Name: 전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 학습하세요 공초점 현미경을 사용하여 형광 항체로 표지된 거주 CD8 T 세포를 인간 폐 종양 조각에서 실시간 이미징하는 방법을 배우세요. 이 기술은 종양 면역학에서 T 세포 이동성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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피에르 Bourdoncle와 코 친 영상 시설 (인 코 친, 파리) 조언과 지원을 위한 토마스 Guilbert 현미경 감사 하 길. 이 작품은 부분적으로 지원 국가 프랑스 리그 죄수 르 암, CARPEM (맞춤 의학에 대 한 암 연구)에 의해에서 교부 금에 의해 Fondation 드 프랑스와 부여에서 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 계약 없음 667980 (캐럿)입니다.

인간의 종양 계약 프랑스 윤리 위원회의 및 프랑스 법률의 기사 L.1121-1 응용 프로그램에서 지원 Publique-Hôpitaux 드 파리 (AP-HP)에 의해 얻은 했다. 서 면된 통지 해준 동의 연구에 포함 하기 전에 환자 로부터 얻은 것입니다.
1. 인간의 폐 종양을 얻기
<ol>
	<li>그들의 폐 종양4의 완전 한 외과 절제술 수술 단계-III 비 작은 세포 폐암 환자에서 신선한 폐 종양 샘플을 가져옵니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI 1640) 매체를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 고정 되지 않은 신선한 종양을 전송 합니다. 2.7 단계까지 30 분 동안 얼음에 따로 설정 합니다. 참고: 종양은 오후에 받으면 넣어 하룻밤에 4 ° C 및 프로세스는 다음 날에. 이 경우 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 보충.</li>
</ol>
2. Agarose 포함 하 고 vibratome 인간의 폐 종양의 슬라이스
참고: 무 균 조건 하에서 2.10까지 모든 단계를 수행 합니다.
<ol>
	<li>1 g 낮은 녹는 포인트 agarose 인산 버퍼 (PBS) 염 칼슘 및 마그네슘의 살 균 20 mL에 용 해 하 여 포함 5 %agarose 솔루션을 준비 합니다. 이 솔루션을 마이크로파는 agarose는 완전히 녹아 때까지. 37 ° C에서 37 ° C에서 5 분 동안 인큐베이터에 솔루션을 배치 하 여 냉각 agarose를 허용 합니다.</li>
	<li>조직 문화 후드, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 4 m m L 글루타민 그리고 페니실린과 스 x 1 (페 놀 레드) 없이 완전 한 RPMI 1640 매체를 준비 합니다.</li>
	<li>6 잘 셀 문화 접시에 잘 당 1.1 mL 전체 RPMI 1640 매체를 추가 하 고 각 우물에서 30 mm 셀 문화 삽입 장소. 정해 접시 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 단계 2.12까지.</li>
	<li>장소는 35 m m 플라스틱 접시 가득 RPMI 완전 한 매체에에서 스테인리스 플랫 와셔 (내경 5 mm, 10 mm의 직경 및 두께 1 mm의 외부의)을 멸 균. 와셔는 vibratome 컷 슬라이스에 항 체를 집중을 더 사용 됩니다.</li>
	<li>10 cm 플라스틱 접시에 종양 생 검을 놓고 약 5 x 5 m m 길이의 작은 큐브 모양 조각으로 날카로운 블레이드와 종양을 잘라.</li>
	<li>인큐베이터에서 agarose를 꺼내와 35 m m 플라스틱 그릇에 솔루션을 붓는 다.</li>
	<li>집게의 쌍을 사용 하 여 신중 하 게 매체의 초과 제거 하는 조직 없애 종양 조각을 전송. agarose 조각을 삽입 하 고 플라스틱 접시의 바닥에 그들을 배치. Agarose 젤을 강화 하기 위해 5 분 동안 얼음에 둡니다.</li>
	<li>일단는 agarose 굳은 플라스틱 접시를 반전 하 고 전체 젤을 주걱을 사용 하 여.</li>
	<li>날카로운 블레이드를 사용 하 여 주변 조직 주위 젤의 3-5 m m를 떠나는 종양 조각 초과 agarose 트림.</li>
	<li>비-독성 부 틸 cyanoacrylate 조직 접착제의 방울으로는 vibratome의 견본 디스크에 각 agarose 블록을 탑재 합니다. 살 균 얼음 처럼 차가운 PBS를 가진 vibratome 버퍼 트레이 표본 디스크 트레이에 설치.</li>
	<li>잘라내기는 agarose 350 µ m 두꺼운 조각으로 조직 포함. Vibratome 설정을 느린 범위 속도 조정 (0.2-0.3 m m/s)와 진동 주파수는 중간 범위 (1.5 m m)에서.</li>
	<li>절단 되 고 6 잘 플레이트 (2.3 단계)의 셀 문화 삽입에 평평 넣어 종양 조각 수집 신중 하 게 미세 집게를 사용 하 여. 1 조각에 각 삽입 전송. 주의 사용 하 여 쉽게 파손 될 수 있으므로 분할 영역을 처리할 때.</li>
	<li>미세 집게를 사용 하 여 각 개별 슬라이스에 스테인레스 스틸 와셔를 놓습니다. 와셔 종양 조직을 둘러싼 agarose 잘 배치는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>5% CO2 습도 인큐베이터 immunostaining 10 분 진행에 대 한에서 37 ° C에서 문화 접시를 유지 합니다.</li>
</ol>
3. 거주 CD8 T 세포와 종양 세포의 Immunostaining
<ol>
	<li>항 체 (최종 농도 10 µ g/mL)와 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 핵 염료 (최종 농도 1 µ g/mL)을 희석. 참고: 사용 붙일 결합 안티-CD8 (murine IgG SK1 복제) 및 안티-EpCAM (상피 세포 접착 분자) (murine IgG 좋음-125) 레이블을 CD8 T 세포 및 종양, 상피 세포 각각에 항 체. 레이블 섬유 아 세포와 활성화 된 내 피 세포 항 체 붙일 결합 안티-CD90/Thy1 (murine IgG, 클론 5E10)를 사용 합니다. 사용 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 조직 생존 능력을 평가 하기 위해 손상 된 원형질 막 세포의 핵을.</li>
	<li>인큐베이터에서 배양 배지를 제거 하 고 스테인레스 스틸 와셔 내부 액체를 발음 하는 피 펫을 사용 하 여. 1.1 mL RPMI 1640 미디어 셀 문화 삽입 (2.3 단계) 아래에 배치 제거 하지 마십시오.</li>
	<li>슬라이스를 만지기 없이 피 펫 팁을 사용 하 여 각 종양 조각에 항 체를 포함 하는 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>항 체 얼룩이 지기 수 있도록 15 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
	<li>좋은 집게, 와셔를 제거, 조각, 및 딥 그들 10의 RPMI 1640 미디어 페 놀 레드 없이 밖으로 데리고. 다시 셀 문화 삽입에 분할 영역을 배치 하 고 페 놀 레드 무료 RPMI-1640의 한 방울을 추가 각 개별 슬라이스에 중간. 이미징에 37 ° C 10 분 진행에서 접시를 유지 합니다.</li>
</ol>
4. 상상 하 고 인간 폐 종양 조각 내 거주 CD8 T 세포 마이그레이션 분석
참고:이 프로토콜에서 사용 하는 confocal 현미경은 물 침수 목표 x 25를 장착 하는 디스크를 회전 하는 직 립 (25 x / 0.95 없음).
<ol>
	<li>현미경 설치 준비<ol>
		<li>이미징 세션을 시작 하기 전에 몇 시간 37 ° C에서 현미경 열 챔버의 온도 설정 합니다.</li>
		<li>설정 시스템을 지속적으로 perfuse와 종양 조각 산소 (5% CO2, 95% O2) 페 놀 레드 무료 RPMI 매체 (그림 1). 연동 펌프를 사용 하 여 이미징 챔버로 관류 미디어 흐름 쓰레기 플라스 크에 대 한 해결책을 발음.</li>
		<li>관류 튜브를 통해가 서 산소 솔루션 수 있도록 연동 펌프를 실행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>좋은 집게와 6 잘 플레이트 및 전송 35 m m 플라스틱 접시를 가득 페 놀 레드 무료 RPMI 매체에서 슬라이스를 꺼내. 2 mm 간격 스레드 19.7 m m 직경 슬라이스 앵커와 슬라이스 무력화 현미경의 이미징 단계에 페 트리 접시를 놓습니다. 관류 시스템의 입구 및 출구 팁을 연결 합니다. 켜고 관류 시스템 0.8 mL/min로 미디어 흐름 속도 설정 합니다.</li>
	<li>물 침수 목표는 슬라이스를 낮춥니다. 밝은 분야 빛 조각 위에 초점.</li></ol>적절 한 형광등을 사용 하 여, CD8 T 세포, 종양 독도 (EpCAM 양수)와 기질 (CD90 양수)를 포함 하는 관심의 영역을 선택 합니다. 조직에 DAPI 잘라 표면에 얼룩과 깊이 평가 하 여 슬라이스 내의 세포의 생존 능력을 확인 합니다. 참고: 건강 한 조각 잘라 표면에서 몇 미크론에서 DAPI 긍정적인 세포의 단지 소수 민족을 포함합니다.
	<li>다음 작업으로 이미징 세션을 설정 합니다.<ol>
		<li>3 fluorophores의 형광 신호 강도 따라 20 ~ 40% 사이 레이저 강도 50 ~ 800 ms 사이의 노출 시간을 설정 합니다.</li>
		<li>Z 스택 두께 종양 조각 내에서 이미지를 선택 합니다. 참고: 여기, 10-12 광 평면 z 차원에서 60-70 µ m의 총 깊이 확장 했다 점령.</li>
		<li>첫 번째 레이블이 CD8 T 세포 아래 약 10 µ m에서 시작 위치를 선택 합니다.</li>
		<li>10 ~ 30 사이 각 z 스택 이미지 사이의 시간 간격을 정의 s와 10 ~ 30 분 사이 총 녹화 시간.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>참조4에 설명 된 대로 주민 CD8 T 세포 마이그레이션 분석.<ol>
		<li>추적 소프트웨어를 데이터를 가져온 후 필드에 각 CD8 T 세포에 대 한 관광 명소를 만듭니다. 셀의 직경 및 탐지 군데 형광 세포에 따라 임계값을 조정 합니다.</li>
		<li>트랙을 검사 하 고 그들을 삭제 하 여 무관 한 트랙을 제거 합니다. 연결 하 고 다른 트랙과 같은 트랙의 다른 시간 점에 분리 하 여 올바른 추적 합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 (트랙 속도, 트랙 변위 길이) 데이터를 내보냅니다.</li>
	</ol>
	</li>

<ol><li>Asperti-Boursin, F., Real, E., Bismuth, G., Trautmann, A., Donnadieu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-+independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase- independent manner.</a> J Exp Med. 204 (5), 1167-1179 (2007).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+T+cells+in+murine+lymph+node+slices+with+widefield+and+confocal+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of T cells in murine lymph node slices with widefield and confocal microscopes.</a> J Vis Exp. (53), e3054(2011).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+architecture+defines+the+preferential+localization+and+migration+of+T+cells+into+the+stroma+of+human+lung+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Matrix architecture defines the preferential localization and migration of T cells into the stroma of human lung tumors.</a> J Clin Invest. 122 (3), 899-910 (2012).</li>
<li>Bougherara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+of+Resident+T+Cells+in+Human+Lung+and+Ovarian+Carcinomas+Reveals+How+Different+Tumor+Microenvironments+Control+T+Lymphocyte+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging of Resident T Cells in Human Lung and Ovarian Carcinomas Reveals How Different Tumor Microenvironments Control T Lymphocyte Migration.</a> Front Immunol. 6, 500(2015).</li>
<li>Mandal, R., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+Oncology+Meets+Immunology%3A+The+Path+toward+Precision+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Personalized Oncology Meets Immunology: The Path toward Precision Immunotherapy.</a> Cancer Discov. 6 (7), 703-713 (2016).</li>
<li>Wolchok, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+plus+ipilimumab+in+advanced+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma.</a> N Engl J Med. 369 (2), 122-133 (2013).</li>
<li>Vaira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+model+of+organotypic+culture+for+pharmacodynamic+profiling+of+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8352-8356 (2010).</li>
<li>Rashidian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of immune responses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (19), 6146-6151 (2015).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen-based+cell+migration+models+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 931-941 (2009).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Joyce, J. A., Fearon, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exclusion%2C+immune+privilege%2C+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell exclusion, immune privilege, and the tumor microenvironment.</a> Science. 348 (6230), 74-80 (2015).</li>
<li>Gerlach, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slice+cultures+from+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%3A+a+novel+test+system+for+drug+susceptibility+and+mechanisms+of+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance.</a> Br J Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).</li>
<li>Holliday, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+practicalities+of+using+tissue+slices+as+preclinical+organotypic+breast+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models.</a> J Clin Pathol. 66 (3), 253-255 (2013).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언.

Confocal 현미경을 사용 하 여 보존된 종양 환경에서 인간의 폐 종양 조각 및 거주 CD8 T 세포의 동적 행동의 평가 생성 하기 위한, 빠르고, 간단 하 고 강력한 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜은 murine 림프 노드 조각2에 도금 된 T 세포의 모니터링에 대해 설명 하는 이전 정돈 문서 상세입니다.
형광 염료의 표백 fluorescein isothiocyanate phycoerythrin 같은 1 세대 염료와 특히 고려 되어야 한다. 우리는 직접 결합 된 항 체의 발음된 photobleaching 2 광자 현미경으로 발생 한 것을 발견. 반대로, 최소한의 photobleaching는 confocal 현미경, 특히 최근 개발 된 밝은 형광 염료를 사용 하 여 함께 발견 되었다.
항 체는 상대적으로 큰 분자 고 따라서 조직으로의 침투 더 어려울 수 있습니다. 이 단계는 부 화 시간이 증가 하 여 개선할 수 있습니다. 또한, 작은 사용 좋은 대안 항 체 나타냅니다의 시 약 같은 직접 커플링 Fab 조각 얼룩.
이 프로토콜에서 설명 하는 모든 항 체 이전 유효성을 검사 하 고 되었습니다 밝은 얼룩4를 생산 알려져. 따라서, isotype 컨트롤이 필요 하지 않습니다. 그러나, 다른 항 체를 사용 하 여이 메서드를 수정 원하는 경우 다음 isotype 제어 항 체의 사용이 좋습니다.
이 실험적인 시스템 몇 가지 한계를 선물 한다. 절단 절차 CD8 T 세포, 특히 절단된 표면 근처의 동작에 영향을 미칠 수 있습니다 조직을 손상 됩니다. 또한, 수용 성 요인 (예: 발산) T 세포의 이동 제어에 손실 될 수 있습니다. 아마도 건강 한 지역 조직의 표면에서 미크론의 몇몇 10에 있는 T 세포를 모니터링 하 여 이러한 문제를 무시 하는 한 방법이입니다. 게시 된 실험 공개 T 세포 조직 내의 깊은 지역화 지역화4컷된 표면 근처 T 세포 보다 더 적극적으로 마이그레이션할. 우리는 우리의 연구 confocal 현미경을 사용 하지만 가능성이 두 광자 현미경 깊이에 공간 해상도 증가 합니다.
이 이렇게 되지 않는 중립 분자는 붙일 결합 항 체의 사용에 의존 합니다. 전체 크기의 항 체는 다른 방법으로 T 세포의 정상적인 작동에 영향을 미칠을 따르게 됩니다. 첫째, 안티 CD8 항 체 림프 구의 골격에 영향을 미치는 수는 세포내 신호 폭포를 실행 하 여 마이그레이션 T 셀을 변경할 수 있습니다. 둘째, 안티-CD8 항 체 CD8와 MHC 사이 상호 작용을 조절 수 종류 I 분자, 항 원 인식 과정에서 중요 한 단계. 셋째, 그대로 항 체 Fc 수용 체는 종양에서 분산 고 따라서 많은 골수성 세포에 의해 표현 일반적인 신호 증가를 바인딩할 수 있습니다. 우리는 같은 문제에 영향 받는 우리의 데이터 표시 아마 거주 골수성 세포의 Fc 수용 체, 세포 문화에, 달리 포화 면역 글로불린 종양 환경 내에서 존재 하기 때문에. 실제로, 라벨링 절차, 무료 Fc 수용 체를 차단 하 알려져 있는 과정 동안 혈 청의 추가 immuno 얼룩이 지를 변화 하지 않았다. 그럼에도 불구 하 고, 항 체, 항 체로 서 Fc 지역에 없는 Fab 조각 그들의 Fc 지역에 돌연변이 camelid 파생 된 항 체 파편8 대표 형광 추적기와 주민 셀을 추적 하기 위해 다른 대안 전략.
지난 수 십년 동안 여러 모델 시스템 개발 고 T 림프 톨의 실시간 이미징에 대 한 사용 되었습니다. T 세포 이전 정화 하 고 교양으로 항 원 제시 세포의 체 외에 준비 포함 됩니다. 이러한 준비 놀라운 진행의 항 원 인식 및 응답 메커니즘을 정의할 수 있다. 그러나, 그들은 조직 환경의 복잡성을 부족합니다. 다른 준비는 더 밀접 하 게 기본 조직 구조 모방 설치 되었다. 예를 들면, 정화 T 셀에 3 차원 콜라겐 젤 매트릭스 되었습니다 포함, reaggregated 조직 파편 형광 이미징 기술9와 T 림프 톨의 동적 동작을 모니터링 하는 데 사용 되었습니다의 문화 뿐만 아니라 . 이 시스템 기본 조직에 가까운 아키텍처의 장점을 제시 하지만 그들은 다른 중요 한 세포 및 녹는 요소 부족. 마우스, 두 광자 intravital 현미경 그대로 기관10의 진정으로 생리 적인 환경에서 T 셀을 추적 하기 위해 고용 되었다. 그러나, 이러한 접근을 설정 하려면 기술적으로 어렵습니다. 또한, 마우스 모델 인간의 생리와 함께 주목할 만한 차이 보여줍니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 기술을 공동 문화 연구 및 동물 모델 사이의 중요 한 링크 역할을 고유 하 게 배치 된 복잡 한 다중 세포 종양 환경을 나타냅니다.
여기에 설명 된 프로토콜 CD8 T 세포 항 체 생성 된 보다 다른 세포의 운동 성을 추적 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 기술은 다른 인간과 murine 종양 및 조직에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 신선한 인간의 편도 선에 안티 CD19 항 체와 함께 실시간으로 B 세포의 역학 표시 된 이미지를 수 있다.
이 프로토콜에서 설명 하는 기술은 치료 분자 조직에서 T 세포 운동 성 제어에 대 한 화면을 수 있습니다. 문화 시스템의 접근 허용 일부 약리 시 약을 적용 하 고 T 세포 이동에 그들의 결과 테스트 합니다. 그것은 지금 종양 성장, CD8 T 세포 전시 낮은 마이그레이션 허용 하 고 종양 세포11과 접촉을 감소. 중요 한 것은, 종양 세포 지역에서 T 세포의 부족 한 존재 나쁜 결과와 연결 되어 있으며 T 세포 기반 암 immunotherapy에 저항 메커니즘 중 하나 간주 됩니다. T 세포 종양에 이주를 제한 하는 여러 장애물 밀도 기질을 포함 하 여 확인 되었습니다. 이 점에서 분자 T 세포 운동 성 및 악성 세포와 상호 작용 수의 식별 암 immunotherapy에서 중요 한 단계를 나타냅니다. 이전 연구에서 우리는 심하게 인간의 폐 조각에 적용 하는 콜라와 함께 콜라겐의 부분 저하 종양 세포와 T 세포의 접촉을 향상 발견.
마지막으로, 몇 일7,,1213 까지 대 한 문화에서 인간의 종양 조각 유지 가능성 T 세포와 immunotherapy의 기간에서 유망한 응용 프로그램의 수를 제공 합니다.그러나, 긴 기간 문화 중 모델 시스템의 안정성은 철저 하 게 평가 하는 중요 한 매개 변수.
신선 하 고 건강 한 조직을 얻는 품질 조각의 좋은 immunostaining와 CD8 세포, 종양 세포와 기질 요소를 생산 하는 중요 한 요소 이다. 종양 생 검 처리 하기 전에 4 ° C에서 유지 하는 것이 중요 합니다.
좋은 집게와 조각의 처리가이 프로토콜 내에서 또 다른 중요 한 단계를 나타냅니다. 이 agarose는 쉽게 손상 될 수 있습니다로 큰 관심과 함께 수행 되어야 한다. agarose에서 컷 인감 스테인리스 세탁기 결과 솔루션을 포함 하는 항 체의 누설에 의해 손상 됩니다.

CD8 T 세포는 암에 대 한 전투에서 핵심적인 역할을 재생. 그러나, 많은 진압 메커니즘 악성 세포를 죽이에서 T 세포를 방지 합니다. 지난 년 동안 T 세포에 브레이크를 해제 하는 몇 가지 유망한 전략 개발 고 클리닉5에 사용 되었습니다. 상당한 관심을 유지 하는 두 가지 접근은 면역 검사점을 대상으로 안티-PD-1 및 입양 T 세포 치료 등 항 체. 그럼에도 불구 하 고, 최근 성공에도 불구 하 고 환자의 일부만 혜택을 이러한 치료6. 주요 도전 더 효율적인 치료를 개발 하기 위하여 암 immunotherapy 저항 메커니즘을 식별 하는 것입니다. 또 다른 도전 어떤 소설에서 치료 특징 및 테스트할 수 그들의 힘 및 안전에 대 한 모델 시스템을 개발 하는 것입니다. 지금까지,이 분석 실험의 대부분은 체 외에서 세포 배양 시스템을 제대로 종양 조직의 복잡성을 모방 기반으로 합니다.
그것은 원래 조직 microenvironment7보존 조직 조각 비보 전 유망 기술입니다. 년 동안, 우리는 다양 한 조직에서 T 세포의 역학을 추적할이 접근 방식을 설정 했습니다. 우리의 결과 murine 림프 노드 조각 꼭대기 추가 붙일 레이블이 T 세포 조직으로 마이그레이션할 그들의 적절 한 microenvironmental 신호1,2응답 나타냅니다. 마찬가지로, 인간의 폐 종양 조각에 중첩 하는 T 림프 톨은 급속 하 게 종양 기질3으로 보충 했다. 이 기술을 사용 하 여, 우리 인간의 종양3,4내 T 세포의 마이그레이션 및 배포를 제어에서 중요 한 요소로 세포 외 기질을 확인 했습니다. 정화 하는 ex vivo의 동작 때문에 도금 된 T 세포는 반드시 주민 intratumoral T 림프 톨의 동작을 반영 하지 않는다, 우리 최근이 접근4세련 되는.
여기는 신선한 인간의 폐 종양에서 만든 조각 내 거주 T 세포를 추적 하는 프로토콜에 설명 합니다. 신선한 종양, 슬라이스와의 모니터링에서 형광 항 체와 T 세포 내 생의 얼룩 조각의 인간의 폐 종양 (를 포함 하 여 agarose 포함 및 vibratome 포함 된 조직의 단면), 준비의 다른 단계 구성 confocal 현미경이 셀.

<table><tbody><tr><td>직립 컨포칼 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td>회전 디스크 컨포칼의 사용을 권장합니다</td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>Bitplane</td><td></td><td>이 소프트웨어는 이미지 시각화 및 T 세포 이동 추적에 사용됩니다</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Fine Prounded</td><td>World Precision Instruments</td><td>14142</td><td></td></tr><tr><td>30 mm Culture Insert</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 배지, GlutaMAX 보충제</td><td>ThermoFisher</td><td>61870010</td><td>Complete RPMI-medium은 10% 열 비활성화 태아 송아지 혈청과 페니실린/스트렙토마이신</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td>를 첨가하여 만들어집니다. <td>ThermoFisher</td><td>20012019</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)</td> <td>Invitrogen</td><td>14170088</td><td></td></tr><tr><td>낮은 겔화 온도 아가 로스, 유형 VII-A</td><td>시그마 -알드리치</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>무독성 부틸 시아 노 아크릴 레이트 접착제, Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 앵커, 19.7 직경, 2mm 간격 나사</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1415</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 와셔, 내경 5mm</td><td>아마존</td><td></td><td></td>B004K1FDGQ</tr><tr><td>BV605-conjugated anti-CD8 (clone SK1)</td><td>BD Biosciences</td><td>565289</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-EpCAM (clone HEA-125)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-113</td><td></td></tr><tr><td>BV510-conjugated anti-CD90 (clone 5E10)</td><td>Biolegend</td><td>328125</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 cd8 t 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 confocal 현미경 검사 법

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T 세포는 암과의 싸움에서 중요 한 선수. CD8 T 세포 종양 세포를 죽 일에 대 한 종양에 입력 하는 데 필요한, 종양 microenvironment 내에서 이동 하며 종양 항 원에 적절 하 게 응답. 2 광자 현미경 등 향상 된 이미징 접근의 최근 개발 및 강력한 마우스 종양 모델의 사용 항 종양 T 세포 활동을 조절 하는 메커니즘의 일부에 빛을 발산 했습니다. 반면 이러한 시스템은 귀중 한 통찰력을 제공, 그들은 항상 인간의 응답을 예언 하지 않는다. 인간에 분야에서 우리의 지식을 주로 생체 외에서 연구 뿐만 아니라 인간 환자에서 고정된 종양 샘플의 설명에서 온다. 그러나, 생체 외에서 모델 복잡 한 3 차원 종양 주위 부족 그리고, 따라서, 생체 내에서 의 불완전 한 근사 T 세포 활동. 신선한 조각 explanted 조직에서 만든 공동 교양된 연구 및 동물 모델 사이의 중요 한 링크 역할을 할 수 있는 복잡 한 다중 세포 종양 환경을 나타냅니다. 원래 murine 림프절1 에서 설정 하 고 이전 정돈 제2에 설명 된,이 이렇게는 지금 인간의 종양 도금된3 뿐만 아니라 거주 T 세포4의 역학 검사로 조 변경 되었습니다 있습니다.
여기, 인간의 폐 종양 조각 준비, 주민 CD8 T와 종양 세포의 immunostaining 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 종양 microenvironment 내에서 CD8 T 림프 톨의 추적에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 시스템은 고유 하 게 종양에서 T 셀 마이그레이션 좋아하는 소설 immunotherapy 에이전트에 대 한 화면에 배치.

인간의 폐 종양은 일반적으로 매우 우선적으로 기질3,4에서 발견 되는 CD8 T 세포에 침투 됩니다. 이 프로토콜에 따라 한 인간의 폐 종양 조각에 CD8 T immunostained의 많은 수를 시각화를 기대 해야 한다. 안티-EpCAM 및 안티 CD90 항 체와 공동 레이블 영역과 stromal 종양 독도 윤곽을 그리 다 허용 해야 합니다. 원 콜라겐, 종양 기질에 풍부한 외 인 2 광자 현미경3,4에 두 번째 고조파 생성을 사용 하 여 얼룩 없이 구상 될 수 있다. 참고 일부 인간의 폐 종양 종양 독도 기질 사이 명확한 구별을 제시 합니다. 이러한 종양 세포 괴 사 항 체의 비 특정 바인딩 및 DAPI 얼룩 식별의 넓은 영역을 제시 하는 견본 뿐만 아니라 폐기 해야한다. 게시 된 결과와 일치 인간의 폐 및 난소 carcinomas, 주민 CD8 T 세포는 더 집중 종양 독도4에 비해 기질에서. 종양 세포과 CD90 CD8 T 세포 분포의 대표적인 예는 그림 2에 표시 됩니다.
분할 영역 분석 결과 다른 종양 지역에서 주민 T 세포 운동 성 분석에 대 한 수 있습니다. 다른 지역에서 CD8 T 세포 운동 성 비교에 대 한 유용한 기준 평균 속도 (경로 길이 샘플링 기간으로 나눈 값) 등 변위 길이 (시작 및 끝 트랙의 사이 벡터). 비록 종양 독도에 부족, CD8 T 세포 기질 (그림 3)에 비해이 구획에 더 적극적으로 마이그레이션합니다. 평균, 개별 CD8 T 세포의 평균 속도 4 µ m/min 높은 내부 및 간 종양 variabilities4종양 기질에 가까이 있어야 한다. 종양 기질에 거주 하는 T 세포의 운동 성 밀도 기질 섬유3,4의 방향에 의해 강하게 좌우 된다. 성공적인 실험 느슨한 행렬 영역, 게시 결과3,4일치에 비해 고밀도 매트릭스 지역에 적은 T 세포에서 발생 합니다.
Note는 어떤 인간의 폐 종양 전시 제외 거주 T 세포의 영상 autofluorescence의 매우 높은 수준. 이러한 기능은 빠르게 이미징 세션의 시작 부분에서 관찰 됩니다. Autofluorescent 종양을 폐기 해야한다. Autofluorescent 종양에 거주 CD8 T 세포의 대표적인 예는 그림 4에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig1.jpg"> 
그림 1: 관류 시스템의 사진. A) 페 놀 레드 무료 RPMI 솔루션 5% C02, 95% O2농축입니다. B) 솔루션은 다음 연동 펌프에 의해 끼얹는다. C) RPMI 솔루션 입구를 통해 문화 접시를 입력합니다. 소켓, 솔루션 폐기물 용기에 약 실에서 펌프에 의해 발음은. 참고 포부 팁 솔루션 높이 결정 하는 수준에서 설정 됩니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig2.jpg"> 
그림 2: 거주 CD8 T의 분포는 인간의 폐 종양에서 세포. 인간의 폐 종양 조각의 대표 이미지 스테인드 CD8 (녹색), 대 한 EpCAM (파란색)와 CD90 (빨간색). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig3.jpg"> 
그림 3: 주민 CD8 T의 운동 성 세포는 인간의 폐 종양에. 개별 주민 CD8 T 세포 실질 (레드)와 인간의 폐 암 조각의 종양 세포 (파란색) 지역에서 궤도 슬라이스 표시 된 항 체로 얼룩진 고 confocal 현미경으로 20 분 대 한 군데. Fibrillary 콜라겐 2 광자 현미경에 두 번째 고조파 생성 (SHG)를 사용 하 여 끝에 검색 되었습니다. 트랙은 CD8 T 세포 변위 길이 따라 색상으로 구분 됩니다. 이 이미지는 4에서 수정 되었습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55709/55709fig4.jpg"> 
그림 4: autofluorescent 인간 폐 종양의 대표 이미지. 종양 조각 (파란색) CD8 (녹색) 및 EpCAM 얼룩 했다. SHG 신호는 빨간색에서 이다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55709/55709fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

본 절차의 전반적인 목적은 공초점 현미경을 사용하여 인간 폐 종양 슬라이스 내에서 형광 결합 항체로 표지된 상주 종양 침윤 CD8 T 세포를 이미징하는 것입니다. 이 방법은 인간 종양 내 T 세포 이동을 긍정적으로 또는 부정적으로 조절하는 요소의 특성과 같은 종양 면역학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 보존된 인간 종양 환경에서 상주 CD8 T 세포의 일일 행동을 모니터링할 수 있다는 점입니다.우리는 2011년 JoVE에 처음 발표된 프로토콜인, T 세포를 추적하기 위해 Myrin 림프절에 이 방법을 확립하고 이를 슬라이스 위에 배양했던 경험에서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 먼저, 용기에 저융점 아가로스 1 g을 넣고, 멸균된 칼슘 및 마그네슘 제거 PBS 20 mL를 추가합니다. 용액을 전자레인지로 가열하여 아가로스를 완전히 녹입니다.이 5% agarose 용액을 37°C 인큐베이터에서 5분 동안 식힙니다. 조직 배양 후드 내에서, 6웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 완전 RPMI-1640 배지 1.1 mL를 넣습니다. 그 다음, 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 30 mm 세포 배양 인서트를 각 웰에 배치합니다.플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양하여 나중에 사용합니다. 다음으로, 종양 생검 조직을 10 cm 플라스틱 접시에 놓고, 날카롭고 멸균된 칼날을 사용하여 종양을 약 5 x 5 mm 크기의 작은 정육면체 모양 조각으로 자릅니다. 이제 인큐베이터에서 준비된 아가로스 용액을 꺼냅니다.멸균된 핀셋을 사용하여 종양 조각을 조직 와이프로 조심스럽게 옮겨 과량의 배지를 제거한 다음, 35 millimeter 플라스틱 디쉬에 아가로스를 붓고 종양 조각이 플라스틱 디쉬 바닥에 위치하도록 삽입합니다. 아가로스 젤을 얼음 위에 5분 동안 두어 응고시킵니다. 아가로스가 응고되면 플라스틱 디쉬를 뒤집습니다.스패출러를 사용하여 겔 전체를 꺼냅니다. 날카로운 칼날을 사용하여 종양 조각 주변의 과잉 아가로스를 다듬고, 조직 주변에 3~5 mm의 겔을 남깁니다. 무독성 조직 접착제 한 방울을 사용하여 아가로스 블록을 바이브라톰의 시편 디스크에 고정합니다.vibratome 버퍼 트레이에 멸균된 얼음처럼 차가운 PBS를 채우고, agarose 블록이 담긴 시료 디스크를 트레이에 설치합니다. vibratome의 속도와 빈도를 원하는 값으로 설정합니다. vibratome 설정이 완료되면 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 꺼냅니다.이제 바이브라톰(vibratome)을 사용하여 고정된 블록을 350 micron 두께의 절편으로 자르기 시작합니다. 세밀한 핀셋을 사용하여 절단되는 종양 절편을 조심스럽게 수집하고, 6-웰 플레이트의 세포 배양 인서트 위에 평평하게 놓습니다. 각 인서트 위에 절편을 하나씩 옮깁니다.다음으로, 미세 핀셋을 사용하여 멸균 및 습윤 처리된 스테인리스 스틸 와셔를 각 슬라이스 위에 배치합니다. 와셔가 종양 조직 주변의 아가로스 위에 정확하게 위치하도록 확인하십시오. 면역염색을 수행하기 전, 습윤 상태의 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 °C로 10분 동안 방치합니다.필요한 형광 표지 항체와 형광 핵 염색약인 DAPI를 Phenol Red가 없는 RPMI 배지에서 필요한 최종 농도로 희석합니다. 다음으로, 배양 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고 미세 팁을 사용하여 스테인리스 스틸 와셔 내부의 액체를 흡입하여 제거합니다. 이제 슬라이스에 닿지 않도록 주의하며, 각 종양 슬라이스 위에 희석된 항체 40 µL를 첨가합니다.염색이 가능하도록 플레이트를 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 염색 단계가 완료되면 미세 핀셋을 사용하여 와셔를 제거합니다. 그런 다음 슬라이스를 조심스럽게 꺼내 Phenol Red가 없는 RMPI-1640 배지에 10초 동안 담급니다.절편들을 세포 배양 인서트 위에 다시 놓고, 각 절편 위에 Phenol Red가 없는 RMPI-1640 배지를 한 방울씩 추가합니다. 플레이트를 37 °C에서 10분 동안 배양한 후, 이미징 단계를 진행합니다. 본 실험을 시작하기 몇 시간 전에 현미경 가열 챔버의 온도를 37 °C로 설정하고, 산소화된 Phenol Red free RMPI 배지가 종양 절편에 지속적으로 공급되며 연동 펌프를 통해 용액이 폐액 수집 플라스크로 흡입되도록 현미경 설정을 준비합니다.미세 핀셋을 사용하여 염색된 절편을 6웰 플레이트에서 들어 올려 Phenol Red가 없는 RMPI 배지가 채워진 35mm 플라스틱 디쉬로 옮긴 후, 절편 위에 슬라이스 앵커(slice anchor)를 놓아 고정합니다. 다음으로, 이 페트리 디쉬를 현미경의 이미징 스테이지 위에 놓습니다. 관류 시스템의 유입구와 유출구 팁을 연결한 후, 연동 펌프를 작동시켜 산소화된 배지가 관류 튜브를 통해 흐르도록 합니다.수침 렌즈를 슬라이스까지 내린 후, 명시야 조명 또는 적절한 파장의 빛을 사용하여 슬라이스의 상단에 초점을 맞춥니다. 그다음, 적절한 필터를 사용하여 관심 대상인 형광 표지 세포들, 즉 CD8 T 세포, 종양 소절(tumor eyelets) 및 CD90 양성 기질 세포가 모두 포함된 관심 영역을 시각화하고 선택합니다. 관찰된 형광 신호의 밝기에 맞춰 적절한 레이저 강도와 노출 시간을 설정하여 이미징 세션을 구성합니다.그런 다음 종양 슬라이스 내부를 촬영할 수 있도록 Z-stack 두께를 설정하십시오. 다음으로, 특정 시간 간격으로 이미지를 캡처하기 위해 Z-stack 이미지 시간 간격과 총 녹화 시간을 선택하십시오. 형광 이미지를 캡처하고 내보낸 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 CD8 T 세포 이동을 분석하십시오.여기에 염색된 인간 폐 종양 절편의 대표 이미지가 제시되어 있습니다. 녹색으로 염색된 CD8 양성 T 세포, 청색으로 염색된 상피세포 접착 분자(epithelial cell adhesion molecule) 양성 종양 세포, 그리고 적색으로 염색된 CD90 또는 Thyrum 양성 기질 세포의 분포를 확인하십시오. 특히, CD8 T 세포가 종양 소섬유(tumor eyelets)에 비해 기질에 더 많이 분포되어 있음에 유의하십시오.여기에 표시된 것은 녹색으로 염색된 개별 상주 CD8 T 세포의 궤적과, 인간 폐 종양 슬라이스의 적색 기질 및 청색 종양 세포 구획입니다. 제2고조파 발생을 통해 검출되어 적색으로 표시된 콜라겐은 기질 구획을 나타냅니다. CD8 T 세포는 종양 소섬유(eyelets)보다 수는 적지만, 기질에 비해 이 구획에서 더 활발하게 이동합니다.이 기술을 숙달하면, 적절하게 수행했을 때 보통 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 공초점 현미경을 사용하여 상주 CD8 T 세포를 모니터링하기 위해 종양 샘플의 면역 염색을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

우리는 복막 표면으로 전이된 인간 암의 생산, 배양 및 시각화를 위한 프로토콜을 설명합니다. 절제된 종양 표본은 비브라톰을 사용하여 절단하고 투과성 삽입물에서 배양하여 산소 공급 및 생존력을 높인 다음 컨포칼 현미경 및 유세포 분석을 사용하여 이미징 및 다운스트림 분석을 수행합니다.

절제된 인간 종양 표본에서 생체 외 유기형 가성 점액종 복막 종양 절편의 배양 및 이미징

학습하세요 공초점 현미경을 사용하여 형광 항체로 표지된 거주 CD8 T 세포를 인간 폐 종양 조각에서 실시간 이미징하는 방법을 배우세요. 이 기술은 종양 면역학에서 T 세포 이동성을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

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