측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

이 절차의 전체적인 목표는 myc 유도 T-세포 급성 림프구성 백혈병 제브라피시 모델에서 side population 세포를 분리하는 것입니다. side population 분석법은 많은 정상 및 암 조직에서 줄기세포 및 전구세포 집단을 식별하는 데 사용되어 왔습니다. 하지만 아직 제브라피시 암 모델에는 적용된 적이 없습니다.

이 기술의 주요 장점은 암 줄기세포 활성이 풍부할 가능성이 있는 제브라피시 T-ALL 세포 집단을 전망적으로 분리할 수 있다는 것입니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 제브라피시 백혈병 연구에 광범위하게 적용될 수 있으며, 다른 악성 및 비악성 제브라피시 세포 유형에도 적용 가능할 수 있습니다. 이 방법은 미세한 변화에도 민감하므로 처음 접하는 사용자는 어려움을 겪을 수 있습니다.

방법이 간단해 보일지라도, 테스트하는 각 세포 유형에 따른 최적화가 필요합니다. 0.9x PBS에 10% 열불활성화 FBS를 혼합하여 20 milliliters를 준비하십시오. 300 units의 항응고제가 포함된 헤파린 나트륨염 바이알에 FBS/PBS 용액 1 milliliter를 첨가하십시오.

그 다음, 형광 현미경을 사용하여 종양 세포가 신체의 50%까지 침습한 물고기 또는 먹이 섭취나 수영에 어려움이 있는 것으로 확인된 물고기를 선택합니다. 물고이를 1~2 mg/mL tricaine이 포함된 어류용수로 옮겨 안락사시킵니다. 아가미 움직임과 심장 박동을 관찰하여 안락사 여부를 확인합니다.

물고기의 머리를 제거한 후, 피펫을 사용하여 체강 내에 heparin 용액 100 µL를 주입하여 과잉 적혈구를 제거합니다. 흘러나오는 모든 액체를 흡입하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 그다음, 새 피펫 팁을 사용하여 세척액에 더 이상 혈액이 섞여 나오지 않을 때까지 체강을 두 번 더 세척하고, 모든 세척 과정에서 수집된 액체는 폐기합니다.

백혈병 세포를 수집하려면, 미리 세척된 체강에 100 µL의 FBS/PBS 용액을 주입합니다. 해부 현미경 하에서 피펫 팁으로 물고기의 몸통을 부드럽게 눌러 종양 세포를 밀어냅니다. 배출된 액체를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.

대부분의 종양 세포가 수확될 때까지 분리를 반복합니다. 모든 세포를 동일한 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 수집하고, 얻어진 현탁액을 상온에서 유지합니다. 그런 다음, 세포 덩어리를 분산시키기 위해 부드럽게 피펫팅하여 분리된 종양 세포를 혼합합니다.

세포 현탁액을 40 µm 메쉬 필터로 여과합니다. 그 후 100 µL의 FBS/PBS로 필터를 1~2회 세척합니다. 여과가 완료되면 세포를 상온에서 보관합니다.

마지막으로, 새 튜브에 세포 현탁액 2 µL와 0.04% 멸균 Trypan Blue 용액 18 µL를 혼합합니다. 얻은 현탁액 10 µL를 혈구계수기(hemocytometer)에 로딩하고 생존한 형광 종양 세포 수를 측정합니다. T-ALL 세포의 깨끗한 샘플을 수집하는 것이 중요합니다.

여기서 사용된 Hoechst 33342의 농도는 수집된 살아있는 종양 세포의 수를 기준으로 합니다. 추가적인 세포 파편이나 비종양 세포는 분석을 방해할 수 있습니다. 세포 염색 전, Hoechst 염료를 nuclease-free water에 희석하여 1 mg/mL 농도의 작동 용액을 준비하십시오.

준비된 용액을 알루미늄 호일로 덮어 4°C에서 보관하십시오. 그 다음, 1mL의 DMSO에 49.1mg의 verapamil을 녹여 100µM 억제제 용액을 만듭니다. 이어서, FBS/PBS, 2.5µL의 DMSO, 1mg/mL Hoechst 염료 15µL, 그리고 10⁶개의 종양 세포를 팍스 튜브(fax tube)에 넣어 최종 부피가 1mL가 되도록 샘플을 준비하십시오.

대조군을 준비하려면 FBS/PBS, 100 mM verapamil 2.5 µL, 1 mg/mL Hoechst 염색약 15 µL를 추가하고, 최종 부피가 1 mL가 되도록 6종의 종양 세포에 10만큼 추가합니다. 샘플과 대조군을 28 °C 항온수조에서 암소 상태로 120분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 즉시 얼음에 넣고 암소 상태로 유지합니다.

세포를 4°C에서 300 ×g로 6분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 1 mL의 FBS/PBS로 세포를 세척합니다. 다시 한번 4°C에서 300 ×g로 6분 동안 세포를 원심분리합니다.

세포를 펠릿화한 후 상층액을 제거하고 1 mL의 FBS/PBS에 세포를 재현탁합니다. 세포 소팅 전까지 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 세포 소팅 15분 전에 세포 현탁액 1 mL당 1 mg/mL propidium iodine 스탁 솔루션 2 µL를 첨가합니다.

그 다음, 샘플을 충분히 볼텍싱합니다. 염색된 제브라피시 T-ALL 세포 현탁액을 형광 활성 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter)로 분석합니다. Hoechst 염료 분석을 위해서는 UV 레이저로, propidium iodide 또는 GFP 양성 T-ALL 세포 검출을 위해서는 488 nanometer 레이저로 샘플을 여기시킵니다.

사용되는 각 세포 유형에 따라 세포 수, 염료 농도, 배양 온도 및 배양 시간이 최적화되어야 할 수 있습니다. 또한 이러한 각 조건의 변경은 분석 결과에 급격한 영향을 줄 수 있습니다. 제브라피시에서 분리한 T-ALL 세포 중 side population을 식별하기 위해, 먼저 세포 파편과 세포 덩어리를 제거합니다.

그 후 단일 세포 집단에서 Propidium iodide 섭취와 GFP 발현을 분석하여 살아있는 종양 세포를 식별합니다. Side population을 시각화하기 위해 Hoechst 염료의 청색 및 적색 방출을 비교합니다. Side population은 주 세포 집단의 왼쪽에서 청색 형광 축 방향으로 뻗어 나오는 희미한 세포 꼬리 형태로 나타납니다.

여기 두 가지 서로 다른 종양 세포 샘플에 대해 수행한 사이드 파퓰레이션(side population) 분석 결과가 제시되어 있습니다. 두 검체 모두에서 사이드 파퓰레이션이 확인되었습니다. 하지만 종양 샘플마다 사이드 파퓰레이션 세포의 수가 서로 다르게 나타났습니다.

분석된 종양 샘플에 관계없이, 샘플을 유출 억제제인 verapamil로 처리한 결과 이전에 확인된 세포에서 관찰된 신호가 사라졌으며, 이는 사이드 팝퓰레이션(side population) 표현형을 더욱 확증해 주었습니다. 숙련된 경우, 제브라피시 T-ALL에 대한 사이드 팝퓰레이션 기법은 본 논문에서 제시한 대로 적절히 수행한다면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 배양 온도 및 시간, 염료 농도, 유출 억제제와 같이 제브라피시 T-ALL에 최적화된 단계들을 유념하는 것이 중요합니다.

이러한 조건들은 서로 다른 실험 체계에 따라 변경이 필요할 수 있습니다. 이 절차에 따라 RNA 분리 또는 in vivo 이식 분석과 같은 다른 방법들을 분리된 side population 세포로 수행하여, side population 세포의 기능성 및 유전자 조절에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬 T-세포 급성 림프구성 백혈병에서 세포의 side population을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.