Name: 측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 학습하세요 제브라피쉬 T-ALL 모델에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 Danio rerio를 이용하여. 이 기술은 암 줄기세포 활성이 풍부한 세포 집단을 전망적으로 분리하여 백혈병 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 시카고 대학 여성위원회 (University Board of Chicago Women Board), 웬디 윌 사건 기금 (Wendy Will Case Fund), 시카고 대학 종합 암 센터 지원 교부금 (P30 CA014599)에 의해 지원되었습니다. 이 실험을 설정하는 데 도움을 주신 시카고 대학교의 Flow Cytometry Core와 de Zhong 연구실의 다른 회원, 특히 Leslie Pedraza 및 Sean McConnell에게 감사드립니다.

제브라 피쉬의 모든 절차는 시카고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시카고 대학은 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회 (AAALAC)의 인증을 받았으며. Zebrafish의 1. 생성 및 분리 찬란 레이블이 T-ALL 세포 <ol><li> 동계 제브라 피쉬 배아에 미세 주입 <ol><li> 녹색 형광 단백질 (rag2 : GFP) C-myc 유전자 및 rag2 : 시판되는 키트를 사용하여, 원형 rag2 격리 TOL2의 트랜스 (플라스미드 DNA의 소스 재료의 도표 참조) (12)에 의해 인식 된 역전 된 말단 반복 부를 포함하는 플라스미드 DNA를 상기 DNA를 용출 멸균한다. 참고 : GFP는이 연구에서 사용되지만, 어떤 형광 단백질이 작동합니다. </li><li> PCS2 - 트랜스 준비 (TOL2) RNA <ol><li> t 참조 (시판 키트를 사용하여 TOL2 플라스미드 DNA를 분리플라스미드 DNA의 소스 재료의 그 테이블) (12) 및 멸균의 DNA를 용출시킨다. </li><li> 플라스미드를 선형화하는 적절한 버퍼를 NotI 제한 효소 5 개 유닛으로 1 시간 동안 37 ° C에서 TOL2의 DNA 1 μg의 부화. 20 분 동안 65 ° C에서을 NotI을 열 - 불 활성화. </li><li> 시판 RNA 전사 세트 (13)를 사용하는 선형화 된 DNA로부터의 SP6 RNA 폴리머 라제와 RNA를 TOL2의 전사. -80 ° C에서 단일 사용 씩의 RNA를 저장합니다. </li></ol></li><li> C-myc의 플라스미드 DNA, 250 ng의 rag2 : GFP 플라스미드 DNA, RNA의 TOL2 150 NG 및 페놀 레드 0.5 μL rag2 250 NG를 첨가하여 얼음에 주입 혼합을 준비한다. 핵산 분해 효소가없는 물 10 μL에 볼륨을 조절합니다. </li><li> 이전 맛 음료 다음, 유리 모세관으로부터 뽑아 마이크로 인젝터와 바늘을 이용하여 단일 세포 단계 동계 지브라 피쉬의 배아 세포에 주입 혼합 ~ 1 거리 nL 주입lished 방법 8, 14. 참고 : 처녀 생식 (15)에 의해 생성 된 동계 제브라 피쉬는 이식 후 유전 적 이질성과 면역 거부 반응을 제거하기 위해 여기에 사용됩니다. 그러나, 야생형 제브라 또는 임의의 변형이 사용될 수있다. </li><li> 24 시간 및 48 시간 후 주사 16 죽은 낙후 또는 잘못된 배아를 제거한다. </li><li> 주입 후 6 일째에 물고기 시스템에 주입 된 물고기를 놓고 표준 프로토콜 6 항 키우기. </li></ol></li><li> 주입 지브라 피쉬 검사 및 종양 성장을 모니터링 <ol><li> 8 이십일일 후 분사에서 epifluorescent 현미경 (: 40분의 470, 발광 대역 50분의 525 여기 대역)을 이용하여 GFP 형광을위한 배양 접시와 화면 배아 매체의 액적 단일 주입 유충 놓는다. 참고 : 시간 Zebrafish의 유충ave는 rag2 : c-myc와 rag2 : GFP를 모두 통합하여 녹색 형광성 흉선 (양성 어류)을 가지며 이미 흉선을 넘어 악성 녹색 형광 세포의 확장을 나타낼 수 있습니다. GFP + 흉선이있는 모든 물고기는 GFP + T-ALL을 개발합니다. 플라스미드의 통합을 입증하지 않는 유충은 녹색 형광 세포 (음성 생선)를 갖지 않을 것이다. </li><li> 다른 탱크에 (형광 부족에 따라) 부정적인 물고기를 분리하고 사후 28 일 및 35 일에 다시 물고기를 모니터하십시오. 주사 후 28 일 및 35 일에, 선별 전 물고기 시스템 물에서 0.02 % 완충 된 트리 세인 (MS-222)으로 물고기를 마취시킨다. </li><li> 일주일에 세 번씩 종양 성장을 모니터링하기 위해 형광성으로 분류 된 흉선 또는 형광성 종양에 양성인 각 제브라 피쉬 애벌레를 개별 탱크에 놓습니다. </li></ol></li><li> 일차 종양 어류에서 형광 표지 된 T-ALL 세포의 수집 <ol><li> 적어도 0.9 20 ㎖의 인산염 완충 식염수 (FBS / PBS)에서 10 %의 열 - 불 활성화 된 우 태아 혈청으로 준비한다. </li><li> 헤파린 나트륨의 한 바이알 (300 개)에 FBS / PBS 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 선택 물고기 몸의 50 % 이상에서 종양 베어링, 또는 그 물고기는 어려움 먹고 수영을 가지고. tricaine 또는 얼음물에 담가을 했나봐하여 물고기를 희생. 아가미의 움직임과 심장 박동의 부족 (a)에 의해 죽음을 확인합니다. </li><li> 물고기의 머리를 제거하기 위해 면도날을 사용합니다. </li><li> 과도한 적혈구를 제거하기 위해 헤파린 용액과 물고기의 구멍을 씻으십시오. <ol><li> 피펫을 사용하여, 물고기의 체강 내에 헤파린 용액 (단계 1.3.2에서 제조) 100 μL를 주입. 밖으로 유출 모든 액체를 제거합니다 (그것은 혈액 세포를 포함) 및 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 피펫. </li><li> 다시 몸을 씻어 신선한 피펫 팁을 사용합니다. 적어도 세 세척을 수행하거나 밖으로 유출 액체는 BL의 무료 나타날 때까지짐 우드. </li><li> 이를 추가 분석에 사용되지 않으므로, 단계 1.3.5.1 및 1.3.5.2에 세척 모든 액체 폐기. </li></ol></li><li> 백혈병 세포를 수집합니다. <ol><li> 물고기의 체강 내에 FBS / PBS 100 ㎕를 주입한다. </li><li> 종양 세포를 밀어 / 짜내 피펫 팁과 물고기의 몸의 외부에 부드러운 압력을 적용합니다. 주 :이 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행되는 경우 체강 흘리 종양 세포가 명백 할 것이다. </li><li> 각 액상 세포 수집은 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 세척 하였다. </li><li> 단계를 반복 1.3.6.1-1.3.6.3 종양 세포의 대부분은 (일반적으로 5 ~ 10 회)를 수집 할 때까지. 동일한 1.5mL 용량의 마이크로 원심 튜브에 모든 종양 세포를 수집한다. 실온에서 세포를 유지합니다. </li></ol></li><li> 부드럽게 세포 덩어리 해리하도록하여 피펫 팅 단계 1.3.6에서 수집 된 종양 세포를 섞는다. 4 통해 세포 현탁액을 필터0 ㎛의 메쉬 필터. FBS / PBS 100 μL와 필터 1-2 회 반복한다. 실온에서 세포를 유지합니다. </li><li> 새로운 튜브에 트리 판 블루 18 μL (0.4 %로 1:10으로 희석하고 여과)하여 세포 현탁액 2 μL를 섞는다. 로드 혈구 10 μL와 격리 된 종양 세포의 수를 계산하는 라이브 (비 블루) 형광 세포의 수를 계산합니다. 참고 : 비 블루 GFP - 부정적인 세포가 가능성이 정상이 아닌 악성 T 세포이며, 계산되어서는 안된다. 적어도 2 × 106 세포 훽스트 33342로 세포를 염색하기 위해 요구된다. </li></ol></li></ol> 훽스트 (Hoechst) 33342 2. 염색 찬란 레이블이 T-ALL 세포는 사이드 인구를 식별하는 <ol><li> 1 ㎎ / ㎖의 농도를 작동하도록 클레아없는 H 2 O로 훽스트 33342 1:10 희석. 4 ℃에서 어둠에서 염료를 저장한다. </li><li> 디메틸 설폭 사이드 1 ㎖ (DMSO) 49.1 mg을 용해시켜 베라파밀의 100 mm의 용액을 제조 하였다. 참고 : 베라파밀은 ABC 트랜스 포터의 억제제 및 측면 인구 실험을위한 중요한 컨트롤입니다. 샘플 베라파밀를 추가하면 훽스트 33342 염색을 유출하는 ABC 수송의 기능을 억제한다. 베라파밀이 샘플에 추가 될 때 따라서, 진정한 측면 인구는 사라집니다. </li><li> 28 ° C에 수욕을 설정합니다. </li><li> 형광 활성화 된 세포 분류기 (FACS) 튜브 셀 솔루션을 추가하여 어두운 곳에서 샘플 및 제어를 준비한다. <ol><li> 106 개 세포를 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342 및 FACS 튜브 DMSO 2.5 μL를 첨가하여 샘플을 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다. </li><li> FACS 튜브 베라파밀 106 셀, 1 ㎎을 15 μL / ML 호엑스트 33342, 100 mM의 2.5 μL를 추가하여 제어를 준비한다. FBS / PBS에 1 mL의 양을 조정한다. 참고 : 10 개 6 세포의 최소 / 샘플 권장되지만 더 세포를 염색 특히 측면의 populat 경우 바람직이온 전지는 추가 분석을 위해 정렬된다. 106 개 세포 / ㎖를 초과하고, 15 ㎍ / ㎖의에 훽스트 33342 농도를 유지하지 않는다. 10 × 106 세포를 염색하는 경우, 총 반응 부피 10 ㎖이다. </li></ol></li><li> 120 분 동안 어둠 속에서 28 ° C의 수조에서 인큐베이션. </li><li> 배양 후, 얼음에 즉시 세포를 배치하고 어두운에 보관하십시오. </li><li> 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ml로 세척 하였다. </li><li> 300 × g으로 6 분 동안 4 ℃에서 세포를 펠렛. 상층 액을 제거합니다. FBS / PBS 1 ㎖로 세포를 재현 탁. </li><li> 세포 정렬 될 때까지 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 정렬 셀 FBS / PBS 각각 1 mL의 요오드화 프로피 듐 (PI) 재고 2 μL (1 ㎎ / ㎖)을 첨가하기 전에 15 분 (최종 농도 2 ㎍ / ㎖). 잘 섞다. </li></ol> 3. FACS 찬란 레이블이 T-ALL 세포 인구 내에서 사이드 인구를 찾기 <ol><li&gt; Hoechst 33342 염료 여기를위한 UV 레이저와 PI 자극 및 GFP + T-ALL 세포의 검출을위한 488 nm 레이저가 장착 된 셀 분류기에서 얼룩진 제브라 피쉬 T-ALL 세포 현탁액을 분석하십시오. </li><li> 살아있는 GFP + T-ALL 세포의 게이트를 결정하십시오. <ol><li> 파편을 게이트 아웃하려면 FSC (forward scatter) 및 SSC (side scatter) 영역을 사용하십시오. 참고 : FSC는 셀 크기를 구별하는 데 사용되고 SSC는 셀의 세분성을 구별하는 데 사용됩니다. </li><li> 이중 선별을 위해 FSC와 SSC 너비를 사용하십시오. 참고 : 유동 세포 계측기 감지기로 식별되는 세 가지 구성 요소가 있습니다 : 면적, 높이 및 너비. 면적은 일반적으로 세포의 형광을 측정하는 데 사용됩니다. 너비는 비행 시간을 측정하며 두 개의 세포가 함께 뭉치면 두 배가됩니다. </li><li> 살아있는 종양 세포의 경우 적절한 검출기 ( 예 : GFP의 경우 FITC, PI의 경우 PerCP Cy5-5)를 사용하여 GFP가 양성이고 PI가 음성 인 세포 주위에 게이트를 그립니다. </li></ol></li><li&gt; 생균 게이트 (각각 50분의 450 및 30분의 670 등) 훽스트 블루 및 레드 훽스트 대역 통과 필터를 통해 훽스트 33342 형광을 측정한다. 참고 :이 설정 한 후 측면 인구가 존재한다면, 분명있을 것입니다. 그것이 진정한 측면 인구 고려되어야 할 중요한 측면 인구는 순서대로 베라파밀 제어 사라해야합니다. </li><li> 상기 실험 측부 세포 집단을 분류하면, 큰 노즐 팁 (100 μm의)을 사용하여 100 % FBS의 3 ㎖을 함유하는 FACS 튜브에 세포를 수집한다. 정렬 후에 세포 생존을 향상시키기 위해 더 큰 노즐 팁 (100 μm의) 대신 작은 팁 (70 μm의)을 사용한다. </li></ol>

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer%3A+the+state+of+the+art+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li>
<li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+localization+of+side+population+%28SP%29+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li>
<li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li>
<li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790(2011).</li>
<li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li>
<li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li>
<li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt%2FmTORC1+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5062/plasmid-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregan Press. (1993).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+side+population+cells+%28stem-like+cell+population%29+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li>
<li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li>
</ol>

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측면 집단 분석은 매우 민감합니다. 따라서 프로토콜을 조금만 변경하면 측면 세포를 검출하는 데 어려움이 발생할 수 있습니다. 첫째, 얼룩 단계 동안 온도는 각 동물 / 세포 시스템에 특정입니다. 포유류 시스템의 경우, 측면 집단 분석은 일반적으로 37 ° C에서 수행됩니다 2 . 제브라 피쉬 T-ALL 세포가 37 ℃에서 배양되었을 때, 많은 세포가 죽어서이 배양 온도를 용납 할 수 없게 만들었다 (데이터는 표시되지 않음). Kobayashi와 동료 (2008)가 측 모집 분석을 위해 zebrafish kidney marrow를 해부 시켰을 때, 배양은 25 ℃에서 수행되었다. 이 인큐베이션 온도는 약한 Hoechst 33342 프로파일 (데이터는 표시되지 않음)을 나타 내기 때문에 제브라 피쉬 T-ALL 세포에는 충분하지 않았습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 28 ° C의 인큐베이션 온도는 세포 생존 능력을 유지하고 강한 Hoechst 33342 프로파일을 얻기에 최적입니다. <...

측면 집단 분석은 세포막상의 ATP 결합 카세트 (ABC) 전달체 단백질의 높은 수치로 인해 DNA 결합 염료 Hoechst 33342를 유출시키는 조직 내 특정 세포의 증진 된 능력을 이용합니다. Hoechst 33342 염료를 유출하는 세포는 염료가 UV 레이저로 여기 된 후 이중 파장 유동 세포 계측법 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 이 분석법은 처음에 마우스 조혈 줄기 세포 (HSC) 1 을 확인하는 데 사용되었지만 이후 많은 조직과 암에서 줄기 / 전구 세포 집단을 확인하는 데 사용되었습니다 (참고 문헌 2 참조). 그러나 모든 세포 집단이 부수적 인 집단을 가지고있는 것은 아니며, 모든 부 모집단이 줄기 / 전구 세포를 위해 풍부하지는 않습니다. 제브라 피쉬는 인간의 암을 연구하기위한 강력한 척추 동물 모델 시스템입니다. 3 , 4 , 전통적인 murine암의 델. Zebrafish의 배아는 외부 형질 전환 및 암 개시 및 진행을 포함한 병리학 적 과정의 생체 내 관찰을 용이하게 수정 된 광학적 분명합니다. 현재까지, 측면 인구 분석은 잠재적 인 줄기 또는 전구 세포만을 조혈 모세포를 식별하는 제브라 피쉬의 신장 골수에 적용, 그리고 어떤 제브라 피쉬 암 모델 5, 6되었습니다 감지합니다. T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)는 형태 학적으로 인간 T-ALL 7, 8, 11 유전자와 유사하다. T-ALL은, 인간의, 소아 10 ~ 15 %와 모든 경우 9 성인의 25 %를 차지하는 공격적인 악성 종양이다. T-ALL의 치료가 개선 된 반면, 재발은 여전히 ​​일반적이며 예후와 연관되어 있습니다. T-ALL 종양은 heterogene입니다조직 구성 단위 및 백혈병 개시 세포 (저소득) 등 다양한 종양 세포의 소집단가 포함되어 있습니다. 저소득 그들의 단일 세포에서 종양 전체를 자라게 할 수있는 능력, 및 종양 세포 집단 내 저소득의 주파수에 의해 정의는 제한 희석 이식 분석 (LDA)을 통해 수신자로 변화하는 셀 용량을 이식하여 계산 될 수있다. LDA 실험은 저소득 8, 10, 11의 주파수를 계산하기 위해 제브라 수행 하였지만, 이러한 판정은 제 지나고되고 저소득의 잠재적 분리를 허용하지 않는다. 따라서, 방법은 전향 적으로 암 줄기 세포의 활동에 대한 풍부한 인구가 부족한 분리합니다. 식별 및 지브라 피쉬 T-ALLS 측으로부터 세포 집단을 분리하는 것은 이러한 결함을 해결하기위한 첫 단계이다. 여기에 제시된 프로토콜은 효율적으로 zebr에서 T-ALL 종양을 생성하는 방법에 대해 설명합니다(tol2-mediated transgenesis)를 이용하여 T-ALL 종양 세포를 수확하고 Hoechst 33342로 염색하여 세포의 부작용을 확인한다. 제브라 피쉬 T-ALL 에 대한 미래 의 생체 내 실험 은 측면 세포가 LIC를 강화 시키거나 다른 줄기 - 또는 전구체 - 유사 성질을 갖는지 여부를 포함 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Syngeneic zebrafish (CG2)</td><td></td><td></td><td>See Mizgireuv et al., 2006</td></tr><tr><td>rag2:c-myc plasmid</td><td></td><td></td><td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>rag2 promoter from Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>pCS2-transposase plasmid</td><td></td><td></td><td>Chien 실험실</td></tr><tr><td>NotI -HF 제한 효소</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>R3189S</td><td>25 &micro에 있는 500 단위; L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 전사 키트</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25 반응</td></tr><tr><td>QIAGEN 플라스미드 미디 키트</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>SteREO Discovery V8 현미경</td><td>Carl Zeiss 현미경</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>디지털 마이크로 인젝터</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>황동 스트레이트 암 바늘 홀더</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>마그네틱베이스 및 스탠드</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige 국제</td><td>MN153</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10</td><td>10cm 필라멘트 제외</td></tr><tr><td>Flaming/Brown 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Microloader 피펫 팁</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>페놀 레드 용액</td><td>Sigma Life Science</td><td>P0290</td><td>0.5% 농도 100mL</td></tr><tr><td>플라스틱 이송 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>137119D</td><td>눈금 7.5mL 전구</td></tr><tr><td>트리카인 메탄설포네이트(MS-222)</td><td>Western Chemical, Inc.</td><td>Fisher Scientific -</td><td>NC0342409 100g</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 단위 바이알</td></tr><tr><td>40 &마이크로; m 메쉬 필터</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352340</td><td>50개입</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8154</td><td>20 mL - 용액 (0.4%)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma Life Science</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium 요오드화물</td><td>생명 기술</td><td>P3566</td><td>10mL</td></tr><tr><td>FACSaria Fusion 세포 분류기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

측면에서 인구의 분리 나 myc 유도 t 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

건강 악성 조직 중 어느 하나에서 이종 세포 집단은 상기 DNA 결합 염료 훽스트 33342. 셀이 &quot;측면 인구&quot;유출하는 차동 기능을 특징으로 세포 집단을 포함 할 수있다 훽스트 33342 후 유세포 방법을 이용하여 식별 될 수있다 염료는 자외선 (UV) 레이저에 의해 여기된다. 많은 세포 유형의 측면 인구는 stem- 또는 전구와 같은 세포가 포함되어 있습니다. 그러나 모든 종류의 세포는 식별 측면 인구가 있습니다. 다니오의 레 리오 (rerio), 제브라 피쉬는 T 세포 급성 림프 구성 백혈병 (T-ALL)의 생체 내 모델의 강력한을 가지고 있지만 이러한 제브라 피쉬 T-ALLS가 있는지 여부 측면 인구는 알 수 없습니다. 여기에 설명 된 방법은 제브라 피쉬 T-ALL의 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 우선, 제브라 피쉬의 T-ALL은 하나의 세포 단계의 배아로 TOL2 플라스미드의 미세 주입을 통해 생성됩니다. 종양 무대로 성장했으면하는 그들은 항문의 절반 이상으로 확장T-ALL 세포를 수확 할 수 있습니다. 그 다음, 세포를 Hoechst 33342로 염색하고 측면 세포에 대한 유동 세포 계측법으로 검사한다. 이 방법은 zebrafish T-ALL 연구에 광범위한 응용이 있습니다. 제브라 피쉬에는 이러한 측면 세포가 암 줄기 세포와 유사한지를 확인하는 알려진 세포 표면 마커는 없지만 생체 내 기능 이식 분석이 가능합니다. 또한, 단일 세포 transcriptomics이 측면 인구 세포의 유전 특징을 식별하는 데 적용 할 수 있습니다.

효율적 제브라 형광 myc의 유도 된 T-ALL 종양을 생성하기 위해 트랜스 TOL2의 사이트에 의해 측면 원형 DNA 구조체는 TOL2의 RNA와 공동으로 주입 될 수있다. 제브라 피쉬의 수정란으로 선형화 된 DNA의 주입 이전 연구에서 5 %의 형질 전환 레이트 8보고한다. 프로토콜 TOL2 - 매개 형질 전환 등을 조정하여, 10-44 %의 범위의 형질 전환 비율 (표 1)를 관찰 할 수있다. 대표적인 예에서, GFP + T-ALL과 물고기 측면 인구 세포의 비율을 결정하기 위해 훽스트 (Hoechst) 33342로 염색했다. 그림 1은 측 인구 세포의 비율을 결정하는 데 사용되는 게이팅 방식을 보여줍니다. 먼저, FSC 및 SSC를 이용하여 T-ALL...

여기서는 myc의 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병의 모델 제브라 피쉬 (T-ALL)에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 이 쪽 인구 분석은 매우 민감하고 제브라 피쉬 T-ALL에 대해 설명하지만, 다른 악성 및 비 악성 제브라 피쉬의 세포 유형에 적용 할 수있다.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

이 절차의 전체적인 목표는 myc 유도 T-세포 급성 림프구성 백혈병 제브라피시 모델에서 side population 세포를 분리하는 것입니다. side population 분석법은 많은 정상 및 암 조직에서 줄기세포 및 전구세포 집단을 식별하는 데 사용되어 왔습니다. 하지만 아직 제브라피시 암 모델에는 적용된 적이 없습니다.이 기술의 주요 장점은 암 줄기세포 활성이 풍부할 가능성이 있는 제브라피시 T-ALL 세포 집단을 전망적으로 분리할 수 있다는 것입니다. 본 연구에서 설명하는 방법은 제브라피시 백혈병 연구에 광범위하게 적용될 수 있으며, 다른 악성 및 비악성 제브라피시 세포 유형에도 적용 가능할 수 있습니다. 이 방법은 미세한 변화에도 민감하므로 처음 접하는 사용자는 어려움을 겪을 수 있습니다.방법이 간단해 보일지라도, 테스트하는 각 세포 유형에 따른 최적화가 필요합니다. 0.9x PBS에 10% 열불활성화 FBS를 혼합하여 20 milliliters를 준비하십시오. 300 units의 항응고제가 포함된 헤파린 나트륨염 바이알에 FBS/PBS 용액 1 milliliter를 첨가하십시오.그 다음, 형광 현미경을 사용하여 종양 세포가 신체의 50%까지 침습한 물고기 또는 먹이 섭취나 수영에 어려움이 있는 것으로 확인된 물고기를 선택합니다. 물고이를 1~2 mg/mL tricaine이 포함된 어류용수로 옮겨 안락사시킵니다. 아가미 움직임과 심장 박동을 관찰하여 안락사 여부를 확인합니다.물고기의 머리를 제거한 후, 피펫을 사용하여 체강 내에 heparin 용액 100 µL를 주입하여 과잉 적혈구를 제거합니다. 흘러나오는 모든 액체를 흡입하여 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣습니다. 그다음, 새 피펫 팁을 사용하여 세척액에 더 이상 혈액이 섞여 나오지 않을 때까지 체강을 두 번 더 세척하고, 모든 세척 과정에서 수집된 액체는 폐기합니다.백혈병 세포를 수집하려면, 미리 세척된 체강에 100 µL의 FBS/PBS 용액을 주입합니다. 해부 현미경 하에서 피펫 팁으로 물고기의 몸통을 부드럽게 눌러 종양 세포를 밀어냅니다. 배출된 액체를 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다.대부분의 종양 세포가 수확될 때까지 분리를 반복합니다. 모든 세포를 동일한 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 수집하고, 얻어진 현탁액을 상온에서 유지합니다. 그런 다음, 세포 덩어리를 분산시키기 위해 부드럽게 피펫팅하여 분리된 종양 세포를 혼합합니다.세포 현탁액을 40 µm 메쉬 필터로 여과합니다. 그 후 100 µL의 FBS/PBS로 필터를 1~2회 세척합니다. 여과가 완료되면 세포를 상온에서 보관합니다.마지막으로, 새 튜브에 세포 현탁액 2 µL와 0.04% 멸균 Trypan Blue 용액 18 µL를 혼합합니다. 얻은 현탁액 10 µL를 혈구계수기(hemocytometer)에 로딩하고 생존한 형광 종양 세포 수를 측정합니다. T-ALL 세포의 깨끗한 샘플을 수집하는 것이 중요합니다.여기서 사용된 Hoechst 33342의 농도는 수집된 살아있는 종양 세포의 수를 기준으로 합니다. 추가적인 세포 파편이나 비종양 세포는 분석을 방해할 수 있습니다. 세포 염색 전, Hoechst 염료를 nuclease-free water에 희석하여 1 mg/mL 농도의 작동 용액을 준비하십시오.준비된 용액을 알루미늄 호일로 덮어 4°C에서 보관하십시오. 그 다음, 1mL의 DMSO에 49.1mg의 verapamil을 녹여 100µM 억제제 용액을 만듭니다. 이어서, FBS/PBS, 2.5µL의 DMSO, 1mg/mL Hoechst 염료 15µL, 그리고 10⁶개의 종양 세포를 팍스 튜브(fax tube)에 넣어 최종 부피가 1mL가 되도록 샘플을 준비하십시오.대조군을 준비하려면 FBS/PBS, 100 mM verapamil 2.5 µL, 1 mg/mL Hoechst 염색약 15 µL를 추가하고, 최종 부피가 1 mL가 되도록 6종의 종양 세포에 10만큼 추가합니다. 샘플과 대조군을 28 °C 항온수조에서 암소 상태로 120분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 즉시 얼음에 넣고 암소 상태로 유지합니다.세포를 4°C에서 300 ×g로 6분 동안 원심분리합니다. 그 후, 상층액을 제거하고 1 mL의 FBS/PBS로 세포를 세척합니다. 다시 한번 4°C에서 300 ×g로 6분 동안 세포를 원심분리합니다.세포를 펠릿화한 후 상층액을 제거하고 1 mL의 FBS/PBS에 세포를 재현탁합니다. 세포 소팅 전까지 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 세포 소팅 15분 전에 세포 현탁액 1 mL당 1 mg/mL propidium iodine 스탁 솔루션 2 µL를 첨가합니다.그 다음, 샘플을 충분히 볼텍싱합니다. 염색된 제브라피시 T-ALL 세포 현탁액을 형광 활성 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter)로 분석합니다. Hoechst 염료 분석을 위해서는 UV 레이저로, propidium iodide 또는 GFP 양성 T-ALL 세포 검출을 위해서는 488 nanometer 레이저로 샘플을 여기시킵니다.사용되는 각 세포 유형에 따라 세포 수, 염료 농도, 배양 온도 및 배양 시간이 최적화되어야 할 수 있습니다. 또한 이러한 각 조건의 변경은 분석 결과에 급격한 영향을 줄 수 있습니다. 제브라피시에서 분리한 T-ALL 세포 중 side population을 식별하기 위해, 먼저 세포 파편과 세포 덩어리를 제거합니다.그 후 단일 세포 집단에서 Propidium iodide 섭취와 GFP 발현을 분석하여 살아있는 종양 세포를 식별합니다. Side population을 시각화하기 위해 Hoechst 염료의 청색 및 적색 방출을 비교합니다. Side population은 주 세포 집단의 왼쪽에서 청색 형광 축 방향으로 뻗어 나오는 희미한 세포 꼬리 형태로 나타납니다.여기 두 가지 서로 다른 종양 세포 샘플에 대해 수행한 사이드 파퓰레이션(side population) 분석 결과가 제시되어 있습니다. 두 검체 모두에서 사이드 파퓰레이션이 확인되었습니다. 하지만 종양 샘플마다 사이드 파퓰레이션 세포의 수가 서로 다르게 나타났습니다.분석된 종양 샘플에 관계없이, 샘플을 유출 억제제인 verapamil로 처리한 결과 이전에 확인된 세포에서 관찰된 신호가 사라졌으며, 이는 사이드 팝퓰레이션(side population) 표현형을 더욱 확증해 주었습니다. 숙련된 경우, 제브라피시 T-ALL에 대한 사이드 팝퓰레이션 기법은 본 논문에서 제시한 대로 적절히 수행한다면 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 배양 온도 및 시간, 염료 농도, 유출 억제제와 같이 제브라피시 T-ALL에 최적화된 단계들을 유념하는 것이 중요합니다.이러한 조건들은 서로 다른 실험 체계에 따라 변경이 필요할 수 있습니다. 이 절차에 따라 RNA 분리 또는 in vivo 이식 분석과 같은 다른 방법들을 분리된 side population 세포로 수행하여, side population 세포의 기능성 및 유전자 조절에 관한 의문점을 해결할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 제브라피쉬 T-세포 급성 림프구성 백혈병에서 세포의 side population을 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포를 분리하고 트리판 블루 염료를 사용하여 정량화하는 기술을 설명합니다.

형광 표지된 T-ALL 세포 분리: 성체 제브라피시에서 T-ALL 세포를 분리하는 방법

다음 프로토콜은 줄기세포로 구성된 T-세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포의 측면 집단을 성체 제브라피시에서 분리하는 방법을 설명합니다. 측면 모집단에는 눈에 띄는 세포 마커가 없기 때문에 Hoechst 33342 염료 유출 분석을 사용하여 분리합니다.

Side Population Assay: 제브라피시에서 종양 세포의 Side Population을 분리하는 방법

여기에서는 제브라피시 골격근 및 배아 횡문근 육종(ERMS)을 성체 면역 손상 rag2E450fs 동형접합 돌연변이 제브라피쉬에 이식하는 세포 이식 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 근육 세포의 재생 및 악성 변형을 효율적으로 분석할 수 있습니다.

면역이 저하 된 성인 Zebrafish의에 정상 및 악성 근육 세포 이식

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.

Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별 

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

HIV tropism는 바이러스 봉투의 V3 지역에서 유추하실 수 있습니다. V3는 PCR은 RT - PCR 중첩, 합성을 사용하여 세중의에 증폭하고, bioinformatic 소프트웨어를 사용하여 해석됩니다. 낮은 g2P 점수 1 개 이상의 시퀀스 (S)와 함께 샘플이 아닌 R5 바이러스로 분류됩니다.

V3의 HIV - 1 Tropism의 Genotypic 추론 사용 인구를 기반 시퀀싱

손쥐 골수 이식은 인간에 이식 - 대 - 호스트 질병에 관한 면역 메커니즘을 연구 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. T 세포 거래 패턴을 모니터링 할 수있는...

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

학습하세요 제브라피쉬 T-ALL 모델에서 측면 인구 세포를 분리하는 방법을 Danio rerio를 이용하여. 이 기술은 암 줄기세포 활성이 풍부한 세포 집단을 전망적으로 분리하여 백혈병 연구에 활용됩니다.

측면에서 인구의 분리 나 Myc 유도 T 세포 급성 림프 모구 백혈병 제브라 피쉬

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