신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로

본 절차의 전반적인 목표는 청각 연구의 인비트로(in vitro) 스크리닝 도구로 사용될 신생 마우스 와우 외식편(cochlear explants)의 준비, 배양, 처리 및 면역염색을 수행하는 것입니다. 이 방법은 ex vivo 모델에서 와우 유모세포, 시냅스, 신경돌기 및 뉴런을 동시에 연구할 수 있게 하고, 인체 분비물에서 발견되는 인자를 포함하여 와우에 새롭게 도입된 분자들의 작용 기전에 대한 통찰을 제공함으로써 청각 연구 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 후보 치료 화합물의 스크리닝 과정을 인비보(in vivo) 테스트 전에 가속화할 수 있다는 점입니다.

70% ethanol이 담긴 페트리 접시 뚜껑에 보관된 갓 채집한 신생아 머리부터 시작합니다. 메스 날을 사용하여 두개골의 전단에서 후단까지 피부를 얕게 절개합니다. 그다음 양쪽 외이도를 절개하고 피부를 앞쪽으로 젖혀 두개골 전체를 노출시킵니다.

다음으로, 달팽이관이 압박되는 것을 방지하기 위해 메스 날을 전방에서 후방으로 부드럽게 위아래로 움직여 시상 봉합선을 따라 두개골을 엽니다. 안와 바로 뒤쪽을 수직으로 절개하여 주둥이 부분을 제거하고 버립니다. 두개골의 후방 부위에는 뇌와 달팽이관이 그대로 남아 있어야 합니다.

그 다음 4-forceps를 사용하여 전뇌, 소뇌 및 뇌줄기를 둔탁하게 박리하여 제거합니다. 두개골의 두 반구를 차가운 HBSS가 채워진 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 4-forceps를 사용하여 주변의 등골동맥에 인접한 와우를 완전히 노출시키고, 측두골에서 해당 기관을 둔탁하게 분리합니다.

달팽이관을 HBSS가 담긴 50 millimeter 투명 벽 유리 바닥 페트리 접시에 옮기고 접시를 현미경 아래에 배치합니다. 두개골의 나머지 절반이 들어있는 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시는 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 4개의 핀셋을 사용하여 달팽이관의 이낭(otic capsule)을 조심스럽게 절개합니다.

이제 마이크로 나이프나 두 개의 55 핀셋을 사용하여 코르티 기관(organ of Corti)에 부착된 나선인대를 와우의 나머지 부분 및 내측벽으로부터 조심스럽게 분리합니다. 이는 나선인대의 가장 기저부를 잡고 정단부 방향으로 이동하며 부드럽게 풀어냄으로써 수행할 수 있습니다. 나선인대를 제거한 후, 시료를 배치하여 와우의 종단 시상면 뷰를 확보합니다.

그 다음 마이크로 나이프를 사용하여 달팽이관을 두 개 또는 세 개의 구역으로 자르고, 이 구역들을 꼭대기 회전(apical turn)과 바닥 회전(basal turn)으로 분류합니다. 달팽이관 절편이 페트리 접시 위에 수평으로 놓일 수 있도록, 꼭대기 쪽 조각은 상단 조직을, 바닥 쪽 조각은 하단 조직을 제거하여 실제 유모세포와 신경돌기 층이 드러나게 합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 코르티 기관(organ of Corti) 바로 위에 위치한 매우 얇고 반투명한 층인 전정막을 조심스럽게 잡아 벗겨냅니다.

가장 기술적으로 어려운 단계는 얇고 반투명한 덮개막(tectorial membrane)을 제거하는 과정일 가능성이 높으며, 이는 하부의 유모세포를 쉽게 손상시킬 수 있기 때문입니다. 조직의 가장자리부터 시작함으로써, 덮개막 박리가 시작된 최외곽 부분을 제외하고는 절제편 전체 길이에 걸쳐 유모세포를 보존할 수 있습니다. 마지막으로, 나선신경절 뉴런 바로 위에 위치한 라이스너막(Reissner's membrane)의 양측을 핀셋으로 집어 떼어냄으로써 이를 제거하십시오.

가장자리의 손상된 부위를 제거하면 와우 표본을 배양할 준비가 완료됩니다. 외편이 팁 내부에 부착되는 것을 방지하기 위해 1 mL 피펫 팁 끝을 약 120 µL의 DMEM으로 적셔 배양 절차를 시작하십시오. 그런 다음, 미리 적신 팁을 사용하여 유리 바닥 페트리 접시에서 최대 70 µL를 피펫팅하고, 표본을 액체와 함께 4-웰 페트리 접시의 4개 인레이 중 하나에 옮깁니다.

현미경으로 관찰하여 외식편이 올바른 방향으로 놓여 있는지 확인하십시오. 와우막이 제거된 유모세포 영역이 위를 향하고, 기저막과 다듬어진 내측 기저부가 아래를 향해 커버스립 인레이에 밀착되었는지 확인하십시오. 여기에서 보는 것처럼 검사 시 표본이 거꾸로 놓여 있다면, 피펫 팁으로 HBSS를 추가하고 조각을 다시 배치하여 방향을 올바르게 잡으십시오.

외편물이 올바르게 방향이 잡히면, 과량의 HBSS를 흡입하여 제거한 후 15초 동안 기다립니다. 이제 따뜻한 배양액 60 microliters를 피펫으로 시료 위에 직접 분주하되, 피펫 팁이 시료에 닿지 않도록 주의하십시오. 내부 및 외부 페트리 접시 덮개를 덮고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, Petri 접시가 담긴 달팽이관 외식편을 인큐베이터에서 라미나 플로우 후드로 옮깁니다. 인레이에서 FBS가 포함되지 않은 기존 배양액을 흡입하여 제거합니다. 준비된 따뜻한 처리 배지를 웰당 60 microliters씩 추가합니다.

배양물을 염색할 때까지 페트리 접시를 인큐베이터에 다시 넣고 최대 7일간 배양합니다. 이 공초점 이미지에서 볼 수 있듯이, 이 기술은 나선신경절 뉴런(SGNs)을 포함한 와우 회전 전체의 해부학적 구조를 보존하여, 코르티 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경돌기와 세포체에 미치는 처리 효과를 분석할 수 있게 합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 이러한 외식편은 면역형광 염색 후 정단부와 기저부 회전에 미치는 처리 효과를 동시에 비교하는 데 사용할 수 있습니다.

모세포는 녹색으로, 신경 구조는 적색으로 표시됩니다. 시냅스 전 단백질(적색)과 시냅스 후 단백질(녹색)을 신경 구조의 염색(청색)과 함께 표지함으로써 온전한 시냅스의 상태를 평가할 수 있습니다. 이 그림은 왼쪽의 3% FBS 또는 오른쪽의 1% FBS 조건에서 7일 동안 배양한 후의 정단부 및 기저부 와우 외식편의 대표 이미지를 보여줍니다.

3% FBS에서 배양된 세포들은 유모 세포를 가리키는 연한 회색 화살표와 신경 돌기를 가리키는 빨간색 화살표에서 보이듯이 4일에서 5일 사이에 이동하기 시작합니다. 1% FBS 내의 외식편은 7일까지 조직적 통합성을 유지합니다. 이 절차를 수행할 때는 최종 배양액과 관심 물질을 첨가하기 전에 와우 조직의 구조적 통합성과 방향을 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라, medialis 내에서 GFP 발현 세포의 세포 유형 특이적 국소화를 확인하기 위해 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.