Name: 형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 말관상피에서 형광 유전자 인코딩 pH 지시자 pHerry를 이용한 세포내 pH 광학 정량화 방법입니다. 이 기술은 상피 세포의 양성자 수송을 실시간으로 평가할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH DK092408에 의해 지원 되었다 그리고 MFR. AJR에 DK100227 T32-DK007013에 의해 지원 되었다. 저자 CapaR GAL4와 c724 GAL4 박사 줄리안 A.T. 다우 감사 하고자 초파리 주식. 우리는 또한 실험적인 비행 십자가 유지 하는 지원에 대 한 야 곱 B. 앤더슨을 감사 합니다.

저자는 공개 없다.

Drosophila MTs에 pH나 의 정량화의 성공을 전적으로 추출 된 MTs와 장착 및 해 부그림 A - ( C)의 품질의 상태에 따라 달라 집니다. 따라서, 조직으로의 주의 깊은 취급 설명은 필수적입니다. PLL에 갓 코팅 슬라이드 실질적으로 솔루션 이전 노출 슬라이드 원조 마운트 장착 그들 보다 훨씬 더 많은 접착제 경향이. 주의 설치 또한 뚜렷한 산 세그먼트 (그림 D)의 식별에 도움이 됩니다. 건강 한 MTs mCherry 집계 산 돌출의 훨씬 더 일관성 있는 정량화를 각각 저조한 여 pHerry 및 기능 평가의 캘리브레이션을 촉진 한다. 경우에 따라 mCherry 집계 피하 불가능 실험 조건 수 있습니다 본질적으로 MT epithelia 손상 또는 중요 한 오버 표현의 형광 기자를 생산 합니다. 이러한 경우에 의사 비율 교정 정규화는 pH나...

이 프로토콜의 목표는 정량화의 세포내 pH (pHi)는 유전자 인코딩 pH-표시기 (GEpHI)를 사용 하 여 설명 하 고 어떻게 모델 곤충 (디의에서 basolateral H+ 교통을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다 설명 melanogaster) 신장 구조, 말 관 (MT). MTs 과일 파리의 배설 기관으로 봉사 하 고 몇 가지 주요 측면1포유류 nephron 기능적으로 비슷합니다. MTs는 흉부와 복 부의 tubules (앞쪽에 및 사후)의 2 쌍으로 정렬 됩니다. 각 산의 단일 셀 상피 튜브 metabolically 활성 주 셀의 독특한 꼭대기 구성 (luminal)과 basolateral (hemocoel) 극성으로 삽입된 방사상 세포. 형태학 상으로, 기능적으로, 앞쪽 MTs 3의 구성 그리고 발달 별개 세그먼트, 특히 초기 크기 세그먼트, 전환 세그먼트, 및2ureter 조인 분 비 주요 세그먼트. 셀룰러 규모 루멘으로 트랜스 상피 이온 수송 basolateral 나+-K+뿐만 아니라 꼭대기 원형질 막 V ATPase3 와 알칼리-금속/H+ 교환기에 의해 수행 됩니다-ATPase4, 내부 정류기 K+ 채널5, 나+-구동 Cl−/HCO3− 교환기 (NDAE1)6및 Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, 방사상 세포 중재 Cl- 물8,9전송 하는 동안. 이 복잡 하지만 액세스할 수 physiologic 시스템 초파리의 유전 및 행동 다양 한 도구와 함께 내 생 이온 전송 메커니즘의 조사를 위한 우수한 기회를 제공 합니다.
이 프로토콜에 대 한 근거는 행동과 다른 모델 시스템 도구의 수출을 셀에서 통합에 대 한 잠재력을 가진 상피 이온 수송을 공부에 대 한 유전자가 단 시스템을 설명 했다. PHerry10의 표현, 녹색 pH에 민감한 슈퍼 황도 pHluorin11,12 (SEpH) 및 빨간색 pH을 구분 하지 않는 mCherry13, MTs의 융합에서 파생 된 GEpHI 허용에 H+ 전송의 정량화 높은 K+/nigericin 교정 기술14를 통해 단일 산 세포. 마찬가지로 많은 이온 운송업 자 H+ 해당 이동, 세포내 pH나 의 정량화 전송기의 다양 한 통해 이온 이동의 기능적 표현으로 제공 합니다. 또한 조직의 특정 transgene15 에 RNA 간섭 (RNAi)16 식 세포 이미징 및 전체-기관 분석17 와 결합 될 수 있는 강력한 유전자 도구를 제공 하는 초파리 MT 모델 시스템 , 18 , 19 관 기능 동작에 분자에서 수직 통합 된 강력한 도구 집합을 만들 수의. 이 스탠드 반면 다른 많은 프로토콜으로 역사적으로 그러한 측정 의존 해야 복잡 한 상피 생물학을 평가 하 고 마이크로 해 부, 정교한 이온 선택적인 전극20,21, 발굴 그리고 비싼 pH에 민감한 염료22 제한적인 로드 요구와 다른 유형의 조직에 가난한 세포 특이성. GEpHIs는 광범위 하 게 pH나 다양 한 세포 유형23을 측정 하기 위해 사용 되어 왔습니다. 초기 작품 고유의 pH 감도의 녹색 형광 단백질 (GFP) pH나 배양된 상피 세포24 을 모니터링 하는 데 악용 하지만 지난 2 년간 본 균27 뉴런25명과26, 사용 GEpHIs , 그리고 식물 세포28. 세포질 GAL4/UAS 식 시스템15 와 초파리 MT의 생리 적인 접근을 통해 유전 구성의 대상에 대 한 잠재력의 조합을이 pH의 조사에 대 한 이상적인 준비 하 게 나 레 귤 레이 션 및 상피 이온 수송.
pH나 규제 수십 년 동안 공부 되었습니다 하 고 생활에 필수적 이다. MT 준비는 강력한 모델 pH나 규제의 생리학을가 르 치지만 또한 수행을 정교한의 pH나 레 귤 레이 션 ex vivo에서 비보조사를 제공 합니다. 이 프로토콜 초파리 NH4Cl 펄스 산 기술21, 로드를 사용 하 여 산의 상피 세포의 basolateral 막에 걸쳐 H+ 움직임의 정량화를 설명 하지만 pH 지시자로 유전자 인코딩, 의무가 transgenesis 및 라이브 이미징 모든 준비를 이러한 메서드 및 그들의 이론적인 틀을 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL) 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>Store at 4 &deg; C는 재사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>니제리신 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>N7143</td><td>주의: 장갑을 끼고 다루십시오. 20mM 원액의 부분 표본으로 DMSO에서 4°C로 저장합니다.</td></tr><tr><td>접착제 관류 챔버 커버, 접착제 크기 1mm, 챔버 직경 &times; 두께 9mm &times; 0.9mm, 포트 직경 1.5mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL622105</td><td>관류 시스템과 일치하도록 필요에 따라 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Ellsworth 접착제</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Helping Hands 납땜 스탠드</td><td>Harbour Freight Tools</td><td>60501</td><td>여러 공급업체에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>밸브 컨트롤러, 8 대 1 매니폴드 및 Reserviors</td><td>Bioscience Tools</td><td>PS-8S</td>가 있는 개방형 중력 공급 관류 시스템 유사한 <td>모든 관류 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>유량 조절기</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0221</td><td>관류 시스템과 일치하도록 필요에 따라 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>슈나이더의 미디엄</td><td>피셔 과학</td><td>21720024</td><td>매장 4 &deg; C는 멸균 부분 표본에서 사용됩니다.</td></tr><tr><td>#5 Inox Steel Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>실험자의 편안함에 따라 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>35 x 10mm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Corning Life Sciences</td><td>Fisher Scientific 08-757-100A</td><td>정확한 브랜드와 크기는 중요하지 않습니다.</td></tr><tr><td>75 x 25mm 현미경 슬라이드</td><td>Corning Life Sciences</td><td>2949-75X25</td><td>관류 웰이 호환되는 한 정확한 브랜드와 크기는 달라질 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, 두께 0.32 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0796</td><td>Filiment가 필요하지 않으며 관류 튜브 및 관류 웰과 일치하도록 유리를 대체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", 두께 1/32"</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-171-129</td><td>여러 공급업체에서 구할 수 있으며 관류 시스템과 일치하도록 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>진공 실리콘 그리스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 흐름 제어 클램프</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-869</td><td>여러 공급업체에서 사용 가능, 멸균 필요 없음</td></tr><tr><td>유리 막대, 5mm 직경</td><td>delphiglass.com</td><td>9198</td><td>정확한 크기는 개인 취향, 여러 공급업체 사용 가능</td></tr><tr><td>PAP 소수성 펜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td>여러 공급업체에서 사용 가능.</td></tr><tr><td>씰링 필름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>15mL 팔콘 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352096</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>50mL 팔콘 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352070</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>HEPES; 4- (2- 하이드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄 술폰산</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>H3375</td><td>여러 공급 업체에서 구할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>도청; N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판술폰산</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5130</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>10X/0.45 에어 대물렌즈</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-139</td><td>유사한 대물렌즈로 대체할 수 있습니다.40X 대물렌즈는 단일 세포 이미징에 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>입체경 해부</td><td>Zeiss</td><td>Discovery.V8</td><td>모든 입체경을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>UAS-pHerry 형질전환 Drosophila melagnogaster</td><td>Available from Romero Lab</td><td></td><td>최초 발행: Citation 10</td></tr><tr><td>capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td>Available from <td>Romero Lab</td><td></td><td>최초 발행: Citation 32</td></tr><tr><td>c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster</td><td>Available from Romero Lab</td><td></td><td>최초 발행: Citation 2</td></tr><tr><td>단색 고감도 디지털 카메라</td><td>Zeiss</td><td>Axiocam 506 모노</td><td>정확한 브랜드 및 모델은 다를 수 있으며 라이브 세포 이미징에 적합한 단색 고감도 카메라로 교체 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>GFP/FITC 필터 세트, 470/40nm ex., 515nm longpass em., 500nm dichroic</td><td>Chroma</td><td>CZ909</td><td>모든 GFP/FITC 필터 세트로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>RFP/TRITC 필터 세트, 546/10nm 예, 590nm 장역 통과 em., 565nm 이색</td>성 <td>Chroma</td><td>CZ915</td><td>모든 GFP/FITC 필터 세트로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>도립 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer Z.1</td><td>전동 필터 스위칭 기능이 있는 유사한 현미경을 사용할 수 있습니다. 정립 현미경은 개방형 관류 수조 및 침수 대물렌즈와 함께 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>Microcal</td><td>Origin 6.0</td><td>유사한 기능을 가진 모든 소프트웨어로 대체 가능</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.50i</td><td>유사한 기능을 가진 모든 소프트웨어로 대체 가능</td></tr><tr><td>이미지 수집 소프트웨어</td><td>Zeiss</td><td>Zen 1.1.2.0</td><td>유사한 기능을 가진 모든 소프트웨어로 대체 가능</td></tr><tr><td>Single-edged Carbon Steel Razor Blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71960</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 폴더</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-04</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-110-1231</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>폴리스트렌 초파리 사육 바이알 with Flugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-109BF</td><td>비교 가능한 품목으로 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>2.5L 실험실용 얼음 양동이</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>엔엠디지; N-메틸-D-글루카민</td><td>시그마-알드리치</td><td>M2004</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>200 uL 배리어 피펫 팁</td><td>MidSci</td><td>AV200</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>200 &#956; L 가변 용량 피펫</td><td>Gilson Incorporated</td><td>PIPETMAN P200</td><td>여러 공급업체에서 구입할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 epithelia에 광학 정량화의 세포내 ph

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

상피 이온 수송 체계 이온 항상성 뿐만 아니라 필수적인 세포 전기 화학 기온 변화도의 유지 보수에 필수적입니다. 세포내 pH (pH나)은 많은 이온 운송업 자에 의해 영향을 하 고 따라서 pH나 모니터링은 운송업 자 활동을 평가 하기 위한 유용한 도구. 현대 유전자 인코딩 pH-지표 (GEpHIs) 세포 및 subcellular 규모 pH나 그대로 셀에의 부 광 량을 제공합니다. 이 프로토콜 설명 세포질 pH나 규제의 초파리 melanogaster 의 말 Tubules (MTs)에서 ex vivo 라이브 이미징 통해 pHerry, pK의사 비율 GEpHI의 실시간 정량화를 는 cytosol에서 pH 변화 추적에 적합. 추출 된 성인 비행 MTs 단일 셀 레이어 epithelia의 형태학 상으로 그리고 기능상 다른 섹션으로 구성 되며 상피 전송의 조사를 위해 접근 가능 하 고 유전자 세공 모델으로 사용할 수 있습니다. GEpHIs 기존 pH에 민감한 형광 염료와 이온 선택적 전극 위에 여러 가지 이점을 제공합니다. 적절 한 모터 요소 사용할 수 있습니다 제공 GEpHIs 뚜렷한 세포 인구 레이블을 수 있습니다. 이 라벨은 전 비보 vivo에서, 그리고 제자리에 , 준비는 본질적으로 다른 유형의에 특히 유용 합니다. GEpHIs 또한 반복된 염료 치료 또는 조직의 외부화에 대 한 필요 없이 시간이 지남에 그대로 조직에 pHi 의 정량화를 허용합니다. 현재 GEpHIs의 주요 단점은 경향을 cytosolic 포함 조직 손상에 대 한 응답에서에서 집계-표현식을 구성 합니다. 이러한 단점, 그들의 솔루션 및 GEpHIs의 고유의 장점은 추출 된 MTs의 기능적으로 명료한 원금과 방사상 세포의 basolateral 양성자 (H+) 교통의 평가 통해이 프로토콜에서 설명 했다. 기술과 분석 설명 다양 한 척추 동물 및 무척 추 동물 준비에 쉽게 적응할 수 있다, 분석 결과의 세련 특정 전송기를 통해 이온 플럭스의 복잡 한 결정을 연구소 교육에서 조절 될 수 있습니다.

건강 한 조직 및 앞쪽 MTs의 적절 한 식별이이 프로토콜의 성공에 생명 이다. 해 부, 동안 주의 해야 직접 터치 하는 MTs와만 핸들을 그들은 MTs를 직접 잡지로 ureter 파손 (그림 4A- B)로 이어질 것입니다. MTs는 플랫 슬라이드에 휩 쓸, tubules는 가능한 조금만 진 해야 합니다 고이 피할 초과 모션 단일 셀 상피 층 (그림 4C)를 손상 할 것 이다. 제대로 해 부 앞쪽 MTs 상피 세포의 형태학 상으로 다른 관 세그먼트 cytosol 통해 빨간색과 녹색 형광의 동등한 배급을 보여줄 것 이다. Tubules 부적절 한 관류에 의해 손상 되 고 또는 빨간색 형광 아무 짝 녹색 집계의 집계 표시 됩니다 실패 잘못 식별된 후부 MTs 원심 ureter (<strong class="x...

세포 이온 수송 종종 세포내 pH를 모니터링 하 여 평가 될 수 있다 (pH나). 유전자 Encoded pH-지표 (GEpHIs) 그대로 셀에 세포내 pH의 부 광 량을 제공합니다. 이 프로토콜 내용을 통해 셀룰러 ex vivo 라이브 이미징 pHerry와 초파리 melanogaster 의 말 tubules의 세포내 pH의 정량화, 의사 비율 유전자 인코딩 pH 지시자.

형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

본 이미징 프로토콜의 전반적인 목적은 유전적으로 인코딩된 pH 지표를 사용하여 세포 내 pH 정량화 방법을 설명하고, 이 방법이 곤충의 신장 구조 모델인 말피기관(malpighian tubule)에서 기저측 양성자 수송을 평가하는 데 어떻게 활용될 수 있는지 입증하는 것입니다. 이 방법은 특정 수송 단백질이 세포 내 pH 조절 과정에서 상피 양성자 이동에 어떻게 기여하는지와 같은 세포 수송 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 상피의 기능적으로 구분되는 여러 구역에 걸쳐 세포 수송을 빠르고 쉽게 평가할 수 있다는 점입니다.이 방법은 pH 조절과 곤충 상피에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 포유류의 신단위(nephron) 및 배양된 상피 세포와 같은 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 이미지 분석 현미경 스테이지의 양쪽에 하나씩 두 세트의 납땜 보조 고정 클램프를 배치하십시오. 다음으로, 각각의 구부러진 유리 모세관과 유입 라인, 그리고 진공 장치가 연결된 유출 라인을 삽입하십시오.그런 다음, 이를 헬핑 핸드(helping hands)에 고정하고 현미경의 이미징 스테이지에 맞춥니다. 실링 테이프에 진공 그리스를 바르고 접착성 관류 웰 디바이더를 테이프 위에 눌러 바닥면에 그리스가 도포되도록 합니다. 접착성 관류 웰 디바이더를 떼어내어 그리스가 묻은 면이 아래로 향하게 하여 poly l lysine 코팅 슬라이드 위에 놓습니다.그 후, 관류 웰 디바이더를 제거하여 소수성 그리스로 표시된 개별 특정 웰만 남깁니다. 그런 다음, poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드의 그리스가 칠해진 원형 웰에 상온의 IPBS 또는 곤충 인산염 완충 식염수 200 µL를 넣습니다. 이어서 슬라이드를 스테레오 현미경 아래에 두고, 해부 접시에 얼음처럼 차가운 Schneider's medium을 부은 후 마취된 암컷 초파리 한 마리를 그곳으로 옮깁니다.포셉 한 쌍으로 초파리의 흉부를 잡고, 다른 포셉을 사용하여 후복부를 조심스럽게 잡습니다. 짧고 신중한 동작으로 초파리의 후단부를 당겨 엽니다. 후직장(hind gut)이 보이면 원위단을 잡고, 후직장을 몸체에서 반복적으로 짧게 당겨 하부의 기관(tracheales)으로부터 장과 전직장을 분리합니다.그 다음, 두 번째 세트의 전단부(antes)가 복강에서 완전히 분리되면, 미세 핀셋으로 요관의 앞쪽 전단부를 집어 끊어냅니다. 유리 막대를 요관 아래로 밀어 넣어 세관들이 양옆으로 떨어지도록 하여, 분리된 앞쪽 전단부를 유리 막대로 집어 올립니다. 이어서 전단부를 용액 밖으로 곧게 들어 올린 후, 유리 막대를 회전시켜 전단부와 요관이 막대 밑면에 부착되도록 합니다.요관을 슬라이드 위로 곧게 내려놓은 다음, 요관을 더 강하게 눌러 고정하고 전단부의 말단부를 밀봉합니다. 유리봉의 가는 끝부분을 사용하여 각 세뇨관을 슬라이드 표면을 따라 부드럽게 훑어줍니다. 세뇨관이 으깨지지 않도록 유리봉을 슬라이드에 가깝게 밀착시킨 상태에서, 원위부에서 근위부 방향으로 세뇨관 윗부분을 따라 밀어내어 poly l lysine 코팅 슬라이드 표면에 각 세뇨관의 전체 길이가 부착되도록 합니다.이 기술의 성공 여부는 전방 말피기관(anterior malpighian tubules)의 정확한 식별과 신중한 취급에 전적으로 달려 있습니다. 손상된 기관은 일관성 없는 결과를 초래합니다. 다음으로, 접착성 프로퓨전 웰 디바이더(adhesive profusion well divider)를 슬라이드 위에 다시 배치하여 고정된 기관 위에 액체로 채워진 작은 웰을 형성합니다.그 후, 검체를 현미경 스테이지 위에 놓습니다. 유입 및 유출 모세관을 각각 관류 웰의 입구와 출구 개구부 위에 위치시킵니다. 이 과정에서 현미경, 광원 및 이미징 시스템의 전원을 켜고, 이미징 소프트웨어를 실행합니다.접안렌즈를 통해 보면서 투과광 아래에서 안테스의 루멘(lumen)이 명확하게 보일 때까지 초점을 수동으로 조절하십시오. 그런 다음, 획득(acquisition) 탭을 클릭하고 획득 로드 섹션의 디밍(dimming) 드롭다운 메뉴에서 2x2를 선택하십시오. 조명 광량을 줄이고 광퇴색(photo-bleaching)을 최소화하기 위해 광로에 5% 중성 밀도 필터를 삽입하십시오.채널 메뉴에서 GFP 채널을 클릭한 다음, live를 클릭하여 카메라를 통해 형광 신호를 관찰하십시오. 그 후, 강도 히스토그램에서 가장 밝은 픽셀 값이 최대값의 약 40%가 되도록 시간 슬라이더를 조정하여 노출 시간을 설정하십시오. 그런 다음 stop을 클릭하여 조명을 끕니다.RFP 채널에서 동일한 절차를 반복하여 전측 안테나(anterior ante)의 확장된 초기 분절의 존재를 확인하고, 조직 손상 또는 과발현을 나타내는 cytosolid m cherry 응집체가 없는지 확인합니다. 그 후, time series 체크박스를 클릭하여 타임랩스 이미지 촬영 프로토콜을 활성화합니다. time series 섹션의 풀다운 메뉴에서 기간을 10분으로 조정하고, 간격 슬라이더를 0으로 설정하여 최대 이미지 획득이 가능하도록 총 촬영 시간을 설정합니다.그런 다음, 채널 섹션에서 GFP와 RFP 상자를 모두 체크하십시오. 적절한 밸브 컨트롤러를 활성화하여 profusion 시스템의 IPBS 라인을 열고, 'start experiment'를 클릭하여 이미징 프로토콜을 시작하십시오. 1분 후에 적절한 밸브를 열고 IPBS 라인을 닫아 20초 동안 염화암모늄 사후 용액으로 전환하십시오.그런 다음, 염화암모늄 라인을 닫고 IPBS 밸브를 다시 열어 IPBS로 복귀합니다. 2점 보정을 수행하려면, 하단 슬라이드에서 웰 디바이더를 벗겨내어 제거하고 이미징 웰에서 클램프에 고정된 프로퓨전 모세관을 제거합니다. 그 후, pH 7.4의 보정용 IPBS 버퍼 200 microliters를 주입합니다.그 후, 이미징 웰에서 용액을 제거하고 200 µL의 보정 용액으로 교체합니다. 용액이 완전히 교체되도록 이 과정을 4회 반복합니다. 다음으로, 이미징 전 시료와 보정 용액을 30분 동안 배양합니다.이전에 결정된 것과 동일한 파라미터를 사용하여 이미징 프로토콜을 반복하되, 이미지 캡처 시간을 1분으로만 수정합니다. 그런 다음 pH 9의 보정용 IPBS 버퍼 200 microliters를 추가합니다. 이미징 웰에서 용액을 제거하고 이를 다른 200 microliters의 보정 용액으로 교체합니다.그 후, 이미징 전 시료를 두 번째 보정 용액에서 10분 동안 배양하고 이미징 프로토콜을 반복합니다. 그 다음, 이미지 분석 소프트웨어에서 캡처된 이미지 스택을 검토하며, 프레임 슬라이더로 이미지 스택을 스크롤하는 동안 MeanROI를 클릭하여 두 채널 모두에서 포화된 픽셀이 없는지 확인하고, 강도 히스토그램에 보고된 값이 최대 검출 값에 도달하지 않았는지 확인합니다. 이어서, 형광 강도와 형광 비율을 시간의 함수로 플롯하여 이미지 스택을 분석합니다. 여기서는 지시약의 pH 민감 채널과 pH 비민감 채널에서 염화 암모늄 펄스에 대한 예상 형광 반응을 확인할 수 있습니다.이러한 신호들의 비율은 세포 내 pH의 일시적 변화를 나타냅니다. 이 분석을 수행하려면, 먼저 meanROI를 클릭하고 free form 도구를 선택하십시오. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태로 50 µm 크기의 MT를 따라 그리고, 오른쪽 버튼을 클릭하여 ROI 그리기를 완료하십시오.그 다음, 배경 ROI를 정의하기 위해 MT에 인접한 영역에서 동일한 과정을 반복합니다. 이어서, measurements에서 mean intensity를 클릭한 후 export, data table, create를 차례로 클릭하여 강도 값 테이블을 생성합니다. 설정 시계 휠 아이콘을 클릭하고 time과 mean intensity를 제외한 모든 파라미터의 선택을 해제합니다.새로 생성된 데이터 테이블의 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고, '다른 이름으로 저장'을 선택한 후 데이터를 csv 파일로 내보냅니다. 여기에 표시된 것은 광시야 이미지로, 전방 ante 및 전방 ante의 성상세포 내 주세포에서 관찰되는 초타원형 플루오린 형광입니다. 성상세포는 초기 분절에서는 막대 모양이고, 전이 분절에서는 가변적이며, 주 분절에서는 뚜렷한 세포 돌기를 나타낸다는 점에 유의하십시오.이 그래프는 관심 영역에서 20초 동안 40 millimolar 염화암모늄 펄스를 가했을 때 나타나는 보정된 세포 내 pH 변화를 보여줍니다. 점선 곡선은 염화암모늄 제거 후 산 회복 단계에 적용된 단일 지수 피팅을 나타냅니다. 이를 통해 감쇠 상수 값을 도출합니다.이 그래프는 세포 내 pH의 함수로 표시된 산 배출 속도를 나타내며, 이 그래프는 이전 그림의 지수 피팅에서 도출된 세포 내 pH의 함수로 표시된 산 플럭스를 나타냅니다. 숙달되면, 적절하게 수행할 경우 말피기관 추출을 10분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 성공 여부는 전적으로 해부의 품질과 pH 지시약의 정확한 보정에 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.본 준비 과정은 형광 칼슘 및 할라이드 지시약과 같은 다른 유전적 부호화 바이오센서와 결합하여 상피 세포 내의 용질 이동 및 세포 내 신호 전달을 연구하는 데 활용될 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 건강한 초파리 말피기관을 준비하고, 유전적으로 부호화된 pH 지시약을 이미징하며, 상피 세포 내의 양성자 이동을 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 니트로이젠(nitroizene)을 사용하는 것은 위험할 수 있으며 시료 준비물을 손상시킬 수 있으므로, 재사용할 장비가 오염되지 않도록 이 절차를 수행하는 동안 주의를 기울여야 함을 잊지 마십시오.

optical-quantification-intracellular-ph-drosophila-melanogaster

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Drosophila의 hemocytes은 개발 배아의 전체를 통해 분산. 이 프로토콜은 찬란 표시된 hemocytes와 배아를 사용하여 이러한 마이 그 레이션을 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다.

라이브 영상 Drosophila melanogaster 배아 Hemocyte 마이 그 레이션

이 기사는 암컷 초파리 파리의 전방세뇨관(MT)을 해부하는 방법과 Rossano et al.의 프로토콜 예시를 설명합니다. (2017) MT는 관류 챔버에서 라이브 이미징을 위해 준비됩니다.

성충 파리의 Malpighian Tubule Dissection: Isolating an Ossmoregulatory and Excretory Organ(성충 파리의 Malpighian Tubule Dissection: Isolating an Osmoregulatory and Excretory Organ)

이 비디오는 성체 초파리 파리의 세균성 식세포작용을 측정하기 위해 고안된 생체 내 분석을 보여줍니다. 성충 파리의 복부에 형광 표지된 박테리아를 주입한 후, 등쪽 혈관과 관련된 혈구는 식세포작용에 관여합니다. 트리판 블루 염료의 도입은 세포외, 비식세포작용 박테리아가 방출하는 형광을 소멸시키는 역할을 합니다. 이 담금질 과정은 형광 현미경으로 관찰할 때 식세포작용 박테리아의 식별을 향상시킵니다.

성체 초파리 파리에서 박테리아 식세포작용을 정량화하기 위한 In Vivo 분석

출처: Wagner, K. et al., eGFP 태그가 지정된 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포의 막 단백질 이동을 연구합니다.J. vis. 특급 (2022). 이 동영상은 eGFP 표지된 TRPL 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 이동을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 이미징을 위한 형질전환 파리의 준비, 광수용체 세포의 형광 이미지 캡처, 횡문막에서 상대적 eGFP 형광을 측정하여 TRPL 트래픽의 정량화에 대해 자세히 설명합니다.

Drosophila Photoreceptor Cells의 막 단백질 이동에 대한 연구

pH가 민감한 형광으로 막 단백질의 세포 외 도메인에 레이블, superecliptic pHluorin (-9 월), 세포 내 현지화, 표현, 인신 매매를 결정할 수 있습니다. 촬상 전반사 형광 현미경 (TIRFM)으로 단백질을 -9 월 표지 주연 ER 및 세포막에서 단백질 농도의 정량 분석을 가능하게한다.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Drosophila melanogaster photoreceptor의 전체 세포 기록은 다양한 조건 에서 자연스런 어두운 범프, 양자 범프, 빛에 대한 거시적 반응 및 전류 - 전압 관계를 측정 할 수있게합니다. D. melanogaster 유전자 조작 도구와 결합하여이 방법은 유비쿼터스 이노시톨 - 지질 신호 전달 경로와 그 표적 인 TRP 채널에 대한 연구를 가능하게합니다.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

우리는 살아있는 초파리 난소 조직에는 상피 줄기 세포 계보의 세포내 pH를 이미징에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 유전자 변형 파리 양적 형광 이미징 사용 하 여 바이오 센서는 pH 바이오 센서, mCherry::pHluorin, 이미지를 표현 생성 하 고 표준 곡선, 생성 한 형광 강도 값을 pH 값으로 변환 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 초파리 난소 조직에 여 포 줄기 세포 계보의 이미징 세포내 pH에 대 한 방법

이 프로토콜에서는 성인 초파리 melanogaster 식 인식 및 미생물 감염의 계량에서 vivo에서 먹어서 분석 결과를 설명 합니다.

과일 파리, 초파리 melanogaster에 비보 먹어서 분석 결과 사용 하 여의 세포 면역 반응 평가

초기 초파리 배아에서는 많은 소기관이 운동성입니다. 원칙적으로, 그들은 특정 형광 프로브를 통해 실시간으로 이미징 될 수 있지만, 달걀 껍질은 배아에 직접 적용하는 것을 방지합니다. 이 프로토콜은 미세주입을 통해 이러한 프로브  를 도입한 다음 입자 이미지 속도측정법을 통해 벌크 소기관 움직임을 분석하는 방법을 설명합니다.

초파리 배아에서 지질 함유 소기관의 세포 골격 의존성 밀매 시각화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

학습하세요 Drosophila melanogaster 말관상피에서 형광 유전자 인코딩 pH 지시자 pHerry를 이용한 세포내 pH 광학 정량화 방법입니다. 이 기술은 상피 세포의 양성자 수송을 실시간으로 평가할 수 있습니다.

형광 유전자 인코딩 ph 지시자 초파리 melanogaster 말 관 Epithelia에 광학 정량화의 세포내 pH

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