형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

이 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 유전적으로 암호화된 pH 지시약을 사용하여 세포 내 pH의 정량화를 설명하고 이 방법을 사용하여 곤충 신장 구조 모델인 말피기세뇨관에서 기저측 양성자 수송을 평가하는 방법을 보여주는 것입니다. 이 방법은 특정 수송 단백질이 세포 내 pH 조절에서 상피 양성자 이동에 어떻게 기여하는지와 같은 세포 수송 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 상피의 여러 기능적으로 구별되는 영역에서 세포 수송을 빠르고 쉽게 평가할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 pH 조절 및 곤충 상피에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 배양 중인 포유류 네프론 및 상피 세포와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면 두 세트의 납땜 도움 손 cl을 배치합니다.amps 이미징 현미경 스테이지, 양쪽에 하나의 클램프가 있습니다. 다음으로, 각각의 구부러진 유리 모세관과 유입 라인, 진공 연결 유출 라인을 삽입합니다.

그런 다음 도움의 손길에 장착하고 현미경의 이미징 단계에 맞춥니다. 천장 테이프에 진공 그리스를 바르고 접착 우물 분배기를 테이프에 눌러 바닥을 그리스로 코팅합니다. 접착제 관류 웰 디바이더를 벗겨내고 폴리 l 라이신 코팅 슬라이드 위에 그리스 면이 아래로 향하게 놓습니다.

그런 다음 관류 웰 디바이더를 제거하여 소수성 그리스로 추적된 개별 특정 웰을 남겨 둡니다. 그 후, 200마이크로리터의 실온 IPBS 또는 곤충 인산염 완충액 식염수를 기름칠한 곳에 놓고 폴리 l 라이신 코팅 슬라이드에 잘 동그라미를 그립니다. 그런 다음 슬라이드를 스테로스코프 아래에 놓고 얼음처럼 차가운 슈나이더 배지를 해부 접시에 붓고 마취된 암컷 파리 한 마리를 그 접시로 옮깁니다.

집게로 파리의 흉부를 잡고 다른 집게를 사용하여 후복부를 부드럽게 잡습니다. 짧고 의도적인 동작으로 파리의 뒤쪽 끝을 당겨 엽니다. 뒷다리 보호대가 보이면 말단부를 잡고 반복적인 짧은 잡아당김을 통해 뒷다리 보호대를 몸에서 멀리 당겨 장과 앞다리를 밑에 있는 기관에서 빼냅니다.

그런 다음 두 번째 앞골짜기가 복부에서 자유로워지면 가는 집게로 요관의 앞쪽 앞부분을 꼬집습니다. 세뇨관이 양쪽으로 떨어지도록 요관 아래로 막대를 밀어 장대 유리 막대로 자유로운 앞쪽을 집습니다. 그런 다음 용액에서 앤티를 똑바로 들어 올린 다음 앤티와 요관이 막대의 아래쪽에 부착되도록 유리 막대를 돌립니다.

요관을 슬라이드 위로 똑바로 내린 다음 요관을 부착하고 요관을 유리 슬라이드에 더 눌러 요관의 말단부를 밀봉합니다. 유리 막대의 가는 끝을 사용하여 슬라이드 표면을 가로질러 각 세뇨관을 부드럽게 쓸어냅니다. 세뇨관이 부서지지 않도록 슬라이드에 막대를 문지르고 원위에서 근위로 이동하여 세뇨관 상단 위로 막대를 밀어 각 세뇨관의 전체 길이를 폴리 l 라이신 코팅 슬라이드의 표면에 부착합니다.

이 기술의 성공 여부는 전적으로 전방세뇨관(anterior malpighian tubules)의 정확한 식별과 신중한 취급에 달려 있습니다. 손상된 세뇨관은 일관되지 않은 결과를 생성합니다. 다음으로, 접착 풍성 웰 디바이더를 슬라이드에 다시 놓아 장착된 세뇨관 위에 잘 채워진 작은 액체를 형성합니다.

그런 다음 표본을 현미경 스테이지에 놓습니다. 유입 및 유출 모세관을 각각 풍요로운 우물의 입구 및 출구 개구부 위에 배치합니다. 이 절차에서 현미경, 광원 및 이미징 시스템을 켠 다음 이미징 소프트웨어를 엽니다.

접안렌즈를 통해 보고 투과된 빛 아래에서 앤티의 내강이 명확하게 보일 때까지 초점을 수동으로 조정합니다. 그런 다음 Acquisition 탭을 클릭하고 Acquisition Load 섹션에서 Dimming 풀다운 메뉴에서 2x2를 선택합니다. 광 경로에 5% 중성 밀도 필터를 삽입하여 조명광을 줄이고 광표백을 최소화합니다.

채널 메뉴에서 GFP 채널을 클릭한 다음 라이브를 클릭하여 카메라를 통해 형광 신호를 관찰합니다. 그런 다음 시간 슬라이더를 조정하여 노출 시간을 설정하여 강도 히스토그램에서 가장 밝은 픽셀 값이 최대값의 약 40%가 되도록 합니다. 그런 다음 중지를 클릭하여 조명을 중지합니다.

RFP 채널에서 절차를 반복하고 전방의 확장된 초기 분절의 존재와 조직 손상 또는 과발현을 나타내는 세포고형 m 체리 응집체의 부재를 확인합니다. 그런 다음 시계열 확인란을 클릭하여 타임랩스 이미징 프로토콜을 활성화합니다. 풀다운 메뉴의 시계열 섹션에서 지속 시간을 10분으로 조정하고 간격 슬라이더를 0으로 조정하여 최대 이미지 획득으로 총 캡처 시간을 설정합니다.

그런 다음 채널 섹션에서 GFP 및 RFP 상자를 모두 선택합니다. 적절한 밸브 컨트롤러를 활성화하여 풍성 시스템의 IPBS 라인을 열고 실험 시작을 클릭하여 이미징 프로토콜을 시작합니다. 1분 후 해당 밸브를 열고 IPBS 라인을 닫아 20초 동안 염화암모늄 포스트 용액으로 전환합니다.

그런 다음 염화암모늄 라인을 닫고 IPBS 밸브를 다시 열어 IPBS로 돌아갑니다. 2점 보정을 수행하려면 기본 슬라이드에서 웰 분배기를 벗겨내어 제거하고 이미징 웰에서 클램프의 풍부한 모세관을 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 교정 IPBS 버퍼를 pH 7.4에 적용합니다.

그런 다음 이미징 웰에서 용액을 제거하고 다른 200마이크로리터의 보정 용액으로 교체합니다. 이 과정을 4번 반복하여 완전한 용액 교환을 보장합니다. 다음으로, 이미징 전에 30분 동안 준비 및 보정 용액을 배양합니다.

이전에 결정된 것과 동일한 매개변수를 사용하여 이미징 프로토콜을 반복하고 1분 분량의 이미지 캡처만 수정합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 교정 IPBS 버퍼를 pH 9에 추가합니다. 이미징 웰에서 용액을 제거하고 다른 200마이크로리터의 보정 용액으로 교체합니다.

그 후, 이미징 전 10분 동안 두 번째 보정 용액에서 제제를 배양하고 이미징 프로토콜을 반복합니다. 그런 다음 프레임 슬라이더로 이미지 스택을 스크롤하면서 MeanROI를 클릭하여 두 채널의 픽셀이 포화되지 않았는지, 그리고 강도 히스토그램에 보고된 값이 감지 가능한 최대값에 도달하지 않았는지 확인합니다. 다음으로, 형광 강도를 플로팅하여 이미지 스택을 분석하고 형광 비율은 시간의 함수이며, 여기에서 지표의 pH 민감 및 pH 민감성 채널에서 염화암모늄 펄스에 대한 예상 형광 반응을 볼 수 있습니다.

이러한 신호의 비율은 세포 내 pH 과도 현상을 나타냅니다. 이 분석을 수행하려면 먼저 평균 ROI를 클릭하고 자유 형식 도구를 선택합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 50마이크로미터 MT를 추적하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 ROI 그리기를 마칩니다.

그런 다음 MT에 인접한 영역에서 이를 반복하여 배경 ROI를 정의합니다. 그런 다음 measurements(측정)에서 mean intensity(평균 강도)를 클릭하고 export(내보내기), data table(데이터 테이블), create(생성)를 클릭하여 강도 값 테이블을 만듭니다. 구성 클럭 휠 아이콘을 클릭하고 시간 및 평균 강도를 제외한 모든 매개변수를 선택 취소합니다.

새로 생성된 데이터 테이블의 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, 다른 이름으로 저장을 선택하고, 데이터를 csv 파일로 내보냅니다. 여기에 표시된 것은 광시야 이미지, 전방의 원리 세포와 전방의 성상 세포에서 초타원형 불소 형광입니다. 성상 세포는 초기 분절에서 막대 모양이고, 전이 분절에서 가변적이며, 주 분절에서 뚜렷한 세포 돌기를 나타냅니다.

이 그래프는 관심 영역에서 20초, 40밀리몰 염화암모늄 펄스에 대한 반응으로 보정된 세포 간 pH 변화를 보여줍니다. 점선 곡선은 염화암모늄 회수 후 산 회수 단계에 적용되는 단일 지수 적합을 나타냅니다. 이로부터 감쇠된 상수 값이 파생됩니다.

이 그래프는 세포 내 pH의 함수로 표시된 산 압출 속도를 보여주며, 이 그래프는 이전 그림의 지수 적합치에서 파생된 세포 내 pH의 함수로 표시된 산 플럭스를 보여줍니다. 일단 숙달되면, malpighian tubule extraction은 적절하게 수행된다면 10분 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 성공 여부는 전적으로 박리 품질과 pH 지시약의 정확한 교정에 달려 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 제제는 형광 칼슘 및 할로겐화물 지표와 같은 유전적으로 인코딩된 다른 바이오센서와 결합하여 상피 세포의 용질 이동 및 세포 내 신호 전달을 연구할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 건강한 초파리 말피기세뇨관을 준비하고, 유전적으로 암호화된 pH 지시약을 이미지화하고, 상피 세포의 양성자 움직임을 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 니트로izene으로 작업하는 것은 위험하고 손상이 있을 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 재사용할 장비를 오염시키지 않도록 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.