Name: 마우스 배아 신장의 해부 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 마우스 배아에서 메타네프로스 원기를 분리하고 배양하는 방법을 통해 요관 싹 가지 형태를 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 신장 기관형성 및 선천성 기형 연구에 활용됩니다.

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저자는 Leif Oxburgh와 Derek Adams에게 도움을 주신 Leif Oxburgh와 Stefan Wölfl 및 Ulrike Müller와 Saskia Schmitteckert, Julia Gobbert, Sascha Weyer 및 Viola Mayer에게 도움을 주신 데 대해 감사드립니다. 랩. 이 작품은 개발, 생물 학자의 회사 (CP) 에 의해 지원되었다 .

마우스는 스웨덴의 규정 및 EU 법령 (2010 / 63 / EU)에 따라 유지 관리되었습니다. 모든 절차는 스웨덴 윤리위원회 (C79 / 9, C248 / 11 및 C135 / 14 허가)의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물과 관련된 하이델베르그 대학의 절차는 하이델베르그 대학의 Regierungspräsidium Karlsruhe와 Animal Welfare Officers에 의해 승인되었습니다. 1. 시약 및 시약의 준비 참고 : 오염을 최소화하려면 층류 후드를 사용하십시오. <ol><li> 해부 당일에, 무균 인산 완충 식염수 (PBS) 중의 1 : 5의 몰비로 항 - 인간 Fc 염소 항체와 혼합함으로써 인간 Fc 단독 또는 인간 Fc에 융합 된 재조합 키메라 에프 린 단백질을 사전 - 클러스터링한다. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어 둡니다. 5 . </li><li> Dulbecco &#39;s Modified Eagle Medium : Nutrient를 보충하여 배양 배지를 준비하십시오.1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (v / v), 1 % 글루타민 (v / v), 1 % 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄 (v / v), 50 μg / ml 인간 홀로 코 - 트랜스페린 및 1.5㎍ / mL 암포 테리 신이 포함된다. 참고 : 16 ML 배아의 10 ML 충분합니다. </li><li> 배양액에 최종 농도 20 μg / mL의 클러스터 된 재조합 에프린 용액을 첨가합니다. 클러스터 된 인간 Fc를 대조군으로 사용하십시오. </li><li> 무균, 코팅되지 않은 평평한 바닥 폴리스티렌 4 잘 접시의 각 우물에 문화 매체 500 μL를 추가하여 문화 플레이트를 준비합니다. </li><li> 무균 포셉을 사용하여 신중하게 매체 상단에 구멍 당 5 μm의 기공 크기와 하나의 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터를 놓으십시오. 인큐베이터 (37 ° C / 5 % CO 2 )에 준비 접시를 전송하십시오. 필터가 윗면이 마를 때까지 뜨고 플로트가 발생하는지 확인하십시오. 참고 : 두 개의 신장 혈관에 대해 하나의 필터로 충분합니다. </li><li> 면도날을 사용하여 대략 30 피펫 팁 (볼륨 : 100 μL) approximately 끝에서 1mm가 더 넓게 열립니다. 팁을 다시 피펫 - 팁 랙에 넣으십시오. </li></ol> 2. E11.5에서 Metanephric Rudiments의 해부 <ol><li> 자궁 경부 탈구 (또는 지역 윤리위원회의 승인을받은 방법을 사용)하여 E11.5에서 임신 임신 한 마우스를 희생합니다. </li><li> Brown 외 6 에 설명 된대로 자궁과 배아를 제거합니다. 이 시점에서 해부 현미경으로 작업하십시오. </li><li> 5 번 시계 제조기 겸자를 사용하여 앞다리 바로 아래에서 배아를 잘라냅니다. 각 배아에 신선한 페트리 접시를 사용하십시오. 배아의 꼬리와 다리를 제거하십시오. 이렇게하려면 5 번 시계 제조기 집게 한 쌍으로 제거 할 조직을 잡고 두 번째 쌍의 끝을 사용하여 자릅니다. </li><li> 복부 기관의 질량을 제거하려면, 꼬리의 주둥이 방향으로 배아의 몸 벽을 옆으로 열려면 한 쌍의 포셉의 팁을 사용하십시오. <ol><li> 외형 적으로 절단, t와 평행하게그는 지느러미 대동맥. 오리 엔테이션을 위해 혈액으로 채워지기 때문에 눈에 보이는 대동맥을 사용하십시오. 조심스럽게 폐쇄 포셉의 팁을 사용하여 등쪽 부분에서 신체 벽의 복부 부분을 분리하고 배아를 뒤집습니다. 앞면과 마찬가지로 몸통 벽을 옆으로 대동맥 - 꼬리 방향으로 절단하고 배부 대동맥을 사용하여 방향을 잡습니다. </li></ol></li><li> 복부 몸의 벽이 지느러미 몸체에서 분리되면, 한 쌍의 포셉으로 잡아서 신중하게 잡아 당겨 기관 덩어리와 함께 제거하십시오. 참고 : metanephric anlagen은 일반적으로 등쪽 몸 벽에 붙어있어. 그들은 타원형이며, 뒷다리 수준에 위치한 ~ 200 μm 길이의 구조물입니다. </li><li> 복부 쪽이 위로 향하게 한 쌍의 포 셉를 사용하여 등쪽 몸통 벽을 지킨다. 포셉의 다른 한 켤레를 사용하여, 그것의 주둥이 끝에서 등쪽 대동맥을 잡고 조심스럽게 몸의 벽에서 등 대동맥을 껍질. 참고 : 두 metanephric 신장은 일반적으로 붙어있어등 대동맥에 붙어있다. </li><li> 한 쌍의 포셉을 사용하여 신장 anlagen에 rostrally 잘라 대동맥을 제거하십시오. 그런 다음 신중하게 포 셉의 팁을 사용하여 두 신장 anlagen 분리하십시오. </li><li> 조심스럽게 포셉의 팁을 사용하여 신장 anlagen에서 원치 않는 조직을 껍질. mesenchyme을 손상시키지 않도록주의하십시오. 손상은 추가 분석에서 explant의 성장 및 배제를 초래할 수 있습니다. </li><li> 4 잘 접시에 폴리 카보 네이트 멤브레인 필터에 PBS 10 μL에 microliter 피펫과 와이드 오픈 피펫 팁을 사용하여 신장 anlagen을 별도로 전송합니다. 참고 : 표면 장력으로 인해 체외 이식편은 얇은 매질로 덮여 있습니다. 하나의 필터로 두 개의 신장 혈관이 충분합니다. <ol><li> 두 개의 신장 anlagen 각 필터의 ​​각 절반의 중심에 놓습니다. 37 ° C / 5 % CO 2 에서 배양기로 플레이트를 다시 옮긴다. metanephric rud 때까지 인큐베이터에 접시를 남겨주세요다음 배아에서 iments은 필터에 배치 할 준비가되었습니다. </li></ol></li><li> 각 배아에 대해 2.3-2.9.1 단계를 반복합니다. 참고 : 일부 연습으로 해부 절차는 배아당 약 5 분 걸립니다. </li><li> 37 ° C / 5 % CO 2 에서 3 일 동안 신장 anlagen을 품어. </li></ol> 3. 고정 및 염색을위한 시약의 준비 <ol><li> 칼슘과 마그네슘 (w / v)이없는 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 준비하려면 PFA를 60 ℃에서 PBS에 녹여서 지속적으로 저어줍니다. 실온으로 식힌 다음 페이퍼 필터를 사용하여 남아있는 입자를 제거합니다. 분주하고 4 ° C에서 보관하여 즉시 사용하거나 장기간 보관할 수 있습니다. 주의 : PFA는 유독합니다. 지역 안전 표준에 명시된 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 작업하십시오. 시설 지침에 따라 지정된 폐기물 용기를 사용하여 폐기물을 버립니다. </li><li> permeabilization solution을 준비하기 위해 희석 된 Triton X-1000.3 % (v / v)가되도록 칼슘과 마그네슘이없는 PBS에서 처리 하였다. </li><li> 차단 용액을 준비하기 위해 5 % (v / v) 염소 혈청과 0.1 % Triton X-100을 칼슘과 마그네슘없이 PBS에 첨가한다. 나트륨 아자 이드를 0.02 % (w / v)의 최종 농도로 첨가한다. 4 ° C에서 보관하십시오. 주의 : 나트륨 아자 이드는 독성이 있습니다. 지역 안전 및 환경 보호 규정에 따라 나트륨 아자 이드를 취급하십시오. 참고 : 염색을 위해 항체를 사용하는 경우 2 차 항체가 유도 된 종에서 5 % 혈청을 사용하여 차단 용액을 만듭니다. </li><li> biotinylated Dolichorus biflorus agglutinin을 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석한다. Alexa488 - conjugated streptavidin을 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석하십시오. </li><li> 즉시 사용할 수있는 배지 (물질 표 참조)를 만들기 위해 0.1M Tris-HCl (pH 8.5)에 녹인 25 % (w / v) 글리세롤에 0.1g의 수용성 폴리 비닐 알코올 계 점착제 / mL를 넣는다. . 연속 교반하에 50 ° C로 1 시간 가열하고 식힌 다음 1을 사용하여 pH를 8.0-8.5로 조정한다.M NaOH. NaOH 농도를 높이 지 마십시오. 0.02 % (w / v)의 최종 농도로 100 μg / mL의 N- 프로필 게 네이트와 티 메로 살을 첨가한다. 실온에서 30 분 동안 교반한다. 주의 : Thimerosal은 독성이 있습니다. 해당 지역의 안전 및 환경 보호 규정에 따라 취급하십시오. <ol><li> 50 ML 튜브에 삽입 매체를 채우고, 로터를 균형을, 그리고 3,200 XG 및 10 분 실온에서 원심 분리기. 15 mL 튜브에 투명한 용액을 따라 내고 펠렛을 버린다. 분주하고 -20 ℃에서 몇 주 동안 보관하십시오. 해동되면 용액을 4 ° C에 유지한다. 사용 직전 ~ 30 ° C로 예열하십시오. </li></ol></li><li> explants와 필터가 장착 될만큼 많은 유리 슬라이드를 준비합니다. 이를 위해 인스턴트 접착제를 사용하여 유리 슬라이드 양쪽에 18 x 18 mm 크기의 작은 커버 슬립 2 개를 붙이고 필터 사이에 15 mm의 공간을 남겨 둡니다. </li></ol> 4. 고정 및 염색 <ol><li> 배양 기간 3배양기에서 플레이트를 제거하고 조심스럽게 micropipette를 사용하여 각 우물에서 문화 매체를 대기음. 필터를 만지지 말고 팁 입구를 우물 벽쪽으로 유지하십시오. </li><li> 각 우물에 4 % PFA / PBS 500 μL를 추가합니다. 필터는 정착액 위에 뜨게됩니다. 마이크로 피펫을 사용하여 PFA 고정액을 조심스럽게 첨가하여 필터를 잠수시킵니다. 실온에서 30 분 동안 품어 낸다. 참고 : 다음 단계를 수행 할 때 필터에서 외과 체를 씻어 내지 않도록주의해야합니다. 우물 벽을 향한 피펫 팁의 개방을 유지하십시오. </li><li> PFA를 제거하고 500 μL의 PBS로 두 번 헹구십시오. 각 우물에 permeabilization 솔루션 500 μL를 추가하고 1 시간 동안 실온에서 품어. </li><li> PBS 500 μL로 두 번 씻어서 각 잘 차단 솔루션의 500 μL를 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션한다. </li><li> 차단 용액을250 μL의 biotinylated Dolichorus biflorus agglutinin은 1 : 200으로 블로킹 용액으로 희석하고 4 ° C에서 24 시간 동안 배양한다. </li><li> Dolichorus biflorus agglutinin 솔루션을 제거하고 잘 PBS 당 500μL로 씻어. </li><li> Alexa488 - conjugated streptavidin 250 μL를 1 : 200 희석 용액에 첨가하고 4 ° C에서 24 시간 동안 배양하십시오. 또는 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오. 참고 : 4 ° C에서 배양하면 더 나은 신호 대 잡음비가 달성됩니다. </li><li> 1 웰당 PBS 500 μL로 두 번 씻어. 집게를 사용하여 explants이 위로 향하게 준비 슬라이드에 필터를 전송합니다. 임베딩 매체 ~ 50-100 μL로 탑재하십시오. 60mm 길이의 1.5 번 커버 슬립으로 덮으십시오. 매질 용액을 실온에서 2 시간 동안 응고시킨다. 이미지 준비가 끝날 때까지 4 ° C에서 포일로 싸인 슬라이드를 이미지화하거나 보관하십시오. </li><li> 와이드 필드 epifluorescence 현미경 7 &lt;/ sup&gt;를 Hg- 램프에 연결하고 청색 여기 (여기 대역 통과, 460 - 495 nm, 이색 거울, 505 nm, 방출 대역, 510 - 550 nm) 및 20X Plan-Apochromat 렌즈 용 거울 장치를 사용하여 0.75 구멍. </li></ol>

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이 원고는 마우스 배아에서 발생하는 metanephric anlagen을 분리하고 장기 기초를 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 Grobstein 8 과 Saxén 9 , 10 에 의해 개발 된 표준 기법이며 많은 다른 사람들에 의해 수정되고 수정되었습니다 11 , 12 . 이 방법의 성공은 주로 절개의 지속 기간과 장기간의 절개 시간에 따른 생식 외 생존 및 유도 잠재력 감소에 달려 있습니다. 주변 조직으로부터 신장 조직을 제거 할 때 간 조직을 손상시키지 않도록주의해야합니다. metanephric mesenchyme의 손상은 종종 explants의 가난한 성장을위한 이유입니다. 그러나 절개 속도와 미세 운동 능력은 연습으로 크게 향상됩니다. <p class="j...

포유류 신장은 중배엽 기원을 가진 두 가지 원시 구조, 즉 관상 상피 요관 새싹과 중신성 중간엽에서 파생됩니다. 신형성(nephrogenesis) 동안, 요관 새싹은 메타네프릭 중간엽(metanephric mesenchyme)과 가지(branchesenchyme)에 침입하여 수집 시스템을 형성합니다. metanephric mesenchyme은 네프론의 상피 요소를 발생시킵니다. 이러한 과정은 정확한 시간과 공간적으로 조정된 방식으로 발생하며 상호 귀납 메커니즘에 의해 시작됩니다. 두 조직 구성 요소는 서로 소통하고 다른 조직의 형태 형성에 영향을 미칩니다. 
1920년대에 닭에서 중신관의 생체 내 폐쇄를 수행한 사람은 Boyden이었고, 분리된 신모세포가 구별되지 않음에 따라 유도 상호 작용의 첫 번째 징후를 제공했습니다1. 거의 동시에, 매달린 방울에서 닭 네프 기초를 배양하려는 최초의 성공적인 시도가 발표되었습니다. 그 후, 장기 배양은 포유류의 장기 형성에서 조직 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었습니다. 1950년대에 Grobstein은 필터에서 metanephric 기초를 배양할 수 있는 기술을 개발했습니다. 이 기술은 Saxén에 의해 수정되었으며, Saxén은 배양 접시1의 Trowell 유형 화면에 필터를 배치했습니다. 수년에 걸쳐 장기 배양에 대한 많은 수정과 응용이 등장했습니다. 여기에 설명된 방법은 Saxén의 기술을 기반으로 하지만 필터가 매체에서 자유롭게 떠다니고 배양물의 직경이 필터의 직경을 약간 초과하여 필터의 원치 않는 움직임을 제한하기 때문에 단순화되었습니다.
전체 장기 배양은 기관 생성 중 세포 과정과 세포 간 통신을 조사하기 위한 고전적이고 저렴하며 간단하지만 강력한 도구입니다. 장기 배양은 성장 인자, 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 바이러스 및 펩타이드와 같은 생물학적 제제뿐만 아니라 제약 화합물 및 기타 화학 물질로 치료할 수 있습니다. 또한 유전자 변형 마우스에서 유래한 외식(explant)을 사용하거나 Cre-loxP 시스템과 같은 유도성 유전자 불활성화 기술을 사용하여 유전자 기능을 연구할 수 있습니다. 이를 통해 신장이 발달하기 전에 배아의 치사율을 유발하는 유전적 돌연변이를 연구할 수 있습니다. 장기 배양은 또한 유전자 기능 또는 계통 추적을 위한 형광 태깅 및 세포 행동의 실시간 모니터링을 가능하게 하는 최신 이미징 기술과 결합할 수 있습니다2.
여기에 제공된 특정 예에서, 요관 싹의 분기 형태에 대한 EphrinB2 활성화 Eph-수용체 신호전달의 효과를 조사했습니다. EphA4/EphB2 이중 녹아웃 마우스의 형태는 신장 발달에 몇 가지 심각한 결함을 시사했으며, 이는 배아 11일째(E11)부터 감지할 수 있었고 요관 싹, 요관 및 총신관3과 관련이 있습니다. Eph 수용체를 통한 신호전달은 리간드-수용체 dimer4의 클러스터링을 필요로 합니다. Eph 신호전달을 과도하게 활성화하기 위해 E11.5 마우스 배아의 신장 기초를 군집된 재조합 EphrinB2-Fc의 존재 하에서 배양했습니다. EphrinB2는 EphA4 수용체에 대한 알려진 리간드이며, 이는 요관 새싹 tips3에서 발현됩니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 칼슘, 마그네슘</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040117</td> 홀로-트랜스페린 인간 <td>해부에 사용</td></tr><tr><td></td><td>시그마-알드리치</td><td>T0665</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS -G) (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400045</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>암포테리신 B 용액</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>아지드나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>티메로살</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5125</td><td></td></tr><tr><td>프로필 갈레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>모위올 4-88</td><td>시그마-알드리치</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 돌리코루스 비플로루스 아글루티닌</td><td>벡터 연구소</td><td>B-1035</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 접합 스트렙타비딘</td><td>잭슨 면역 연구</td><td>016-540-084</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 에프린-B2 Fc 키메라 단백질, CF</td><td>R& D 시스템</td><td>496-EB</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IgG1 Fc, CF</td><td>R& D Systems</td><td>110-HG-100</td><td></td></tr><tr><td>염소 항인간 IgG Fc 항체</td><td>R& D Systems</td><td>G-102-C</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>고정 및 면역 염색에 사용</td></tr><tr><td>Dumont #5, biologie 팁, INOX, 11cm</td><td>agnthos.se</td><td>0208-5-PS</td><td>집게 2쌍 필요</td></tr><tr><td>아이리스 가위, 스트레이트, 12cm</td><td>agnthos.se</td><td>03-320-120</td><td></td></tr><tr><td>드레싱 집게, 스트레이트, 섬세함, 13cm</td><td>agnthos.se</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 Nunclo Delta 처리</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150679</td><td></td></tr><tr><td>TMTP01300 Isopore Membrane Filter, 폴리카보네이트, 친수성, 5.0 &micro; m, 13mm, 흰색, 일반</td><td>MerckMillipore</td><td>TMTP01300</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes 4 wells, 평평한 바닥</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789-1CS</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 24 x 50mm 두께. No.1.5H 0.17+/-0.005mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>107222</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경No.1.5, 18mm x 18mm</td><td>nordicbiolabs</td><td>102032</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 ~76 x 26 x 1, 1/2-w. 지상 일반</td><td>nordicbiolabs</td><td>1030418</td><td></td></tr><tr><td>VWR 면도날</td><td>VWR</td><td>55411-055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430828</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 사전 주름 품질 여과지, 등급 113V, 크레이프</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1213125</td><td></td></tr><tr><td>고정 무대 연구 mircoscope</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 근친 마우스, 수컷, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-M</td><td></td></tr><tr><td>Black 6 근친 마우스, 암컷, C57BL/6NTac</td><td>Taconic</td><td>B6-F</td><td></td></tr><tr><td>Greenough 스테레오 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica S6 E</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

이 프로토콜의 목표는 마우스 metanephric 기초의 해부, 격리 및 문화에 대한 방법을 설명하는 것입니다. 포유류 신장이 발달하는 동안 두 개의 전구 세포 조직, 즉 ureteric bud와 metanephric mesenchyme은 세포 기작을 전달하고 상호 작용하여 결국 포집 시스템과 신장의 네프론을 형성합니다. 포유류 배아가 자궁 내에서 자라며 관찰자가 접근하기 어렵 기 때문에 장기 배양이 개발되었습니다. 이 방법을 사용하면 신장 조직 형성 과정에서 상피 간엽 상호 작용과 세포 행동을 연구 할 수 있습니다. 또한 선천성 신장 및 비뇨 생식기 기형의 기원을 조사 할 수 있습니다. 조심스럽게 해부 된 후, metanephric 기초 물질은 배양 배지에 떠있는 필터로 옮겨져 며칠 동안 세포 배양기에 보관 될 수 있습니다. 그러나 조건은 다음과 같습니다.인공이며 조직의 신진 대사에 영향을 줄 수 있습니다. 또한, 시험 물질의 침투는 체외 이식편에 존재하는 세포 외 기질 및 기저막으로 인해 제한 될 수있다. 기관 문화의 한 주요 이점은 실험자가 기관에 직접 접근 할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 저렴하고 간단하며 생물학적 활성 물질의 첨가, 유전 변이의 연구, 진보 된 영상 기술의 적용과 같은 많은 수정을 가능하게합니다.

Metanephric kidn anlagen은 E11.5에서 임신 한 Black-6 근친 교배 마우스에서 추출하여 배양 하였다. 3 일 후, ureteric bud는 5 번까지 분지되었고, 그 결과 초기 T 자 형태의 ureteric bud가 분출되었다. 각 체외 이식편을 촬영하고 분지 생성량을 결정하고 분지 당 종말점 수를 계산하기 위해 분절 수와 종점을 정량화했습니다 ( 그림 1 ). ImageJ ( 제 4 세대), 제 4 세대는 처리 된 체외 이식편의 단 8 %에서만 달성되었으며, 대조 체외 이식편의 35 %와 비교하여 ( 그림 1b ), 따라서 분기 당 종점 및 ㎟ 당 종점은 또한 EphrinB2가 제한된 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다 ( 그림 1 ).ureteric bud branching 과정에서 EphA4와 EphB2의 순방향 신호 전달을 활성...

이 프로토콜은 마우스 배아에서 metanephric의 기초를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다.

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

본 절차의 전반적인 목적은 생쥐 배아로부터 중신신 rudiments(metanephric rudiments)를 분리 및 배양하고, 특정 처리가 요관아(ureteric bud)의 분지 형태학에 미치는 영향을 관찰하는 것입니다. 이 방법은 신장 기관 형성 과정에서 세뇨관 분지 형태 형성의 제어, 상피-간엽 상호작용, 그리고 선천적 기형의 기원에 관한 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 장기에 직접적으로 접근할 수 있으며, 방법이 간단하고 비용이 저렴하며 쉽게 수정 가능하다는 점입니다.해부를 시작하기 전, 멸균 집게를 사용하여 500 µL의 신선한 배지가 들어 있는 4-웰 플레이트의 각 웰에 공극 크기가 5 µm인 폴리카보네이트 멤브레인 필터를 조심스럽게 배치합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮깁니다. 그런 다음 면도날을 사용하여 100 µL 마이크로피펫 팁 약 30개의 끝부분에서 약 1 mm 지점을 절단하여 팁 입구를 넓힌 뒤, 팁을 피펫 팁 랙에 다시 넣습니다.팁 준비가 완료되면, 해부 현미경 하에서 배아 11.5일을 PBS에 넣습니다. 각 배아마다 새 디쉬를 사용하십시오. 그리고 5번 시계공 핀셋을 사용하여 앞다리 바로 아래쪽의 배아를 절단합니다.다음으로, 한 쌍의 포셉으로 다리를 잡고 다른 포셉을 사용하여 다리 조직을 제거합니다. 동일한 방식으로 꼬리를 제거하고, 포셉 끝을 사용하여 배아의 체벽을 등쪽 대동맥과 평행하게 주둥이 쪽(rostral)과 꼬리 쪽(caudal) 방향으로 외측 및 표면에서 엽니다. 표면적으로 절개하여 등쪽 대동맥을 따라 절개선을 만들고, 닫힌 포셉의 끝을 사용하여 체벽의 복측 부분을 배측 체벽으로부터 조심스럽게 분리합니다.배아를 뒤집고, 방금 시연한 것처럼 등쪽 대동맥을 기준으로 방향을 잡아 몸벽의 측면을 머리 쪽에서 꼬리 쪽 방향으로 절개합니다. 배 쪽 몸벽이 등 쪽 몸체와 분리되면, 핀셋으로 배 쪽 몸벽을 잡고 조심스럽게 당겨 몸벽과 배 쪽 장기 덩어리를 제거합니다. 배 쪽이 위를 향하도록 한쪽 핀셋으로 등 쪽 몸벽을 잡고, 다른 핀셋으로 등쪽 대동맥의 머리 쪽 끝을 잡아 등쪽 대동맥을 등 쪽 몸벽에서 조심스럽게 벗겨냅니다.포셉 하나를 사용하여 대동맥을 제거하기 위해 신장 원기(kidney anlagen)의 머리 쪽을 절단합니다. 그리고 포셉 끝을 이용하여 두 원기를 조심스럽게 분리합니다. 포셉 끝을 사용하여 신장 원기에서

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 보고서에서 우리는 개발 신장의 줄기 / 전구 세포를 조절 신호 경로를 연구하는 데 사용할 수있는 배아 마우스 신장에서 전구 세포의 틈새의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 이러한 교양 세포가 작은 분자 및 재조합 단백질 치료에 매우 접근하고 있으며, 또한 중요한 후보 경로의 효율적인 조작을 허용 바이러스 전달에.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

산모 신진 대사를 무시 neurulation 동안 마우스 배아의 직접적인 약리 조작에 대한 허용하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 시점과 약리 에이전트를 변화하여 neurulation의 다양한 측면을 연구하기 위해 적용할 수 있습니다.

마우스 배아 전체 문화 신경 튜브 폐쇄

이 비디오는 쥐의 신장에서 온전한 사구체를 분리하는 방법을 설명합니다. 이렇게 얻어진 캡슐화 및 캡슐화되지 않은 사구체는 쥐 신장에서 두정엽 상피 세포 파생물을 배양하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

사구체 분리: 쥐 신장에서 온전한 사구체를 얻는 기술

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

우리는 마우스 Wolffian 덕트 (WD)의 분리 및 배양 방법을 제시한다. 우리는 또한 형광 태그 항체 배양 / 갓 격리 WDS의 전체 마운트 면역 염색에 대한 자세한 절차를 보여줍니다. 함께, 이러한 기술은 WD의 개발, 코일 링, 및 분화에 대한 연구를 할 수 있습니다.

오르간 문화와 마우스 Wolffian 덕트의 전체 마운트 면역 형광 염색법

신장 구조 조직 설계 기관 부족 및 투 석의 해로운 효과 위한 솔루션을 제공합니다. 여기, 우리는 마이크로 프로토콜 설명 cortico 골 수 세그먼트의 격리 murine 신장 해 부. 이 세그먼트는 신장 organoids를 형성 세포 비 계 없는 구문으로 이식.

서 주 신장 조직 세그먼트와 소설 비 계 없는 건설 기술 관

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

이 문서는 마우스 신장에서 분리된 캡슐화된 사구체 사구류의 구체 정수리 세포 성장을 배양하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 정수리 상피 세포 증식 및 마이그레이션에 관여하는 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

정수리 상피 세포 활성화에 관여하는 통로를 분석하는 전 비보 분석으로 구체 아웃스승

이 작품은 장기 발달을 연구하기위한 두 가지 방법, 배양 배아 장기 및 오르가노이드의 혈관 을 허용하는 조류 배아에서 융모난성 막 (CAM)에 개선 된 이종이식 설정및 새로운 고정 z 방향을 설명합니다. 고해상도 시간 경과 공초점 이미징을 허용하는 수정 된 실험 조건을 가진 장기 배양 방법.

혈관 을 위한 신장 오르가노이드 및 Organotypic 문화의 최적화, 확장된 발달 및 향상한 현미경 검사법 화상 진찰

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

배우세요 마우스 배아에서 메타네프로스 원기를 분리하고 배양하는 방법을 통해 요관 싹 가지 형태를 관찰하는 기술입니다. 이 방법은 신장 기관형성 및 선천성 기형 연구에 활용됩니다.

마우스 배아 신장의 해부 및 배양

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