부고환에서 분리 된 1 차 상피 세포의 전체 세포 패치 - 클램프 기록

이 절차의 전반적인 목표는 쥐 부고환에서 상피 세포를 분리하고 전체 세포 패치 클램프 방법을 사용하여 주로 해리된 세포의 전기적 특성을 측정하는 것입니다. 이 방법은 정자 성숙 및 부계 형질의 유전에 중요한 부고환의 기능과 같은 생식 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술을 통해 사용자는 분리된 부고환 상피 세포의 전기적 특성을 소작하여 이러한 세포의 알려지지 않은 생리학적 기능을 설명할 수 있습니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 대학원생인 Bao Li Zhang입니다. 절차를 시작하려면 70% 에탄올에 담가 해부 도구를 소독하십시오. 그런 다음 자연 건조시킵니다.

다음으로, 전체 IMDM을 준비합니다. 그 후, 무균 상태에서 50ml 부분 표본을 만들고 파라필름으로 밀봉한 다음 섭씨 4도에서 보관합니다. 그 후, 콜라겐 분해 효소 I 형과 콜라겐 분해 효소 II 형을 RPMI에 용해시켜 콜라겐 효소 소화 용액을 준비하여 용액에 각 콜라겐 분해 효소의 밀리리터 당 1 밀리그램이 생성되도록합니다.

0.22마이크로미터 멤브레인을 통해 용액을 여과합니다. 그런 다음 콜라겐 분해 효소 용액으로 표시하고 사용할 때까지 용액을 실온에 보관하십시오. 다음으로, 효소의 무게에 따라 효소 용액의 부피를 조절합니다.

한 마리의 쥐에서 두 개의 꼬리 부고환에 필요한 최소 부피는 2ml입니다. 쥐의 꼬리 부고환을 해부하기 위해, IP 주사를 통해 펜토바르비탈나트륨을 사용하거나 꼬리 꼬집기 자극에 반응하지 않을 때까지 이소플루란 챔버를 사용하여 동물을 희생한 후 자궁 경부 탈구가 발생합니다. 그 후 하복부를 70% 에탄올로 닦아 소독합니다.

두 개의 고환을 하복부로 부드럽게 밀어 내린 다음 음낭 근처의 하복부를 엽니다. 그런 다음 부고환 지방을 제거하고 모든 생식 기관을 해부합니다. 그런 다음 RPMI로 접시에 옮깁니다.

깨끗하고 공기 흐름이 제어되는 작업 스테이션에서 결합 및 지방 조직과 부고환낭에서 꼬리 부고환을 해부합니다. 1.5ml 튜브에 0.2ml의 콜라겐 분해 효소 용액이 든 부고환 하나를 놓습니다. 꼬리 부고환에서 단일 세포를 분리하려면 조직이 반죽 같은 액체가 될 때까지 가늘게 가위를 사용하여 콜라겐분해효소 용액에서 부고환을 절단합니다.

그런 다음 튜브에 있는 나머지 효소 용액으로 가위를 부드럽게 헹굽니다. 그 후, 튜브를 금속 온도 혼합기에 30 분 동안 37 섭씨 온도에서 1, 000 rpm의 쉐이킹 속도로 놓습니다. 그런 다음 효소 조직 혼합물을 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.

그 후, 대부분 정자를 포함하는 끈적끈적한 상층액을 디캔팅합니다. 다음으로, 펠릿을 1ml의 전체 IMDM에 재현탁시켜 모든 효소 활성을 소멸시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 49ml의 RPMI가 들어 있는 50ml 튜브로 옮깁니다.

세포 혼합물을 원심분리하고 상층액을 디캔팅합니다. 펠릿을 1ml의 전체 IMDM에 최소 5분 동안 부드럽게 분쇄하여 효소 처리된 부고환 조직 혼합물에서 단일 세포를 해리합니다. 무균 상태에서 상피 세포를 다른 세포와 분리하고 전체 IMDM이 포함된 10cm 페트리 접시에서 섭씨 32도의 인큐베이터에서 최소 8시간 동안 또는 밤새 세포 현탁액을 배양합니다.

다음날 아침, 100% 알코올에 담가 멸균 커버 슬립을 준비합니다. 자연 건조시킨 다음 소량의 배양 배지에 담그십시오. 그런 다음 커버 슬립을 6cm 배양 접시 또는 24웰 플레이트의 단일 웰에 넣습니다.

이제 대부분 상피 세포로 구성된 페트리 접시에서 세포 현탁액을 부드럽게 수집하여 해리된 상피 세포를 수확합니다. 세포 현탁액을 실온에서 30배 G로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 디캔팅합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 2ml의 전체 IMDM에 재현탁합니다.

0.2 밀리리터의 채취된 세포 현탁액을 각 멸균 커버 슬립의 중앙에 파종합니다. 세포 현탁액이 최소 10분 동안 액체 방울에 가라앉도록 하여 세포가 유리 커버 슬립에 느슨하게 부착되도록 합니다. 그런 다음 세포를 방해하지 않고 6cm 접시 가장자리에 전체 IMDM 1ml 또는 24웰 플레이트의 각 웰에 전체 IMDM 0.3ml를 조심스럽게 추가합니다.

패치 클램프 실험이 진행될 때까지 분리된 단일 세포를 섭씨 32도의 인큐베이터에서 커버 슬립으로 유지합니다. patch-clamp 실험 당일, 세포 내 용액 분취액 1개를 얼음에서 해동하고 patch-clamp 실험 중에는 분해를 방지하기 위해 식힌 상태로 유지합니다. 다음으로, 유리 커버 슬립의 배양 상피 세포를 실온에서 표준 PSS로 채워진 기록 챔버로 옮깁니다.

패치 클램프 실험 전에 피펫을 사용하여 목욕 PSS를 최소 두 번 조심스럽게 교체하십시오. 전체 세포 구성을 설정하려면 마이크로 매니퓰레이터의 최고 속도로 피펫을 수조 용액에 담그십시오. 디지털 카메라에 연결된 화면에서 피펫 팁을 찾습니다.

그런 다음 마이크로 매니퓰레이터 속도를 중간-높음 모드로 늦춥니다. 컴퓨터 제어 증폭기에서 생성된 전압 단계를 적용하여 데이터 수집 인터페이스 명령을 사용하여 마이크로피펫 저항을 빠르게 확인합니다. 저항이 이 범위를 크게 벗어난 경우 새 마이크로피펫으로 교체하십시오.

그리고 피펫과 수조 용액 사이의 액체 접합 전위를 소프트웨어의 커맨더 인터페이스에서 피펫 오프셋 명령을 사용하여 0으로 설정합니다. 멤브레인 테스트로 저항을 모니터링합니다. 저항이 500메가옴보다 크지만 1기가옴보다 작으면 음의 전위를 적용하여 기가씰을 형성하는 데 도움이 됩니다.

그 동안 마이크로피펫의 과도 용량성 전류를 보상하십시오. 이 순간, 밀봉 저항 측정을 위해 0 밀리볼트의 유지 전위에서 10 밀리볼트 과분극 단계를 적용하십시오. 성공적인 전체 셀 구성을 달성한 직후, 음의 60mvolts의 유지 전위에서 10mvolts hyperpolarizing 단계를 적용합니다.

전압 모드를 제로 전류 모드로 전환하고 10초 동안 갭 없는 기록을 수행하여 세포의 휴지막 전위를 측정합니다. 그런 다음 빠르게 다시 전환하고 전압 모드를 유지하십시오. 계획된 실험에 따라 전압 프로토콜을 적용하고 전류 응답을 측정합니다.

다음은 patch-clamp 실험 전에 접시에서 하룻밤 배양을 재수확하기 전과 후에 rat cauda epididymides에서 분리된 상피 세포의 예입니다. 이 그림은 펄스 유도 프로토콜을 사용하여 단일 부고환 상피 세포에서 기록된 일반적인 전체 세포 전류를 보여줍니다. 점선은 0 전류 수준을 나타냅니다.

다음은 표시된 시점에서 측정된 전류 응답의 전류 전압 관계입니다. 이는 ATP 또는 ATP 없이 피펫 용액으로 투석된 주요 세포의 휴지막 전위의 대표적인 추적입니다. 그리고 이 막대 그래프는 플러스 ATP와 마이너스 ATP의 초기 휴지막 전위 사이에 큰 차이가 없음을 보여줍니다.

막대 안의 괄호 안의 숫자는 최소 3마리의 동물에서 테스트된 세포의 수를 나타냅니다. 그리고 다음은 모든 셀 또는 주요 셀의 밀봉 저항과 입력 저항의 상관 관계 분석과 전체 셀 설정 직후 제로 전류 클램프에서 측정된 휴지 전위와 과분극 단계에서 측정 된 전류 크기를 유지 전위에서 음의 100 밀리 볼트로 분석한 것입니다. 이 기술을 한 번 숙달하면 제대로 수행하면 9시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 세포 분리 단계에서 효소 분해를 즉시 중지해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 과소화가 발생하여 기가옴 씰의 형성이 어려워지고 패치 클램프 실험이 실패할 수 있습니다. 배양의 건강을 유지하려면 효소로 해리된 세포 혼합물을 30G의 저속으로 2-3분 동안 스핀다운한 다음 대부분 정자 세포를 포함하는 끈적한 상층액을 디캔팅하는 것이 중요합니다.

이러한 절차에 따라 살아있는 세포 이미징 및 단일 세포 배양 기술과 같은 다른 방법을 수행하여 미접촉 상피 세포의 휴지막 전위가 통제된 조건에서 세포 외 거동을 조절할 수 있는 것과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술은 생식 생물학 분야의 연구자들이 정자 성숙 및 부계 획득 형질 유전의 조절을 위해 부고환의 상피 세포의 전기 생리학적 특성을 탐구할 수 있는 길을 열어줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 쥐 부고환에서 상피 세포를 분리하는 방법과 전체 세포 패치 클램프 방법을 사용하여 이러한 세포의 전기적 특성을 측정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.