 세포 배지를 웰 대각선에 추가합니다. 다중 집단 장치를 매체로 채우려면 한 줄의 웰에 30마이크로리터의 완전한 NBM을 추가합니다. 매체가 우물 사이로 흐르는지 확인하십시오.

그런 다음 나머지 웰 각각에 50마이크로리터의 배지를 추가합니다. 고압 멸균 물이 담긴 열린 접시와 함께 더 큰 접시에 장치를 놓고 세포 배양을 준비하는 동안 접시를 1-2시간 동안 인큐베이터에 넣습니다. 이제, 우물을 비우지 않고 미세유체 장치의 상부 우물에서 매체를 제거하십시오.

그런 다음 20마이크로리터의 농축 세포 용액을 미세유체 장치의 오른쪽 상단 웰에 추가하고 현미경에서 단일 집단 미세유체 장치 내부에서 세포가 어떻게 흐르는지 확인합니다. 다중 집단 장치에서 세포를 플레이트화하려면 농축 세포 용액 20마이크로리터를 각 상단 웰에 추가합니다. 현미경으로 세포가 챔버 내부에 있는지 확인하십시오.

그 후, 장치를 인큐베이터에 15-30분 동안 넣어 기질에 세포가 부착되도록 합니다. 세포가 기질에 부착된 후 단일 집단 장치의 두 개의 상단 웰에 40마이크로리터의 NBM을 추가합니다. 이렇게 하면 마이크로 채널에서 기포를 제거하는 데 도움이 됩니다.

20마이크로리터의 MBM을 세포가 주입된 것과 동일한 웰인 다중 집단 장치의 상단 웰에 추가합니다. 배지는 양성 반월판을 형성하기 위해 약간 돌출되어야 하며 우물에 머핀 상단 측면을 제공해야 합니다. 미세유체 장치를 제거하기 1-2일 전에 각 샘플 접시에 예열된 NBM 2밀리리터를 추가하고 챔버를 가득 채웁니다.

그런 다음 장치를 인큐베이터에 보관하십시오. 그런 다음 멸균 핀셋과 피펫 팁을 사용하여 커버 슬립에서 미세 유체 장치를 제거하여 패턴화된 뉴런 구성을 남깁니다. 이 절차에서, 40 내지 60 μl의 준비된 PDL 코팅 비드를 세포 배양액에 넣는다.

그런 다음 시냅스 접촉의 형성을 촉진하기 위해 샘플을 1시간 동안 인큐베이터에 반환합니다. 그런 다음, 두 개의 마이크로피펫으로 위에서 세포를 평가하고 광학적으로도 액세스할 수 있도록 실험 설정에 샘플을 설치합니다. 이 구성에서 CCD 카메라는 이미지 캡처를 위해 현미경의 측면 포트에 있습니다.

식염수가 채워진 각 피펫을 1mL 주사기에 연결한 다음 생리학적 식염수로 샘플을 관류합니다. 다음으로, 현미경으로 두 개의 고립된 뉴런 집단 사이의 간격을 확인하여 두 집단이 자연적으로 연결되어 있지 않은지 확인합니다. 시야에서 뉴런에 부착되지 않은 PDL 비드를 선택합니다.

비드에 초점을 맞춘 다음 마이크로피펫에 초점을 맞춰 비드를 마이크로피펫 팁에 맞춥니다. 그런 다음 현미경을 통해 모니터링하여 팁을 비드에 최대한 가깝게 가져옵니다. 그런 다음 피펫에 음압을 가하여 비드를 집어 올리고 실험 내내 음압을 유지합니다.

이제 시야의 뉴런에 부착된 PDL 비드를 선택하고 흡입을 사용하여 두 번째 마이크로피펫에 부착합니다. micromanipulator 또는 sample stage를 1μm당 0.5μm의 속도로 천천히 움직여 PDL bead neuron complex를 당기고, 신경돌기가 시작될 수 있도록 5분 동안 멈춥니다. PDL 비드 뉴런 복합체를 2마이크로미터에 걸쳐 분당 0.5마이크로미터의 속도로 천천히 측면으로 움직여 당긴 다음 신경돌기가 늘어날 수 있도록 5분 동안 멈춥니다.

처음 5마이크로미터에 대한 성공적인 시작 및 신경돌기 확장 후 분당 20마이크로미터의 속도로 신경돌기를 계속 당깁니다. 뉴런을 연결하려면 신경돌기가 풍부한 영역을 선택하십시오. 다른 비드를 사용하여 커버 슬립 위의 피펫 팁 높이를 측정하고 PDL 비드 신경돌기 복합체를 내려 신경돌기에 물리적으로 접촉하도록 합니다.

PDL bead neurite complex가 두 번째 micropipette를 조작하는 동안 target neurorite와 접촉하도록 둡니다. 그런 다음 첫 번째 비드에서 약 20마이크로미터 떨어진 새로 형성된 신경돌기 위에 두 번째 PDL 비드가 있는 두 번째 피펫을 내리고 두 번째 PDL 비드를 사용하여 새 신경돌기 필라멘트를 타겟 세포 쪽으로 밀어 넣습니다. 다음으로, 두 구슬을 최소 1시간 동안 제자리에 고정합니다.

현미경으로 국소 팽창, 비드와 접촉하는 신경돌기가 두꺼워지는 것을 확인합니다. 이 시간 동안 샘플의 매체를 생리식염수에서 예열된 이산화탄소 평형 NBM으로 천천히 변경합니다. 흡입을 해제하여 두 번째 피펫에서 비드를 분리합니다.

새 신경돌기가 부착된 상태로 남아 있으면 첫 번째 비드도 해제합니다. 그런 다음 샘플을 조심스럽게 인큐베이터에 다시 넣어 향후 실험을 위해 신경 연결을 강화합니다. 전체 셀 패치 클램프 기록을 사용하여 미세 조작된 연결의 전기적 기능을 조사할 수 있습니다.

여기에 표시된 것은 PDMS 마이크로 장치에서 100마이크로미터 간격으로 분리된 고립된 신경 세포 집단입니다. 전체 세포 구성에서 쌍 대 패치 클램프 기록을 수행하고, 기계적으로 유도된 연결을 분석하고, 자연적으로 연결된 뉴런 집단 및 연결되지 않은 집단의 연결과 비교했습니다. 자연적으로 그리고 미세 조작에 의해 연결된 뉴런에서 기록된 시냅스 전 활동 전위 이후의 전기 반응은 상당히 높으며 일시적으로 시냅스 전 활동과 상관관계가 있습니다.

이 기술을 숙달하면 적절하게 수행할 경우 8시간 내에 수행할 수 있으며, 이 절차를 시도하는 동안 빠르고 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 건강하고 패턴이 잘 잡힌 장기 세포 배양을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 다양한 방법을 사용하여 미세 조작 연결의 전기적 기능을 확인할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미세유체 챔버에서 세포 집단을 성장시키고 피펫 조작을 사용하여 신경돌기를 시작, 확장 및 연결하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.