Name: 신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로 체외에서 청력 연구의 스크리닝 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 신생아 쥐 달팽이관 explant 기법을 이용한 청력 연구 체외 스크리닝 방법을. 이 기술은 치료제 후보 화합물의 효과를 신속하게 평가하여 청각 상실 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 국립 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 보조원 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (SD 지원), 국방부의 W81XWH-15-1-0472 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer 이명 연구 센터 (KMS) 등이 있습니다. Jessica E. Sagers, 원고에 대한 통찰력있는 의견에 감사드립니다.

연구 프로토콜은 매사추세츠의 눈과 귀의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 실험은 세계 의학 협회의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다. 1. 절개 준비 <ol><li> 외과 테이블 준비하기 <ol><li> 수술 테이블을 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용하십시오. </li><li> 현미경 옆에 두 개의 nonsterile prep pad를 놓습니다. </li><li> 가열 살균 된 작동 가위, 메스칼 핸들, 마이크로 나이프 및 포셉 (# 4 및 # 55 각각 2 개)을 포함하여 도구 트레이를 준비합니다. 악기 쟁반과 50mm의 깨끗한 벽으로 된 유리 바닥의 페트리 접시를 비 살균 패드 위에 놓습니다. </li><li> 살균 된 # 15 메스 블레이드를 얻습니다. 밀봉 가능한 비닐 봉지 또는 용기 (기관 지침에 따라 도체를 처리하는 것); 양동이에 얼음; 및 감기, 무균 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS). 이 항목을다른 비 스테로이드 패드. </li><li> 50 ML 플라스틱 실험실 튜브에 HBSS를 전송하고 얼음에 넣어. </li></ol></li><li> 문화 준비 <ol><li> 모든 물질을 층류 후드에서 준비하십시오. 4 개의 시편마다 35mm 4-well petri dish의 4 개의 인레이에 4 개의 오토 클레이브 된 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다. </li><li> 매 4 개의 시편에 대해 microcentrifuge tube에 다음과 같이 구성된 300 μL의 총 부피를 섞으십시오 : 조직 접착제 10 μL, NaHCO 3 285 μL 및 NaOH 5 μL. </li><li> 모든 커버 슬립에 결과 용액 45 μL를 넣고 RT에서 최소 20 분 동안 그대로 두십시오. 이 솔루션은 몇 시간 동안 coverslip에 남아있을 수 있지만 O / N을 남길 수 없습니다. </li><li> 오염에 대한 두 가지 장벽을 만들기 위해 하나 또는 두 개의 35mm 4 잘 배양 접시 (10) 페트리 접시 안에 놓습니다. </li><li> 98 % Dulbecco 수정 된 이글의 배지 (DMEM), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 ((마이크로) 원심 분리 튜브 내 웰 당 65μL)로 처리 하였다. 사용하기 전에 용액을 25 ° C로 예열하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 마우스 달팽이관 Explant의 해부 <ol><li> 신생아 마우스의 목을 베다. <ol><li> 60mm 플라스틱 페트리 접시를 얻고 뚜껑에 70 % 에탄올을 뿌려 표면이 젖도록하십시오. </li><li> 차가운 HBSS를 플라스틱 실험실 튜브에서 60mm 플라스틱의 바닥 부분과 50mm 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 붓는다. 절개하지 않을 때마다 조직을 차가운 상태로 유지하기 위해 플라스틱 실험실 튜브와 두 페트리 접시를 얼음에 보관하십시오. </li><li> P3 - P5 세 신생아 마우스를 라텍스 장갑의 절단 손가락에 얼음 위에 놓고 저체온증이 의식 상실을 유발할 때까지 기다립니다 (약 1-3 분). </li><li> 작동 가위로 마우스를 신속하게 처치하고 몸체를 밀봉 가능한 플라스틱 백에 폐기하십시오. 절단 된 신생아 머리를60mm 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에 70 % 에탄올. </li></ol></li><li> 측두골의 거시적 절제술 <ol><li> 메스 블레이드를 사용하여 전방에서 후방 끝으로 (표면 봉합 바로 위에) 표면 절단을하여 두개골의 피부를 제거합니다. </li><li> 외이도를 메스 칼로 모두 자르고 피부를 앞쪽으로 접어서 전체 두개골을 드러내십시오. 참고 : 해부 현미경은 일반적으로이 단계에 필요하지 않지만 시각화를 개선하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> # 15 메스 블레이드를 사용하여 화살 봉합을 따라 두개골을 엽니 다. 달팽이관의 압축을 피하기 위해 칼날을 앞뒤로 부드럽게 움직여서 두개골을 자르십시오. 참고 : 두개골은이 나이에 골화되어서는 안되며 쉽게 절단해야합니다. </li><li> # 15 메스를 사용하여 궤도 바로 뒤쪽에서 수직으로 절단하여 주둥이를 제거하고 버립니다.잎. 참고 : 두개골의 후부에는 여전히 뇌와 달팽이가 있어야합니다. </li><li> # 4 포셉으로 무딘 절개를 통해 forebrain, 소뇌, 그리고 brainstem의 처분. </li></ol></li><li> 달팽이관의 현미경 적 추출 <ol><li> 범위 아래에 집게를 놓고 조명과 초점을 최적화하여 현미경 (배율 6.5X) 및 광원을 조정합니다. </li><li> 차가운 HBSS로 가득 찬 60mm 플라스틱 페트리 접시에 두개골의 두 반쪽을 놓습니다. </li><li> 주위의 stapedial artery (측두골 내의 구불 구불 한 동맥)에 인접한 것으로 확인되는 달팽이관 / e를 완전히 노출시키고 # 4 포셉을 사용하여 뼈를 일시적으로 뼈에서 분리합니다. </li><li> 달팽이관을 50mm의 유리 벽으로 덮인 유리 바닥 페트리 접시에 옮기고 접시를 현미경에 놓습니다. </li><li> 얼음에 두개의 다른 절반과 60mm 플라스틱 페트리 접시를 놓습니다. </li&gt; <li> vestibular 시스템에서 달팽이관을 제거하고 조심스럽게 # 4 포 셉와 달팽이관 (이 연령대의 연골) 캡슐을 해부. 모든 추가 단계에 # 55 포셉을 사용하십시오. </li></ol></li><li> 조직 처리의 최종 단계 <ol><li> 조심스럽게 코티의 장기에 부착 된 나선형 인대와 마이크로 나이프 또는 2 개의 집게를 사용하여 modiolus를 분리하여 내이 조직을 가공합니다. <ol><li> 나선형 인대와 유모 세포 영역 사이의 틈새에있는 더 어둡고 반투명 한 부분을 잘라내어 가장 기초적인 부분을 잡고 부드럽게 풀어서 나선형 인대를 제거합니다. </li></ol></li><li> 표본을 배치하여 달팽이관의 길이 방향, 시상면을 얻은 다음 마이크로 나이프를 사용하여 달팽이관을 2 개에서 3 개 섹션으로 잘라 내고이 섹션을 꼭지점, (중간,) 및 basal turns. 페트리 접시에 수평으로 놓일 수있는 달팽이 explant 조각을 달성하기 위해 유모 세포와 신경 돌의 실제 레이어로 상사와 하체를 제거합니다. 참고 : 배양 접시에 안정적으로 접착하기에 적합한 크기는 달팽이관 회선의 약 절반입니다. </li><li> tortial 멤브레인, 코르티의 기관에 즉시 우수한 매우 얇은 반투명 레이어 제거, 부드럽게 포 셉와 멀리 벗겨. </li><li> Reissner의 멤브레인을 SGN 바로 위에 놓고 양쪽에 집게를 씌우고 벗겨냅니다. 참고 : 옆으로 위치한 손상된 헤어 셀 영역을 마이크로 나이프로 잘라서 제거하십시오. </li></ol></li></ol> 3. 표본의 문화 플레이트로의 이전 <ol><li> 네 커버 슬립에서 조직 접착제 솔루션 45 μL를 제거합니다. 멸균 H 2 O 50 μL로 각 커버 슬립을 씻으십시오. 물을 기음. </li><li> 1 ML 피펫을 들어. 표본이 팁 내부에 달라 붙지 않도록 DMEM 약 120 μL로 피펫 팁을 적셔주십시오. </li><li> 1 ML 피펫을 사용하여 개별적으로 표본을 전송하십시오. HBSS로 채워진 작고 투명한 벽이있는 유리 바닥 페트리 접시에서 최대 70 μL를 피펫으로 추출한 다음 4 웰 배양 접시에있는 4 개의 인레이 (커버 슬립으로 준비) 중 하나에 시편을 액체와 함께 놓으십시오 . </li><li> 현미경 (배율 50 배)에서 시편의 방향이 올바른지 확인하십시오. tectorial 막이 제거 된 유모 세포의 영역이 위쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. modilarus의 기본 부분과 함께 basilar 막이 아래쪽을 향하게하고 coverslip에 붙어 있는지 확인하십시오. <ol><li> 시험편을 거꾸로 뒤집어 놓은 경우 피펫 팁에 남아있는 HBSS를 인레이에 넣고 올바른 방향이 될 때까지 조각의 위치를 ​​변경합니다. 아니TE : 이것은 퇴화로 이어질 수있는 coverslip에서 구조적 지원없이 유모 세포가 문화 매체에 떠 다니는 것을 방지합니다. </li></ol></li><li> 1 ML 피펫을 사용하여 초과 HBSS를 대기음. 15 초를 기다리십시오. </li><li> 준비된 따뜻한 문화 매체 (98 % DMEM, 1 % N - 2, 1 % 암피실린) 60 μL를 표본에 직접 피펫. 피펫으로 시료를 만지지 않도록주의하십시오. 내부 및 외부 페트리 접시 커버를 교체하고 37 ° C에서 O / N 품어. </li><li> 스톡 용액을 모두 적당한 곳에 다시 채우고 시체와 잔여 폐기물을 처분하고 기관 지침 ( 예 : 에탄올이나 차아 염소산염을 사용)에 따라 수술 테이블을 오염 제거하고기구를 세척하고 고압으로 멸균 한 다음 적절한 용기에 날카로운 물건을 버리십시오 . </li></ol> 4. 최종 배양 배지 및 관심 대상 물질 추가 참고 : Cochlear explants는 10-16 시간 후에 사용할 준비가됩니다. <ol><li> 믹스 룸 준비하기97 % DMEM, 1 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % N-2 및 1 % 암피실린 (마이크로 원심 분리 관에서 1 웰 당 65μL; 사용 전에 25 ℃로 가열). </li><li> 해당 치료 그룹의 솔루션에 관심있는 다른 물질을 추가하십시오. 형광 물질이 첨가 된 경우 ( 예 : 녹색 형광 단백질 (GFP) 발현 바이러스, 최근 발표에서는 50 μL에서 48 시간 동안 10 10 GC의 Adeno-Associated Virus (AAV) 농도가 사용됨) 18 , 빛. </li><li> 인큐베이터에서 달팽이 explant 포함 petri 접시를 전송하고 층류 후드 아래에 놓으십시오. </li><li> 인레이에서 피펫으로 오래된 문화 매체 (FBS 제외)를 대기음. </li><li> 준비된 따뜻한 문화 (치료) 매체 (97 % DMEM, 1 % FBS, 1 % N - 2, 1 % 암피실린 및 관심 물질)의 잘 당 60 μL를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터 (37 ° C)에 페트리 접시를 다시 놓습니다. </li><li> 보기 r악성 종양, 세포 이동 또는 달팽이 해부 체의 박리를 확인하고 최대 7 일 후에 염색을 수행하기 위해 현미경하에 egularly 수행합니다. </li></ol> 5. 면역 형광법 - 1 일째 <ol><li> 차단 용액 (94 % 인산 완충 식염수 (PBS), 5 % 정상 염소 또는 말 혈청 (2 차 항체에 따라 NGS / NHS), 1 % 비이 온성 계면 활성제 ( 표 2 참조) 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 각각의 항체와 함께 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)를 첨가 하였다. 참고 : 항체에는 1 : 400+ (myosin 7A, 내외부 유모 세포 용) 및 mouse anti-TuJ1 1 : 200+ (SGNs 용 β-tubulin) 또는 마우스 (IgG1) 항생제의 농도에서 토끼 항 -Myo7A (postsynapse density), postsynapse의 경우 postsynaptic density) 및 닭 항 -NF-H1 : 1000+ (neurofilament, anti-NF-H1 : SGN 및 신경 섬유의 경우). &quot;+&quot;means &quot;이상이어야합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 문화 매체를 대기음. 시험편을 만지지 않도록주의하십시오. </li><li> 층류 후드 아래, 멸균 PBS로 달팽이 explants 두 번 씻어 각 세탁 후 5 분 동안 표본을 쉐이커에 배치. </li><li> 쉐이커 (후드 아래)에서 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA -주의)에 조직을 고정시킵니다. PFA를 흡인하십시오. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 인공 호흡기를 준비된 차단 용액 (94 % PBS, 5 % NHS 및 1 % 비이 온성 계면 활성제)에 쉐이커에서 30 분간 놓습니다. </li><li> RT에서 카운터에 각각의 기본 항체 (사용하기 전에 소용돌이) O / N와 준비 주식 항체 솔루션 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비 이온 계면 활성제)에 달팽이 explants를 놓으십시오. 참고 : 젖은 종이 타월로 플라스틱 포장 (또는 추가 된 solut 경우 알루미늄 호일)로 묶인 페트리 접시를 포장하십시오이온은 GFP 발현 바이러스와 같은 형광 물질을 포함하고 있습니다)을 사용하여 접시를 습기있게 유지하고 항체 용액 O / N의 증발을 방지합니다. </li></ol> 6. 면역 형광법 - 2 일차 <ol><li> 4 &#39;, 6 - diamidino - 2 - phenylindole (DAPI) 얼룩 (300 nm)을 준비하고 단계 5.1에서 기본 항체에 보완 올바른 올바른 보조 항체 혼합물을 얻기 위해 재고 항체 솔루션을 사용합니다. ( 예 : 염소 항 토끼 488 1 : 200+ 및 염소 항 마우스 568 1 : 200+ 또는 염소 항 마우스 (IgG1) 568 1 : 1000+, 염소 항 마우스 (IgG2a) 488 1 : 500+, 및 염소 항 - 치킨 647 1 : 200+ 또는 Phalloidin 568 1 : 200+ (내외부 유모 세포 용)). </li><li> 일차 항체 용액을 대기음. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 인공 호흡기를 준비된 항체 용액 (98.6 % PBS, 1 % NHS 및 0.4 % 비이 온성 계면 활성제)에 놓고카운터에 1.5 시간 동안 이차 항체 (사용 전 와류)를 가하고 빛으로부터 보호하십시오. </li><li> 2 차 항체 용액을 흡인하고 DAPI 얼룩 (1 분간 진탕 기 위에 놓은 후 흡인)로 달팽이 외식 편을 씻어냅니다. </li><li> 달팽이 explants에 PBS 60 μL를 적용하고 5 분 동안 쉐이커에 배양 접시를 놓습니다. PBS를 대기음. 3 배 반복. </li><li> 포 셉을 사용하여 4 - 웰 플레이트에서 표본과 coverslips를 제거하고, 증류수 H 2 O로 가득한받는 사람에 그들을 찍어, 그리고 종이 수건과 접촉하여 coverslips을 수직으로 가져 와서 건조. </li><li> 현미경 슬라이드에 삽입 방지 매체 한 방울을 놓고 커버 슬립을 거꾸로 뒤집어서 매체에 묻힌 조직을 담그십시오. </li><li> 유리 아래에 시편을 분쇄하지 않고 가장자리를 원주 방향으로 덮는 깨끗한 손톱 광택을 사용하여 coverslip을 봉인합니다. 슬라이드를 15 ~ 20 분 동안 빛이 닿지 않는 곳에 덮고 평평하게 놓고 건조한 상태로 놓습니다.상자에 넣거나 공 촛점 현미경으로 검사하십시오. 참고 : 형광 염색은 슬라이드를 4 ° C 또는 -20 ° C에 보관하여 보존하는 것이 가장 좋습니다. </li></ol> 7. 공 촛점 이미징 <ol><li> 신경 돌기와 SGN을 포함하여 Corti 지역의 기관에 대한 개요와 확대 된 그림을 얻습니다. 참고 : 이미징 프로세스의 표준 설정 : 1,024 x 1,024 픽셀, 400 Hz의 속도, 프레임 평균 3, 전체 레이저 강도 20 %, 오일 침지 (일반적으로 2 배 디지털 줌과 결합 된) 20X 및 63X 렌즈의 형식. DAPI, Myo7A 및 TuJ1 염색 프로토콜에 대한 채널 설정은 위에 요약되어 있습니다. 405 5 % DAPI, &quot;Smart Gain&quot;766.8V, &quot;Smart Offset&quot;0.0 % - 488 15 % FITC (fluorescein isothiocyanate), &quot;Smart Gain&quot;622.2V , &quot;스마트 오프셋&quot;0.0 % - 561 13 % 테트라 메틸로 마틴 이소 티오 시아 네이트 (TRITC), &quot;스마트 게인&quot;562.4V, &quot;스마트 오프셋&quot;0.0 %. </li><li> 이미지를 z 스택에 병합하려면소프트웨어를 사용하여 z 축 투영을 얻습니다. </li></ol>

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

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연구원은 달팽이관 외식에 관련된 실험을하기 전에 해부 기술을 완벽하게해야합니다. 유모 세포는 일반적으로 학습 곡선에서 초기에 수행되는 해부 중에 손상되며, 완전 무결 한 특히 문제가되는 순간은 안정적인 손, 적절한 도구 및 경험이 필요한 tectorial membrane의 제거입니다. 시간과 자원을 절약하기 위해 해부 현미경으로 시각 제어를 수행해야하며 잠재적으로 손상된 부위를 기록해야합니다. 값 비싼 1 차 및 2 차 항체를 사용하는 대신 phalloidin과 같은 값싼 시약이 예비 실험에 더 적합합니다. 약간의 손상된 explants 잠재적으로 여전히 실험 (영향을받지 않은 섹션 분석) 또는 항체의 새로운 조합의 테스트에 대한 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 표본을 옮기는 것은 특히 중요합니다. 왜냐하면 표본의 조각이거꾸로되어 있지 않습니다 (코팅 된 커버 슬립의 안내없이 종종 &quot;떠 다니는&quot;유모 세포가 퇴화 됨). coverslip의 중앙 위치는 모든 추가...

Sensorineural Hearing Loss (SNHL)은 내이 또는 오름차순 청각 경로의 손상을 나타냅니다. 청력 상실은 인간 1 에서 가장 흔한 감각 결손이지만 치유 요법은 아직 존재하지 않습니다 2 . 인공 와우 또는 청각의 뇌간 이식 물이 심한 SNHL 환자의 청력을 어느 정도 회복시킬 수는 있지만, 이러한 장치가 제공하는 청력은 특히 자연스러운 청력과는 매우 다르며 특히 소음의 말을 이해하거나 음악을 듣는 동안 매우 다릅니다. 유모 세포 변성은 오랫동안 외상성 청각 사건 ( 예 : 시끄러운 소음에 노출)의 주요 결과로 간주되어 왔지만, 유모 세포에서 청각 신경으로 정보를 전송하는 시냅스가 적어도 음향 외상에 취약한 증거가 증가하고 있습니다 3 , 4 , 5 </sup<html> &gt; , 6 . 청각 기능 평가를위한 현재의 금 표준 인 인간의 청력 역치는 내이의 특정 세포 손상을 예측하지 않기 때문에 가능한 한 빨리 세포 변성을 감지하고 적절한 치료를 시작하기 위해보다 정교한 도구가 필요합니다. 청력 상실에 대한 유망한 약제 처리법 은 시험 관내 에서 균질 세포 배양 물 에서 종종 시험되지만, 그러한 시스템은 달팽이 미세 환경을 정확하게 모델링하지 않습니다. Cochlear 세포는 Corti 10 , 11 또는 Spiral Ganglion Neurons (SGNs) 12 의 기관을 분리하여 또는 배양 할 때 손실되는 중요한 생체 내 과정 인 달팽이관 8,9 에서 다른 세포 유형에 영향을주는 영양 요소를 분비하는 것으로 알려져 있습니다 분자 마커를 분석그러나 &quot;정밀 의학&quot;을 추구하기 위해 생체 외 데이터를 검증하여 청력 상실에 대한 새로운 개인 맞춤 치료법을 확립하는 데 필요한 생체 내 연구는 상당한 자원과 시간을 필요로합니다. 이는 특히 고려할 때 적합합니다 청력 검사와 이어지는 인공 와우의 절개를 통해 중이 중이거나 둥근 창 막 주입을 완벽하게 수행하고 수행하는 데 얼마나 많은 노력이 필요한가 인공 와우로 알려진 체외의 체외 배양에서 유망한 화합물을 효율적으로 스크리닝하는 것은 경제적이며 신뢰할 수있는 대안을 제공합니다 14 , 15 , 16 , 17 . 이 기사에서는 치료 된 달팽이 외식편을 생성, 유지 및 평가하는 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 모델의 특정 응용 프로그램은 심사에서의 사용을 포함하여 강조됩니다.유전자 치료를위한 바이러스 성 벡터의 비교 평가를 포함한다. ex vivo explant approach는 연구자들이 주어진 세포 치료법 이 다른 세포 집단 에 미치는 영향을 그 자리 에서 가시화 할 수있게하여 세포 유형별 메커니즘의 확인과 그 이후의 목표 화 된 치료법의 정제를 용이하게한다. 전반적으로,이 기술은 달팽이관 내 에서 공존하는 매우 다른 세포 유형 사이의 중요한 혼선을 보존하면서 생체 내 에서 달팽이관을 연구 할 수있는 모델을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin, Sodium Salt</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 항체, mouse(IgG1)</td><td>BD Transduction Laboratories</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-Myo7A 항체, rabbit</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>anti-NF-H 항체, chicken</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>anti-PSD95 항체, mouse(IgG2a)</td><td>항체와 관련상품 주식회사</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>항-TuJ1 항체, 마우스</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak 세포 및 조직 접착제, 5mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 15mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, 멸균</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 접시, 100 x 20mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 접시, 35 x 10 mm, 내부 링 4</td>개 <td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 세포 배양 접시, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 50 mL 원심분리기 튜브, 원뿔형 바닥, 눈금, 멸균</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>투명 매니큐어</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>투명 벽 유리 바닥 접시 (유리 40mm), PELCO&reg;, 슬리브 / 20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips, 원형, 유리, 직경 10mm, 두께 #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>증류수, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 고포도당, 피루베이트, 글루타민 없음, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 펜치</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 펜치 (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올 (EtOH), 순수, 200 proof, 무수, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼 (FBS), 인증, USDA 승인 지역, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>50 mL 튜브에 부분 표본을 넣고 -20°C에 보관합니다. C freezer</td></tr><tr><td>염소 항닭-647 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>염소 항마우스(IgG)-568 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>염소 항마우스(IgG1)-568 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>염소 항마우스(IgG2a)-488 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼-488 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, 멸균, EmbryoMax 초순수, 500mL</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution(HBSS), 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음, 500mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 기기 트레이 스테인레스 스틸</td><td>산중탈 의료</td><td>TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 (해부) 칼 &ndash; 각도 30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, VistaVision, 컬러 코드, 75 x 25mm(3 x 1"), 1mm 두께, 흰색,</td><td>72 팩, VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충(100X), 5mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 중탄산나트륨 7.5% 용액, 100mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, 수산화나트륨 용액, 1L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normal Horse Serum (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Operating</td><td>Scissors Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA), 시약 등급, 결정질</td><td>시그마-알드리치</td><td>P6148</td><td>사용 전: 온라인에서 사용 가능한 프로토콜에 기반한 표준 운영 절차를 수립하십시오</td></tr>. <tr><td>PBS, pH 7.4, 500 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>팔로이딘, 알렉사 플루어 568&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>준비 패드, 비멸균&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td><td>사용 전 오토클레이브</td></tr><tr><td>Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Autoclave 사용 전</td></tr><tr><td>메스 블레이드 - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>메스 핸들 - #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000-C 스테레오 현미경</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X(비이온 계면활성제)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield 형광용 퇴색 방지 장착 매체</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>지퍼 백, 재밀봉 가능, 4 x 6'' - 2mm 두께</td><td>의 집라인</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

신생아 쥐의 달팽이관 explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

지난 수십 년 동안 청력 연구가 눈에 띄게 발전했지만, 내이의 민감한 mechanosensory 구조를 손상 시키거나 손상시키는 감각 신경성 청력 손실 (SNHL)에 대한 치료법은 아직 없습니다. 정교한 in vitro 및 ex vivo 분석법이 최근 수년간 출현하여 SNHL 치료법 개발을위한 자원을 최소화하고 치료 노력을 가속화하면서 잠재적으로 치료 화합물의 증가를 시험 할 수있게되었습니다. 특정 세포 유형의 균질 배양이 현재의 연구에서 중요한 역할을 계속하고 있지만, 많은 과학자들은 이제 달팽이 외식 편으로 알려진보다 복잡한 기관 내 배양에 의존합니다. 내이에서 조직화 된 세포 구조를 보존하면 내외부 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런, 신경 세포를 포함한 달팽이관 인프라의 다양한 구성 요소를 현장에서 평가할 수 있습니다.ites 및 지원 세포. 여기에서는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining을 제시합니다. 이러한 explants의주의 깊은 준비는 SNHL에 기여하는 메커니즘의 식별을 용이하게하고 청각 연구 커뮤니티를위한 중요한 도구를 구성합니다.

많은 프로토콜이 Corti 체외 이식편의 기관에 초점을 맞추고 있지만이 기술은 SGNs를 포함하여 전체 달팽이관의 해부학 구조를 보존하려고 시도합니다. 이것은 연구자들에게 Corti 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경 돌기 및 somata에 대한 주어진 치료의 효과를 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 여기에 설명 된 것처럼 모 틸리 움의 일부를 보존하는 절개를 수행하는 것은 Corti만의 기관을 외과 적으로 외과하는 것보다 기술적으로 어렵습니다. 그러나 같은 방법론 19 , 20을 사용하여 2 개의 최근 논문에서 전정 신경초종 분비물 ( 그림 1 )과 세포 외 소포를 적용한 후이 부위에서 유의 한 병리학 적 효과가 관찰 되었기 때문에 신경 돌기와 SGN 영역이 중요합니다. 이러한 변화는 Corti explants의 격리 된 기관을 사용하...

이 프로토콜의 목표는 신생아 생쥐 달팽이 explants의 준비, 문화, 치료 및 immunostaining를 입증하는 것입니다. 이 기술은 청각 연구 에서 체외 선별 도구로 활용 될 수 있습니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

본 절차의 전반적인 목표는 청각 연구의 인비트로(in vitro) 스크리닝 도구로 사용될 신생 마우스 와우 외식편(cochlear explants)의 준비, 배양, 처리 및 면역염색을 수행하는 것입니다. 이 방법은 ex vivo 모델에서 와우 유모세포, 시냅스, 신경돌기 및 뉴런을 동시에 연구할 수 있게 하고, 인체 분비물에서 발견되는 인자를 포함하여 와우에 새롭게 도입된 분자들의 작용 기전에 대한 통찰을 제공함으로써 청각 연구 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 후보 치료 화합물의 스크리닝 과정을 인비보(in vivo) 테스트 전에 가속화할 수 있다는 점입니다.70% ethanol이 담긴 페트리 접시 뚜껑에 보관된 갓 채집한 신생아 머리부터 시작합니다. 메스 날을 사용하여 두개골의 전단에서 후단까지 피부를 얕게 절개합니다. 그다음 양쪽 외이도를 절개하고 피부를 앞쪽으로 젖혀 두개골 전체를 노출시킵니다.다음으로, 달팽이관이 압박되는 것을 방지하기 위해 메스 날을 전방에서 후방으로 부드럽게 위아래로 움직여 시상 봉합선을 따라 두개골을 엽니다. 안와 바로 뒤쪽을 수직으로 절개하여 주둥이 부분을 제거하고 버립니다. 두개골의 후방 부위에는 뇌와 달팽이관이 그대로 남아 있어야 합니다.그 다음 4-forceps를 사용하여 전뇌, 소뇌 및 뇌줄기를 둔탁하게 박리하여 제거합니다. 두개골의 두 반구를 차가운 HBSS가 채워진 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 4-forceps를 사용하여 주변의 등골동맥에 인접한 와우를 완전히 노출시키고, 측두골에서 해당 기관을 둔탁하게 분리합니다.달팽이관을 HBSS가 담긴 50 millimeter 투명 벽 유리 바닥 페트리 접시에 옮기고 접시를 현미경 아래에 배치합니다. 두개골의 나머지 절반이 들어있는 60 millimeter 플라스틱 페트리 접시는 얼음 위에 둡니다. 다음으로, 4개의 핀셋을 사용하여 달팽이관의 이낭(otic capsule)을 조심스럽게 절개합니다.이제 마이크로 나이프나 두 개의 55 핀셋을 사용하여 코르티 기관(organ of Corti)에 부착된 나선인대를 와우의 나머지 부분 및 내측벽으로부터 조심스럽게 분리합니다. 이는 나선인대의 가장 기저부를 잡고 정단부 방향으로 이동하며 부드럽게 풀어냄으로써 수행할 수 있습니다. 나선인대를 제거한 후, 시료를 배치하여 와우의 종단 시상면 뷰를 확보합니다.그 다음 마이크로 나이프를 사용하여 달팽이관을 두 개 또는 세 개의 구역으로 자르고, 이 구역들을 꼭대기 회전(apical turn)과 바닥 회전(basal turn)으로 분류합니다. 달팽이관 절편이 페트리 접시 위에 수평으로 놓일 수 있도록, 꼭대기 쪽 조각은 상단 조직을, 바닥 쪽 조각은 하단 조직을 제거하여 실제 유모세포와 신경돌기 층이 드러나게 합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 코르티 기관(organ of Corti) 바로 위에 위치한 매우 얇고 반투명한 층인 전정막을 조심스럽게 잡아 벗겨냅니다.가장 기술적으로 어려운 단계는 얇고 반투명한 덮개막(tectorial membrane)을 제거하는 과정일 가능성이 높으며, 이는 하부의 유모세포를 쉽게 손상시킬 수 있기 때문입니다. 조직의 가장자리부터 시작함으로써, 덮개막 박리가 시작된 최외곽 부분을 제외하고는 절제편 전체 길이에 걸쳐 유모세포를 보존할 수 있습니다. 마지막으로, 나선신경절 뉴런 바로 위에 위치한 라이스너막(Reissner's membrane)의 양측을 핀셋으로 집어 떼어냄으로써 이를 제거하십시오.가장자리의 손상된 부위를 제거하면 와우 표본을 배양할 준비가 완료됩니다. 외편이 팁 내부에 부착되는 것을 방지하기 위해 1 mL 피펫 팁 끝을 약 120 µL의 DMEM으로 적셔 배양 절차를 시작하십시오. 그런 다음, 미리 적신 팁을 사용하여 유리 바닥 페트리 접시에서 최대 70 µL를 피펫팅하고, 표본을 액체와 함께 4-웰 페트리 접시의 4개 인레이 중 하나에 옮깁니다.현미경으로 관찰하여 외식편이 올바른 방향으로 놓여 있는지 확인하십시오. 와우막이 제거된 유모세포 영역이 위를 향하고, 기저막과 다듬어진 내측 기저부가 아래를 향해 커버스립 인레이에 밀착되었는지 확인하십시오. 여기에서 보는 것처럼 검사 시 표본이 거꾸로 놓여 있다면, 피펫 팁으로 HBSS를 추가하고 조각을 다시 배치하여 방향을 올바르게 잡으십시오.외편물이 올바르게 방향이 잡히면, 과량의 HBSS를 흡입하여 제거한 후 15초 동안 기다립니다. 이제 따뜻한 배양액 60 microliters를 피펫으로 시료 위에 직접 분주하되, 피펫 팁이 시료에 닿지 않도록 주의하십시오. 내부 및 외부 페트리 접시 덮개를 덮고 37 degrees Celsius에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, Petri 접시가 담긴 달팽이관 외식편을 인큐베이터에서 라미나 플로우 후드로 옮깁니다. 인레이에서 FBS가 포함되지 않은 기존 배양액을 흡입하여 제거합니다. 준비된 따뜻한 처리 배지를 웰당 60 microliters씩 추가합니다.배양물을 염색할 때까지 페트리 접시를 인큐베이터에 다시 넣고 최대 7일간 배양합니다. 이 공초점 이미지에서 볼 수 있듯이, 이 기술은 나선신경절 뉴런(SGNs)을 포함한 와우 회전 전체의 해부학적 구조를 보존하여, 코르티 기관뿐만 아니라 SGNs의 신경돌기와 세포체에 미치는 처리 효과를 분석할 수 있게 합니다. 여기에서 보는 바와 같이, 이러한 외식편은 면역형광 염색 후 정단부와 기저부 회전에 미치는 처리 효과를 동시에 비교하는 데 사용할 수 있습니다.모세포는 녹색으로, 신경 구조는 적색으로 표시됩니다. 시냅스 전 단백질(적색)과 시냅스 후 단백질(녹색)을 신경 구조의 염색(청색)과 함께 표지함으로써 온전한 시냅스의 상태를 평가할 수 있습니다. 이 그림은 왼쪽의 3% FBS 또는 오른쪽의 1% FBS 조건에서 7일 동안 배양한 후의 정단부 및 기저부 와우 외식편의 대표 이미지를 보여줍니다.3% FBS에서 배양된 세포들은 유모 세포를 가리키는 연한 회색 화살표와 신경 돌기를 가리키는 빨간색 화살표에서 보이듯이 4일에서 5일 사이에 이동하기 시작합니다. 1% FBS 내의 외식편은 7일까지 조직적 통합성을 유지합니다. 이 절차를 수행할 때는 최종 배양액과 관심 물질을 첨가하기 전에 와우 조직의 구조적 통합성과 방향을 시각적으로 확인하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, medialis 내에서 GFP 발현 세포의 세포 유형 특이적 국소화를 확인하기 위해 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

마우스 내이 (内耳)는 누구의 발달 프로그램의 회임 기간 동안 정교하고 있습니다 placode 파생 감각 기관이다. 우리를...

에 의해 개발 마우스 내이 (内耳)에 진 전송<em&gt; VIVO에서</em&gt; Electroporation

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

우리는 배아 쥐 내이에서 달팽이관 이식의 격리 및 배양을 설명하는 방법을 제시합니다.  또한 구형파 전기천공법을 통해 달팽이관 이식으로 유전자를 전달하는 방법을 보여줍니다. 유전자 전달 기술과 결합된 체외 이식 배양을 통해 연구자들은 발달 중 유전자 발현 변경의 영향을 연구할 수 있습니다.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

동물 모델의 달팽이관에 이독성 물질을 도입하는 다양한 방법이 있습니다. 제시된 것은 이독성 물질을 둥근 창 틈새에 전달하기 위한 수술 프로토콜입니다. 이 절차는 신뢰할 수 있고, 표적화된 달팽이관 내 병변을 생성하며, 마이크로아키텍처에 대한 기계적 손상을 방지합니다. 달팽이관 자가 수리/재생에 대한 검사가 가능합니다.

인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

이 연구에서 우리 신생아 쥐에 있는 내가 유전자 납품에 대 한 신뢰할 수 있는 방법으로 후부 반원의 운하 접근 방식을 설명합니다. 우리 후부 반원의 운하를 통해 유전자 배달 전체 내가 perfuse 수 보여줍니다.

신생아 마우스에서 내가 유전자 납품을 위한 후부 반원의 운하 접근

달팽이 관 임 플 란 트의 동물 모델 영구 난청 전기 자극 치료의 기술 기반 지식을 사전 수 있습니다. 이 연구는 급성 굉음을 쥐 청각 brainstem 응답 기능 평가 있는 전극 배열 인공 와우 이식 수술 프로토콜을 제공합니다.

인공 와우 수술 및 C57BL/6 마우스에 전기 evoked 청각 Brainstem 응답 기록

병아리는 다양한 연구를 위해 비용 효율적이고 접근 가능하며 널리 이용 가능한 모델 유기체입니다. 여기에서는 조류 내이 발달 및 재생의 기초가되는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 일련의 프로토콜이 자세히 설명되어 있습니다.

조류 내이 발달을 연구하는 Ovo 및 Ex Ovo 방법에서

미니어처 돼지(미니 돼지)는 인공와우 연구에 이상적인 대형 동물 모델입니다. 미니 돼지의 인공와우 이식 수술은 인간과 유사한 생체 시스템에서 새로운 전극 어레이 및 수술 접근법의 안전성과 잠재적 성능에 대한 초기 증거를 제공하는 데 활용될 수 있습니다.

미니어처 돼지: 인공와우 연구를 위한 대형 동물 모델

현재 프로토콜은 이전 프로토콜을 업데이트하고 고품질 인공와우 배양을 위한 비교적 간단한 접근 방식을 통합합니다. 이를 통해 살아있는 세포와 고정된 세포에서 신뢰할 수 있는 데이터 수집과 고해상도 이미징을 제공합니다. 이 프로토콜은 내이 세포를 연구하는 지속적인 추세를 지원합니다.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

여기에서, 우리는 마우스에서 일차 달팽이관 유모 세포를 분리하고 배양하기 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 처음에는 Corti의 장기를 현미경으로 신생아(3-5일령) 쥐 달팽이관에서 절개했습니다. 이어서, 세포를 효소에 의해 단일세포 현탁액으로 절단하고, 배양에서 며칠 후에 면역형광을 이용하여 확인하였다.

신생아 마우스의 일차 달팽이관 유모 세포의 분리 및 배양

배우세요 신생아 쥐 달팽이관 explant 기법을 이용한 청력 연구 체외 스크리닝 방법을. 이 기술은 치료제 후보 화합물의 효과를 신속하게 평가하여 청각 상실 연구에 활용됩니다.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로

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